Østrogen aktivitet af glykosider fra Cistanche Deserticola som en østrogenreceptoradjuvans in vitro

INTRODUKTION

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" på kinesisk), en traditionel kinesisk urtemedicin, som først blev registreret iShenNongBenCaoJing, er blevet brugt til behandling af nyremangel, impotens, senil forstoppelse og blodmangel i tusinder af år.[1] Det er hovedsageligt distribueret i ørkenområder i det nordvestlige Kina, såsom Gansu og Xinjiang.[2]Moderne farmakologisk forskning viste, at C. deserticola kan fremme brede medicinske funktioner, såsom hormonregulering, immunmodulerende, antioxidativ, neurobeskyttende, anti-inflammatorisk ogøstrogen aktivitet.[3,4] Glykosider af Cistanches(GC'er) blev betragtet som en af ​​de vigtigste aktive komponenter med forskellige biologiske virkninger.

Østrogenreceptorer- (ER'er) og ER er undertyperne af ER'erne, som kunne regulere fysiologiske funktioner.[7] Disse proteiner kunne regulere transkriptionen af ​​målgener ved at binde til associerede DNA-regulerende sekvenser i cellekernen. Begge undertyper er markant udtrykt i det kardiovaskulære og centrale nervesystem.[8,9] ER findes hovedsageligt i mælkekirtlen, livmoderen, æggestokkene, knoglerne, det mandlige reproduktionsorgan og prostata. ER er hovedsageligt til stede i prostata, ovarie og blære.[10,11] Desuden er der nogle fælles fysiologiske roller for de to undertyper, såsom i udviklingen og funktionen af ​​æggestokkene og beskyttelsen af ​​det kardiovaskulære system.[ 12,13] Tidligere forskning i vores gruppe afslørede den østrogenlignende mekanisme af GC'er ved metoden til metabolomisk analyse.[14] I en kontinuerlig undersøgelse analyserede vi mekanismen for østrogen aktivitet af GC'er på MCF-7-cellelinjer relateret til ER'er.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRINGØSTROGEN AKTIVITETPHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIALER OG METODER

Instrumenter

ECO‑170P‑230 inkubator var fra New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., Bio‑Rad 680 mikropladelæser og elektroforeseapparat var fra Bio‑Rad Laboratories, Inc., CX21 mikroskop var fra Olympus Co., Ltd. GIS-2019 gel billeddannelsessystem var fra Tanon Science and Technology Co., Ltd., den flade bundplade var fra Corning Inc., EPICS-XL flowcytometri var fra Beckman-Coulter Inc., og StepOnePlus Real-Time polymerase kædereaktion ( PCR) systemet var fra Thermo Fisher Scientific.

Kemikalier og reagenser

GC'er blev fremstillet i vores laboratorium som metoden tidligere rapporteret, [14] og renheden af ​​GC'er blev bestemt til at være 52% (acteosid blev brugt som en markør til at bestemme GC'erne) ved ultraviolet spektrofotometri. Estradiol (E2) blev købt fra Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Føtalt bovint serum (FBS) og RPMI-1640 var fra Gibco Co., Ltd., 96-brønds fladbundsplade var fra Corning Inc., og dimethylsulfoxid (DMSO) og 3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl ]‑2,5‑diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev købt fra Sigma-Aldrich Corporation. TRIzol-reagens, Reverse Transcription (RT) Kit og TB Green™ RT-PCR Kit blev købt fra TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Kina. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb og ‑actin antistoffer blev købt fra Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Alle de andre almindelige kemikalier blev købt fra kommercielle standardleverandører.

Prøveforberedelse

Fremstilling af glycosider af Cistanches stamopløsning

GC-ekstrakt blev opløst i DMSO for at lave en stamopløsning med en koncentration på 0.1051 g/ml og opbevaret ved 4 grader. Phenol rød-fri RPMI-1640 blev brugt til at fortynde stamopløsningen til forskellige koncentrationer før brug.

Fremstilling af østradiol stamopløsning

E2-ekstrakt blev opløst i DMSO for at fremstille en stamopløsning med en koncentration på 0,27 mg/ml og opbevaret ved 4 grader. Phenol rød-fri RPMI-1640 blev brugt til at fortynde stamopløsningen til forskellige koncentrationer før brug.

Fremstilling af trækulsdekstranbehandlet-føtalt bovint serum

Et hundrede milliliter FBS blev blandet med 250 mg aktivt kulpulver og 25 mg dextran. Efter inkubation i 45 minutter ved 55 grader blev blandingen centrifugeret ved 4 grader, 1000 rpm i 15 minutter. Supernatanten blev filtreret ved hjælp af Millipore Express PES-membran for at få den kuldextranbehandlede (CDT)-FBS og opbevaret ved -20 grader.

Cellekultur

De humane brystkræft MCF-7-cellelinjer blev opnået fra den amerikanske type kultursamling (ATCC). Desuden blev cellerne dyrket med RPMI-1640-medium indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 grader under en befugtet 5% CO2-atmosfære. Celler blev dyrket i det phenolrøde frie RPMI-1640-medium indeholdende 5 % CDT-FBS 4 dage før MTT-assay, så østrogenet i cellerne kunne fjernes.

Celleproliferationsanalyse af østradiol på MCF-7-cellelinjer

Celleproliferation blev målt ved hjælp af MTT-assayet for MCF-7-celler.[15,16] E2 blev opløst i RPMI-1640-kulturmedier indeholdende 0.1 % DMSO i slutkoncentrationer på {{27 }}.1, 1, 10, 100 og 1000 nM. MCF-7-cellelinjer blev dyrket i phenolrødt-frit RPMI-1640-medium i 4 dage. Efter vask med phosphat-bufret saltvand (PBS) tre gange blev 100 µL FBS-frit RPMI-1640-medium tilsat til 96-brøndsplader med 1,5 × 104 pr. brønd og inkuberet ved 37 grader i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af E2-opløsningen i 72 timer. Derefter blev 100 µL MTT-opløsning (0,5 mg/ml) tilsat til hver brønd. Celler blev inkuberet i 4 timer. Til sidst blev 150 µL DMSO tilsat for at opløse formazan-krystallerne. Absorbansen blev målt ved 570 nm af en mikropladelæser, og proliferationshastigheden (PR) blev beregnet.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Celleproliferationsanalyse af glycosider af Cistanches på MCF-7-cellelinjer

Celleproliferation blev målt ved hjælp af MTT-assayet for MCF-7-celler. GC'er blev opløst i RPMI-1640 dyrkningsmedier indeholdende 0,1 % DMSO i slutkoncentrationer på 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 og 175 µg /ml. MCF-7-cellelinjer blev dyrket i phenolrødt-frit RPMI-1640-medium indeholdende 5 % CDT-FBS i 4 dage. Efter vask med PBS tre gange blev 100 µL FBS-frit RPMI-1640-medium tilsat til plader med 96 brønde ved 1,5 × 104 pr. brønd og inkuberet ved 37 grader i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af GCs-opløsningen i henholdsvis 24, 48 og 72 timer. Derefter blev 100 µL MTT-opløsning (0,5 mg/ml) tilsat til hver brønd. Celler blev inkuberet i 4 timer. Til sidst blev 150 µL DMSO tilsat for at opløse formazan-krystallerne. Absorbansen blev målt ved 570 nm af en mikropladelæser, og PR blev beregnet. Phenolrød-fri RPMI-1640 og medium indeholdende E2 (2,725 × 10-3 µg/ml) var henholdsvis de negative og positive grupper.

Celleproliferationsanalyse af glycosider af Cistanches med fulvestrant på MCF-7 cellelinjer

Celleproliferation blev målt ved hjælp af MTT-assayet for MCF-7-celler. GC'er blev opløst i RPMI-1640-dyrkningsmedier indeholdende 0,1 % DMSO i slutkoncentrationer på 1,75, 17,5 og 175 µg/ml. MCF-7-cellelinjer blev dyrket i phenolrødt-frit RPMI-1640-medium indeholdende 5 % CDT-FBS i 4 dage. Efter vask med PBS tre gange blev 100 µL FBS-frit RPMI-1640-medium tilsat til plader med 96 brønde ved 1,5 × 104 pr. brønd og inkuberet ved 37 grader i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af GCs-opløsningen og inkuberet med fulvestrant (6,06 × 10-5 µg/ml) i 48 timer. Derefter blev 100 µL MTT-opløsning (0,5 mg/ml) tilsat til hver brønd. Celler blev inkuberet i 4 timer. Til sidst blev 150 µL DMSO tilsat for at opløse formazan-krystallerne. Absorbansen blev målt ved 570 nm af en mikropladelæser, og PR blev beregnet. Phenolrød-fri RPMI-1640 og medium indeholdende E2 (2,725 × 10-3 µg/ml) var henholdsvis de negative og positive grupper.

Cellecyklus assay

GC'er blev opløst i RPMI-1640 kulturmedier indeholdende 0,1 % DMSO i slutkoncentrationer på 1,75, 17,5 og 175 µg/ml. MCF-7-cellelinjer blev dyrket i phenolrødt-frit RPMI-1640-medium indeholdende 5 % CDT-FBS i 4 dage. Efter vask med PBS tre gange blev 1 mL FBS-frit RPMI-1640-medium tilsat til 6-brøndsplader ved 2,5 × 105 pr. brønd og inkuberet ved 37 grader i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af GCs-opløsningen og inkuberet med fulvestrant (6,06 × 10-5 µg/ml) i 48 timer. Efterfølgende blev cellerne opsamlet og vasket med PBS tre gange, centrifugeret ved 4 grader, 1000 rpm i 10 minutter og fikseret med 70% ethanol ved -20 grader natten over. Efter vask med PBS to gange blev cellerne farvet med PI-opløsning (50 mg/ml) indeholdende 1 mg/ml RNase A og 0,1 % Triton X-100 i 30 minutter i mørke ved 4 grader. Cellecyklussen blev påvist ved anvendelse af flowcytometri, og proliferationsindekset (PI) blev beregnet som følger. Phenolrød-fri RPMI-1640 og medium indeholdende E2 (2,725 × 10-3 µg/ml) var henholdsvis de negative og positive grupper.

PI {{0}} (S + G2 M)/(G0 /G1  + S + G2 M) × 100 %

RNA-isolering og real-time kvantitativ polymerasekædereaktionsanalyse

For at måle niveauet af mRNA blev der brugt en RT-kvantitativ PCR (qPCR) assay. Totalt cellulært RNA blev ekstraheret med et TRIzol-reagens. For qPCR blev RNA omvendt transskriberet til cDNA fra 4 µg totalt RNA ved anvendelse af et RT-kit. RT-PCR-analyser blev udført ved hjælp af TB Green™ RT-PCR-kittet. Alle protokoller blev udført i henhold til producentens instruktioner. Primerparret anvendt til amplifikation af ER var 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (fremad) og 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (omvendt); primerparret anvendt til amplifikation af ER var 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (fremad) og 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (omvendt). PCR-betingelserne for ER og ER var 94 grader i 3 minutter efterfulgt af henholdsvis 37 og 40 cyklusser på 94 grader i 30 sekunder, 58 grader i 2 minutter og 72 grader i 2 minutter. Primerparret, der blev brugt til amplifikation af GAPDH, var 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (fremad) og 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (omvendt). PCR-betingelserne for GAPDH var 94 grader i 3 minutter efterfulgt af 30 cyklusser af 94 grader i 30 s, 58 grader i 2 minutter og 72 grader i 2 minutter. Hver gang blev RT-qPCR-eksperimentet gentaget mere end to gange. Til dette blev GAPDH brugt som intern kontrol. Den relative genekspression af ER/ER af transfektanter omkring kontrolceller blev beregnet: 2−(∆∆Ct).

Western blotting

Ekspressionen af ​​ER- og ER-proteiner blev detekteret ved western blot-analyse som den rapporterede metode med mindre modifikationer. Kort fortalt blev MCF-7-cellerne dyrket i plader med 6 brønde med 2,5 × 105 celler pr. brønd og behandlet med GC'er ved den endelige koncentration på henholdsvis 1,75, 17,5 og 175 µg/ml i 48 timer. Efter inkubation blev helcelleekstrakterne fremstillet under anvendelse af RIPA-buffer indeholdende 1 mM PMSF. Proteiner i helcelleekstrakterne blev adskilt ved 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og derefter overført til polyvinylidendifluoridmembraner. Membranen blev blokeret med 5 % (vægt/volumen) skummetmælk opløst i TBST-buffer og inkuberet med primære og sekundære antistoffer på skift. Bundne antistoffer blev observeret.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRINGØSTROGEN AKTIVITETPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Statistisk analyse

Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit og standardafvigelser, og statistisk signifikans blev udført ved hjælp af Students t-test med SPSS 21.0 software (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was considered statistically significant. 

RESULTATER

Efter 24 timers E2-behandling blev proliferationen af ​​MCF-7-celler forbedret [Figur 1a]. 10 nM E2-opløsning kunne naturligvis stimulere væksten af ​​cellerne (123,89%). Men med stigningen i E2-koncentrationen svækkedes celleproliferationsevnen. Derfor var 10nM den optimale koncentration af E2 i dette eksperiment. GCs-gruppe ved koncentrationerne 1,75, 17,5 og 175 µg/mg kunne øge proliferationen af ​​MCF-7-cellelinjerne på en tids- og dosisafhængig måde og udviste en signifikant forskel med en negativ gruppe [Figur 1b]. Sammenlignet med den negative gruppe udviste E2-gruppen tydelig spredning (120,06%). Kombineret medicingruppe (CMG) (fulvestrant med E2 eller GC'er) i CDT-FBS-mediet blev inkuberet med MCF-4-celler. Efter 72 timer

inkubation, kan CMG føre til en stigning i PR sammenlignet med den individuelle medicingruppe (IMG) (P< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

KONKLUSION

I denne forskning blev effekten af ​​GC'er på proliferation og cellecyklus af MCF-7 analyseret ved hjælp af henholdsvis MTT- og flowcytometrimetoden.GC'er kan øge proliferationen af ​​MCF-7-cellerved en koncentration på 1,75, 17,5 og 175 µg/ml efter inkubation i 72 timer. Stigningen har dog en tendens til at aftage, når CC'er og fulvestrant bruges sammen. GC'er kunne øge PI-værdien af ​​MCF-7-celler, reducere cellen i G1-fasen og øge cellerne i S- og G2-faserne.

Fulvestrant er en ER-specifik antagonist, som blokerer den nukleare lokalisering af ER ved at forringe receptordimerisering og energiafhængig nuklear transport.[17] I denne forskning har en konklusion bekræftet, at fulvestrant kan svække proliferationen af ​​GC'er på MCF-7-celler, og det kan påvirke cellecyklustransformation. Derfor indikerede denne undersøgelse den østrogene aktivitet af GC'er, og også ER er

mål for GC'er. I RT-PCR- og western blot-eksperimentet steg mRNA- og proteinekspressionen af ​​ER og ER i MCF-7-cellerne med stigningen i GC-koncentrationen. Derfor,GC'er kan spille en rolle i østrogen aktivitetifølge opreguleret mRNA og proteiner fra ER og ER.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRINGØSTROGEN AKTIVITETPHGS75% ECH 30% ACT 12%