Makrofagudtømning reducerer sygdomspatologi i faktor H-afhængig immunkompleks-medieret glomerulonefritis

KomplementfaktorH (FH) er en nøgleregulator for den alternative komplementvej hos mennesker og mus. Tidligere afslørede vores undersøgelser, at fraværet af FH forårsager, at C57BL6-musen bliver modtagelig forkronisk serum sygdom(CSS) sammen med en stigning inyre indfiltration af makrofagersammenlignet med kontroller. For at forstå, om den øgede rekruttering af makrofager (Mϕs) til nyren kørte indFlammations- og spredningsskade undersøgte vi f.eksffect af Mϕ udtømning med clodronat i FH knockout-mus med CSS. Otte uger gamle FHKO-mus blev behandlet med apoferritin (4 mg/mus) i 5 uger og med enten vehikel (PBS) eller clodronat (50 mg/kg ip, 3 gange/uge i de sidste 3 uger). Administrationen afclodronat nedsatte monocytter og Mϕs i nyrerneved>80%. 

Nyrefunktionvurderet ved BUN og albumin forblev tættere på det normale ved udtømning af Mϕs. Clodronatbehandling forhindrede ændringen i cytokiner, TNF og IL-6 og stigning i genekspression af bindevævsvækstfaktor (CTGF), TGF -1, matrixmetalloproteinase-9 (MMP9),fibronectin, laminin og kollagen i FHKO-mus med CSS (P < 0:05). Clodronatbehandling førte til relativ beskyttelse modimmunkompleks- (IC-) medieret sygdomspatologi under CSS som vurderet afsignifistærkt reduceret glomerulær patologi(GN) og ekstracellulær matrix. Vores resultater tyder på, at komplementaktivering er en af ​​de mekanismer, der regulerer makrofaglandskabet og dermedfibrose. Den nøjagtige mekanisme mangler at blive dechiffreret. Kort fortalt viser vores data, at Mϕs spiller en kritisk rolle i FH-afhængige ICGN og Mϕ udtømningreducerer sygdomsprogression.

KLIK HER FOR AT FÅ NATURLIGE ØKOLOGISKE CISTANCHE EKSTRAKT MED 25% ECHINACOSIDE OG 9% ACTEOSIDE TIL NYREFUNKTION

1. Introduktion

Kronisk nyresygdom(CKD) er et globalt sundhedsproblem; 10% af dem er immunkompleks- (IC-) medieret og forekommer ved serumsyge, infektioner og autoimmune sygdomme. [1]. Det fremgår af USA Renal Data Systems årsrapportpersoner med CKD"har tydeligvis en høj risiko for død" med en 10-dobbelt øget forekomst over tre årtier, hvor berørte patienter mistede 70 % af deres levetid. Ifølge NIDDK er cirka 14 % af den voksne befolkning blevet diagnosticeret med nyresygdom, hvilket gør det til den 9. hyppigste dødsårsag [2]. Nyren er meget modtagelig for komplementmedieret skade, især i autoimmune og inflammatoriske omgivelser [3, 4].

Komplementsystemet deltager i medfødte og adaptive immunresponser og giver en første forsvarslinje mod mikroorganismer [5, 6]. Den består af tre aktiveringsveje, som initieres på unikke måder og består af mere end 30 plasma- og celleassocierede proteiner [7]. Den alternative vej er konstant på vagt og reguleres af proteiner såsom komplementfaktor H (FH). FH er et cirkulerende protein, der for det meste syntetiseres af leveren [8]. FH-deficiente (fh-/-) mus behandlet med apoferritin udvikler kronisk serumsyge (CSS), der fører til diffus proliferativ glomerulonefritis (GN) inden for 5 ugers behandling, mens kuldkammerat C57BL/6 mus, der er tilstrækkelig faktor H (FH), har lidt glomerulær inflammation [9]. F4/80+ makrofaginfiltration forekommer i nyrerne og observeres omkring IC-aflejringer i fh-/- musene. Komplementaktivering genererer anafylatoksiner, C3a og C5a, der deltager i handelen med Mϕs til inflammationsstedet. Hæmning af C5a/C5aR1-signalering reducerede Mϕs i nyren [10]. I denne indstilling,nyreskadeer forbundet med nyreinfiltration, men de mekanismer, der kan være involveret i at forårsagenyreskadeforblive ukendt.

Figur 1: FH ændrer makrofagmarkørgener i nyrerne hos mus med FH-afhængig ICGN. Kvantitativ realtids-PCR for CD204 og CD206 ved hjælp af mRNA isoleret fra nyrerne efter 5 ugers saltvand eller apoferritin. Udtrykket er normaliseret til GAPDH (n=6/gruppe). ∗P < 0:01. Grafer viser foldændringen af ​​gener i apoferritin-behandlede fh-/- mus (n=6) sammenlignet med fh-/- mus behandlet med saltvand (n=6).

