I silico-baserede skærmsynergistiske lægemiddelkombinationer fra urtemedicin: et tilfælde, der bruger Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Neurobeskyttelsesmodul

Neurobeskyttelse er de mekanismer og strategier, der bruges til at beskytte mod neuronal skade eller degeneration i CNS efter akutte lidelser (f.eks. slagtilfælde eller nervesystemskade/traume) eller som følge af kroniske neurodegenerative sygdomme (f.eks. Parkinsons, Alzheimers, multipel sklerose). Målet med neurobeskyttelse er at begrænse neuronal dysfunktion/død efter CNS-skade og forsøge at opretholde den højeste

mulig integritet af cellulære interaktioner i hjernen, hvilket resulterer i en uforstyrret neural funktion. Som det kan ses af fig. 4, er nogle mål på den serotonerge synapsevej involveret i neurobeskyttelsens funktion. For eksempel er produktionen af ​​prostaglandiner gennem PTGS1 og PTGS2 (også kendt som COX-1 og COX-2) en vigtig mediator til at fremkalde anti-inflammatoriske og nye pro-opløsningsmekanismer56. En nylig undersøgelse har vist, at genekspression af ADCY5, et enzym, der katalyserer dannelsen af ​​cAMP57, reduceres af promotormethylering i COX{10}}inducerede humane HCC-cellelinjer58. Baseret på ovenstående analyse spekulerer vi i, at COX-2-akkumulering kan påvirke sekretionen af ​​sAPP, spaltningen af ​​APP spaltet af -sekretase, der moduleres af cAMP og yderligere udøver den neurobeskyttende effekt59,60. Vores resultater viser, at neurobeskyttelse spiller en vigtig rolle i behandlingen af ​​neuroinflammation.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FOREBYGGELSE AF PARKINSONS SYGDOM FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentel validering

Levedygtigheden af ​​BV2 Microglia-celler behandlet af forbindelserne

BV2 mikrogliaceller (8×104 celler/ml) fodres med koncentrationer på 37,5 til 300 μM pr. milliliter dyrkningsmedier uden serum af de fire forbindelser i 24 timer. Vi betragter cellelevedygtigheden af ​​kontrolgruppen dyrket i fravær af serum med mindre end 0,1 % DMSO som 100 % (fig. 5(a–d)). Der observeres ingen signifikant cellulær cytotoksicitet ved de foreskrevne doser af grupperne.

Validering af lægemiddelsynergi og potentiel anti-inflammatorisk effekt in vitro

For yderligere at vurdere de opnåede resultater i silico er fire forbindelser, der dækker tre synergistiske par, nemlig isoacteosid, 2'-acetylacteosid, echinacosid og verbascosid, udvalgt til at undersøge deres lægemiddelsynergistiske virkninger og potentielle antiinflammatoriske virkning ved hjælp af BV2-celler behandlet med LPS. Især udfører vi western blot-analyse for iNOS- og COX-2-proteinekspression for at bekræfte synergien og de antiinflammatoriske virkninger af de forudsagte lægemiddelkombinationer.

Som vist i fig. 5(e–g) rapporteres niveauerne af iNOS- og COX-2-proteiner i panelet af testede BV2-cellelinjer. Vi observerer, at i enten isoacteosid- eller 2'-acetylacteosid-behandling faldt proteinudtrykket af iNOS og COX -2 i BV2-celler begge signifikant ved forskellige dosisniveauer. Imidlertid inducerer behandling med kombinationen af ​​isoacteosid og 2'-acetylacteosid en signifikant stigning i de inflammatoriske faktorer iNOS og COX-2 (Fig. 5(e)). Figur 5(f) illustrerer detteechinacoside eller verbascoside behandling, som en enkelt agent, forårsager et fald i iNOS- og COX-2-udtrykket. Som forventet resulterede behandling med echinacosid i kombination med verbascosid i en koncentration på 150 μM desuden i et mere udtalt fald i

niveauer af proteinekspression (iNOS og COX-2), hvilket indikerer de synergistiske antiinflammatoriske virkninger af denne lægemiddelkombination. Tilsvarende viser kombinationen af ​​echinacosid og 2'-acetylacteosid, som angivet i fig. 5(g), en signifikant synergistisk effekt på inhiberingen af ​​COX-2 ved koncentrationen på 75 μM eller 300 μM. Men for iNOS repræsenterer kombinationen ved en dosis på 300 μM markant undertrykkelse af proteinet. I modsætning hertil finder vi, at der ikke er nogen åbenlyse hæmmende effekter på både iNOS og COX-2 ved kombinationen af ​​isoacteosid og 2'-acetylacteosid eller echinacosid og verbascosid i koncentrationen på 75μM (Supplerende figur 2), foruden behandling med andre par viser en meget svagere effekt sammenlignet med de enkelte midler ved en dosering på 150 eller 300μM, som kan ses i fig. 5 (e–g).

For at opsummere giver in vitro-undersøgelsen yderligere information til screening af lægemiddelkombinationer med potentielt antiinflammatoriske virkninger og demonstrerer pålideligheden af ​​in silico-screeningsstrategien.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL BEHANDLING AF NEUROINFLAMMATION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskussion

Neuroinflammation er impliceret i de fleste neurologiske, psykiatriske og neuroudviklingssygdomme, hvilket ikke kun er en konsekvens, men kan også være en udløser af patologien. Nuværende behandlinger for neuroinflammatorisk er dog for det meste monoterapier, begrænset af velkendte bivirkninger, som vi ved, COX-2-hæmmere kan føre til kardiovaskulære defekter som reaktion på langtidsbehandling, og TNF-målrettet behandling kan forårsage infektion gennem immunsuppression. Kombinatoriske terapeutiske tilgange kan være bydende nødvendige for at forbedre behandlingen af ​​komplekse sygdomme med følgende fordele: den modvirkede netværksrobusthed og bypass-kompensation, den øgede kliniske effekt, samtidig med at minimal human toksicitet opretholdes, og den reducerede dosis af hver forbindelse63. Udforskningen af ​​de synergistiske lægemiddelkombinationer blandt forbindelser afledt af urtemedicin baseret på systemfarmakologi er imidlertid begrænset af den mulige hovedårsag til store mængder af forbindelser.

I arbejdet får vi først 63 potentielle bioaktive forbindelser fraurt Cistanche tubulosa, der opfylder kriterierne (DL større end eller lig med 0.18) til yderligere analyse ved hjælp af forudsigelsen, som er uundværlig for at frasortere mere lovende molekyler med ønskelige egenskaber. Efter at have kortlagt de 133 targets af de 63 potentielle bioaktive forbindelser til databasen, får vi 43 targets relateret til neuroinflammation, og så kan GOBP clustering-analyse af de forudsagte targets sandsynligvis bidrage til behandlingen af ​​neuroinflammation. Det analytiske resultat af CT-netværket viste en gennemsnitlig grad pr. forbindelse på henholdsvis 11.209 og 7.651 pr. mål, og 38 af dem justerede mere end 7 mål (større end den gennemsnitlige grad). For eksempel kan echinacosid (mol41) forudsagt med 7 mål, verbascosid (mol33), med 9 mål, eller tableside B (mol57), med 8 mål spille nøgleroller i neurobeskyttelse i overensstemmelse med den stigende litteratur.

Vi opnår direkte terapeutiske mål såsom APP, MAPT (også kendt som Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 og HTR2A (også kendt som 5-HT2A), GRIN2B (glutamat ionotrop receptor NMDA type underenhed 2B) og GRIA1 (glutamat ionotrop receptor AMPA type subunit 1) eller downstream potentielle mål såsom PTGS274 eller NOS275, der er forbundet med neuroinflammation eller forskellige sygdomme i nervesystemet.

Analysen af ​​Compound-Target-Pathway-netværket viser 12 forbindelser fra de 10 bedste lægemiddelpar gennem PEA-algoritmen, forbundet med de 43 potentielle mål og de veje, der er forbundet med neuroinflammation, for eksempel Calcium-signalvej, Neuroaktiv ligand-receptor-interaktion eller TNF-signalvej og så videre. I systemet kunne disse forudsagte forbindelser virke på ikke kun proteinerne i opstrøms, men også nedstrøms veje forbundet med neuroinflammation og inflammatoriske biomarkører, især. Yderligere information til screening af lægemiddelkombinationer med potentielt anti-inflammatoriske virkninger er tilvejebragt, og pålideligheden af ​​in silico screen-strategien verificeres ved eksperimentel validering. Neuroinflammationsvejen består af Alzheimers sygdomsvej, calciumsignalvej, GnRH-signalvej, VEGF-signalvej og den serotonerge synapse. De analytiske resultater forklarede os tydeligt, at celledød, inflammation og neurobeskyttelsesmoduler er eksemplificeret for at tyde mekanismen afCistanche tubulosa til behandling af neuroinflammation.

Neuroinflammation ledsager forskellige neurodegenerative sygdomme, som ikke kun kan være en konsekvens, men også en udløser af patologi, og derfor foreslås antiinflammatoriske terapier at være en lovende behandlingsmetode. Til vores skuffelse, selvom vi har indset monoterapiernes begrænsninger, er evalueringen og de underliggende mekanismer for kombinationsterapier stadig de største udfordringer i udviklingen af ​​den nye alternative strategi. Dette arbejde kan derfor tilbyde nye terapeutiske muligheder for neuroinflammation og kan åbne en ny vej til at opdage lægemiddelkombinationer fra naturlige produkter.

Materialer og metoder

Samling af forbindelser

I alt 66 kemiske ingredienser af Cistanche tubulosa indsamles manuelt fra TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, herunder 26 phenylethanoidglycosider, 22 iridoider, 4 lignaner, 7 monoterpenglycosider, 2 nitrogenholdige stoffer, 3 benzen acryloyl sukkerarter, 1 sterol, 1 ketol. I betragtning af detglykosider i Cistanche tubulosahydrolyseres normalt for at frigøre aglycon, som derefter absorberes i tarmslimhinden, og derfor tager vi molekylerne uden glykol i betragtning, som er mærket som _qt. Dette førte til dannelsen af ​​de 103 forbindelser. Disse molekyler er angivet i supplerende tabel S1.

Lægemiddellignende vurdering

For at opnå de potentielle bioaktive forbindelser fra Cistanche tubulosa, evaluerer vi lægemiddellignheden af ​​disse ingredienser ved at beregne Tanimoto-ligheden mellem urteforbindelser og de gennemsnitlige molekylære egenskaber for alle kemikalier i Drugbank-databasen. Og DL-forudsigelsesmodellen er blevet anvendt med succes i mange undersøgelser til at vælge bioaktive forbindelser. I arbejdet er DL-indekset Større end eller lig med 0.18 af kandidaterne defineret som tærskelværdien for bedre at passe til efterfølgende analyse.

Forudsigelse af lægemiddelmål

Identifikationen af ​​effektivitetsmålene for førende stoffer er fortsat et nøgletrin til at udvikle stoffer til lægemiddeludvikling. Her udføres to interne værktøjer: SysDT og WES for at udlede den molekylære målinformation for lægemiddelfshing. SysDT er en in-solo model, der udføres med kombinationen af ​​kemisk, genomisk og farmakologisk information baseret på to kraftfulde matematiske værktøjer: Random Forest (RF) og Support Vector Machine (SVM) for at tackle spørgsmålet om målidentifikation effektivt. Den opnåede model tjente som en værdifuld platform til forudsigelse af lægemiddel-mål-interaktioner med en samlet nøjagtighed på 97,3%, en aktiveret forudsigelsesnøjagtighed på 87,7% og en hæmmet forudsigelsesnøjagtighed på 99,8%. For at fange mere lovende komponenter er filtreringskriterierne defineret som RF-værdi større end eller lig med 0.7 eller SVM større end eller lig med 0.8 i denne undersøgelse.

Weighted ensemble similarity (WES) er en ny kraftfuld beregningsmodel til at udpege lægemidlets direkte mål for de faktiske bioaktive ingredienser. Som et nyt værktøj klarer den opnåede model sig godt til at forudsige bindingen med en gennemsnitlig følsomhed på 85% (SEN) og de ikke-bindende mønstre med 71% (SPE) med de gennemsnitlige arealer under modtagerens driftskurver (ROC, AUC) på 85,2 % og en gennemsnitlig overensstemmelse på 77,5 %. De opnåede mål bliver yderligere kortlagt til Uniprot for efterfølgende at normalisere deres navne og organismer. Her vælger vi kun målene for Homo sapiens til yderligere analyse. Kandidatmål for de udvalgte forbindelser er kortlagt til CTD-databasen for at få deres relaterede sygdomme, og vi frasorterer potentielle mål relateret til neuroinflammation til sidst.

GO berigelse og analyse for mål

For at undersøge de involverede biologiske processer af de opnåede mål, kortlægger vi målene til DAVID, og ​​termerne med P-værdi mindre end 0.05 er valgt i dette afsnit.

Lægemiddelkombinationsanalyse

I vores tidligere arbejde blev en systemfarmakologisk ramme udnyttet til at forudsige lægemiddelkombinationer på en nydesignet model, kaldet Probability Ensemble Approach (PEA) til at analysere den kliniske effekt og negative virkninger af lægemiddelkombinationer. I detaljer blev et Bayesiansk netværk, der integrerer med en lighedsalgoritme, udviklet til at modellere kombinationerne ud fra sammensatte molekylære og farmakologiske effekter. Den kombinerede evaluering, der dækkede den kliniske effekt og bivirkninger for de forudsagte par, blev præsenteret derefter. Kort fortalt viser det, at PEA kunne forudsige effektiviteten af ​​parrene med høj specificitet og sensitivitet (AUC=0.90) i vores arbejde. I dette arbejde udvælger vi top ti lægemiddelkombinationer baseret på deres synergisandsynligheder, som repræsenterer muligheden for at inducere synergi mellem to forbindelser.

Netværk/stibygning og analyse

For at undersøge sammenhængen mellem de aktive ingredienser og de inflammatoriske sygdomme genereres sammensatte mål (CT) netværk og sammensatte målveje netværk (CTP) af Cytoscape 2.8.1, en populær bioinformatikpakke til biologisk netværksvisualisering og dataintegration. Netværkets kvantitative egenskaber analyseres af de to følgende plugins Network Analyzer og CentiScaPe 1.2. I det grafiske netværk angiver noder enten forbindelser, mål eller veje, mens kanter koder for lægemiddel-mål-interaktionen. For yderligere at udforske de biologiske virkninger af, hvordan cellulære mål fungerer ved at modulere flere metabolismeveje, er en indbygget "vej" samlet af den opdaterede information om neuroinflammationspatologi. For det første, ved at kortlægge dem på KEGG-databasen, aggregeres de opnåede målprofiler i flere veje. Efter at have forladt de indirekte sektioner bliver en relativt syntetiseret vej manuelt integreret på grund af de patologiske og kliniske data.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL BEHANDLING AF PARKINSONS SYGGE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentel validering

Prøveforberedelse

Echinacosid, verbascosid, isoacteosid og 2'-acetylacteosider købt fra Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Kina). Testprøver opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, USA) for at få 100 mM, som en stamopløsning, og opbevares derefter ved 4 grader. De endelige fortyndinger af DMSO tilsat til dyrkningsmediet oversteg aldrig 0,1 %, hvilket sikrede, at der ikke var nogen effekt på cellelevedygtighed.

Cellekultur

BV2 muse mikrogliaceller er oprindeligt udviklet af Chinese Academy of Sciences Shanghai cellebank og dyrket i 25 eller 75 cm2 opgaver med Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco BRL, USA), penicillin G (100 enheder/ml) og streptomycin (100 mg/ml) i en fugtig inkubator med 5% CO2/95% O2 ved 37 grader.

Cellelevedygtighedsanalyse

BV2 mikroglia-celler podes i en 96-brøndplade med en tæthed på 1×105 celler/ml, efter inkubering i 18 timer, behandles celler med 100 ul frisk medium med eller uden forskellige angivne koncentrationer af testprøver for yderligere 24 timer. CCK-8-assay (BestBio, Shanghai, Kina) er en bekvem, pålidelig metode til at bestemme cellernes levedygtighed. For at eliminere baggrunden for testprøver kasserer vi hele dyrkningsmediet, hvorefter 100 ul/brønd friskt medium indeholdende 10 % CCK-8-opløsning tilsættes derefter. OD-værdierne ved 450 nm aflæses på en mikropladelæser (Molecular Devices, Californien, USA) efter 3 timers inkubation ved 37 grader og 5 % CO2.

Western Blot Analyse

Det cellulære protein ekstraheres fra cellelinjer ved hjælp af et Qproteome™ Mammalian Protein Prep Kit (Qiagen, Tyskland) efter de angivne procedurer i producentens protokol. Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA) anvendes til proteinkvantificering. Ækvivalente mængder protein (50ug) denatureres ved kogning ved 100 grader i 10 minutter med 2*laemmli prøvebelastningsbuffer (Bio-Rad, USA) plus 5% -mercaptoethanol i forholdet 1:1 og indlæst pr. bane på 12% SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat polyacrylamid minigeler), elektrooverført til 0,45 μm polyvinylidenfuoridmembraner (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, USA) i 150 minutter ved 200 mA. Efterfølgende blokeres membranerne i 3 % bovint serumalbumin (BSA) ved stuetemperatur og inkuberes med de primære antistoffer iNOS og COX-2 (Abcam) ved 4 grader natten over. Efter tre grundige vaske i Tris-pufret saltvand-Tween (TBST) hver i 5 minutter, probes membranerne med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugerede sekundære antistoffer (1:10000 fortyndinger; Abcam) i 1,5 time ved stuetemperatur. De immunoreaktive bånd visualiseres derefter ved at bruge et ECL kemiluminescensdetektionskit (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien, USA) efter vask to gange i TBST og én gang i TBS, hver gang i 5 min. Densitometriske værdier normaliseres ved hjælp af -actin som belastningsintern kontrol.

Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± standardfejl, og Western blot-analyse gentages i tre uafhængige eksperimenter med det samme resultat. Envejsvariansanalyse bruges til at sammenligne forskellene i middelværdier for tre eller flere grupper, statistisk signifikans analyseres med Elevens t-test mellem to grupper.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL BEHANDLING AF PARKINSONS SYGGE OG ALZHEIMERS SYGGE PHGS75% ECH 30% ACT 12%