Monocytter (Mo) genereret af hæmatopoietiske celler [11] migrerer gennem endotelet ind i vævene, hvor de differentieres til Mϕs. Markører såsom F4/80-, CD11b-, CD68- og Fc-receptorer kan identificere Mϕ'erne. Mϕs er kritisk involveret i nyreskade, reparation og fibrose i forskellige eksperimentelle modeller for nyresygdom [12, 13]. For nylig viste vores undersøgelser, at nyreskade i FH-afhængig ICGN er forbundet med nyreinfiltration af Mϕs. Desuden har tidligere undersøgelser vist, at inhibering af renal Mϕ-infiltration reducerer arterielt tryk og forhindrer glomerulær skade og fibrose i forskellige dyremodeller af nefropati [14, 15]. Så vidt vi ved, er virkningen af ​​Mϕ-depletering under nyreskade forbundet med FH-afhængig ICGN imidlertid ikke blevet behandlet. Derfor undersøgte nærværende undersøgelse rollen af ​​Mϕs på nyreskaden forbundet med FH-afhængig ICGN ved hjælp af liposom clodro nate. Clodronat (clodronsyre) er et bisphosphonat, der metaboliseres til en ikke-hydrolyserbar ATP-analog [16]. Vores eksperimenter viser, at Mϕs spiller en nøglerolle i tabet af nyrefunktion i en situation med ureguleret komplementaktivering. Derfor kan reduktion af Mϕs eller instruere Mϕs om at antage en reparationsfænotype reducere sygdomspatologi og kan udnyttes terapeutisk.

2. Materialer og metoder

2.1. Forsøgsdyr.

fh−/− musestammen blev genereret og venligt leveret af Dr. Matthew Pickering og Marina Botto (Imperial College of London) og krydsede kontinuerligt tilbage til C57BL/6-stammen i vores laboratorium i over 10 generationer. Kuldfæstede FH-tilstrækkelige mus tjente som kontroller (n=8/gruppe). Genotyping blev udført ved hjælp af PCR-baserede metoder. Mus blev holdt ved en temperatur på 20-22 grader C i 12 timers lys-12 timers mørk belysningscyklus i sterile, ventilerede bure med mad og vand ad lib. University of Chicago og University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee godkendte alle undersøgelser.

2.2. Kronisk serumsyge protokol.

CSS blev induceret i 6-8 ugers fH−/− eller vildtype mus med daglig intraperitoneal administration af 4 mg hestemilt apoferritin (Calzyme Laboratories) uden adjuvans [10, 17, 18] i 5 uger. Kuldkammerater modtog intraperitoneale injektioner af saltvandsbærer samtidigt

2.3. Nyrefunktionsvurderinger.

Blodurea-nitrogenkoncentrationer (BUN) blev bestemt med en Beckman Autoanalyzer (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Urinalbuminkoncentrationer blev målt med et musealbumin ELISA-kit (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) og normaliseret til urinkreatinin målt kolorimetrisk (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) som tidligere beskrevet [19].

Figur 2: Clodronat reducerer i stigende grad nyremakrofager hos mus med FH-afhængig ICGN. Givet er flowcytometriprofilerne for F4/80+ monocytter/Mϕs på dag 0, 2, 4 og 7, repræsentativt. Ekspressionen af ​​F4/80+-celler blev bestemt ved flowcytometri. Data blev analyseret ved hjælp af FlowJo V10-software. F4/80+-celler reduceres markant på hvert tidspunkt og når mindre end 10 % på dag 7. Hvert tidspunkt n=6.

2.4. Histologi.

Nyrerne blev indlejret i paraffin og til malinfikserede, og fire-mikrometer sektioner blev genereret. Snittene blev farvet med Periodic Acid-Schiff og undersøgt af en nyrepatolog (AC) på en blind måde. For hvert objektglas blev proliferativ glomerulonefritis og glomerulo-sklerose graderet fra 0 til 4 som beskrevet tidligere [20]. Til immunfluorescensmikroskopi blev nyrevævet lynfrosset i 2-methylbutan forkølet i tøris. Fire-mikron kryostatsektioner blev behandlet til immunfluorescens (IF) farvning. Sektioner blev fikseret i 4 % paraformaldehyd og farvet med Alexa488-konjugeret anti-mus C3 (Cappel) og Alexa 555 anti-mus IgG. En semi-kvantitativ score af farvningsintensitet og fordeling fra 0 til 4 blev tilvejebragt på en blind måde som beskrevet tidligere [19].

2.5. QRT-PCR.

Nyrerne blev høstet, og totalt RNA blev ekstraheret fra vævene under anvendelse af TRIzol-reagens ifølge producentens instruktioner (Invitrogen, USA). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen). qRT-PCR blev udført ved hjælp af Power SYBR Green PCR Master mix på ABI 7700 sekvensdetektoren (Applied Biosystems). PCR-amplifikation blev udført i et samlet volumen på 25 µl indeholdende 12,5 µl 2x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 6,25 µl nukleasefrit vand, 5 µl cDNA og 1,25 µl af de passende primere (IDT). Alle qPCR-primere (tabel 1) blev designet ved hjælp af Primer3-softwaren (Whitehead Institute for Biomedical Research) for at sikre specificitet og sensitivitet. For at kvantificere niveauerne af mRNA normaliserede vi ekspressionen af ​​målgenerne til glyceraldehyd-3--phosphatdehydrogenase. Relative mRNA-ekspressionsniveauer blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCt-metoden og blev normaliseret til ekspressionsniveauerne for GAPDH.

2.6. Statistikker.

Alle resultater er middelværdi ± SD fra mindst {{0}} mus i hver gruppe. Enten en uparret tosidet test (data med normalfordeling) eller Mann-Whitney U-testen (data uden normalfordeling) blev brugt til at sammenligne 2 grupper med GraphPad Prism 5.0. Den statistiske signifikans er udtrykt som følger: ∗P < 0:05; ∗∗P < 0:01; og ns: ikke signifikant.

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportør i Kina:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Shop for flere specifikationer detaljer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop