Blødgørende effekt af ginsenosid F1 gennem inhibering af melaninoverførsel i samdyrkede humane melanocytesekeratinocytter og tredimensionel human hudækvivalent

Ginsenosider er de vigtigste aktive ingredienser i ginseng. I hudfysiologi påvirker ginsenosider pigmentregulering og udviser antialdringsaktivitet. Ifølge nylige rapporter øger ginsenosid Rg1 melanogenese og tyrosinaseaktivitet i humane melanocytter [1]. I modsætning hertil rapporteres ginsenosid F1 (GF1) (sFig. 1), en metabolit produceret ved hydrolyse af Rg1, at hæmme synlig pigmentering. En klinisk undersøgelse af Han et al påviste en hudblegende effekt af GF1 på kunstigt garvet human hud forårsaget af interleukin 13-produktion fra humane epidermale gd-T-celler [2]. Kim et al viste, at GF1 reducerer melanin-sekretion gennem dendrit-tilbagetrækning uden indvirkning på det intracellulære melaninindhold og tyrosinaseekspression i melanocytstimulerende hormon (MSH)-stimulerede B16F10 murine melanomceller [3]. Til dato er der imidlertid ikke opnået direkte fund om blegningseffekterne af GF1 i det humane epidermale miljø bestående af melanocytter og keratinocytter i et in vitro eksperimentelt system.

Interpolation, samtidig fandt vi ud af, at der også er tyrosinase i Cistanche deserticola, og tyrosinase-dopa rate oxidationsmetoden har udført reguleringsforskningen af ​​tyrosinase aktivitet på phenylethanoid glycosid ekstrakten i Cistanche deserticola, resultaterne viser, at: total phenylethanoid glykosider af Cistanche deserticola Ekstraktet kan signifikant nedregulere aktiviteten af ​​tyrosinase. Phenylethanoidglycosidet i Cistanche deserticola kan også effektivt absorbere ultraviolet stråling i sollys. Den molekylære struktur af phenylethanoidglycosidet har flere konjugerede systemer. Efter ultraviolet scanning viser det sig, at den har en stærk absorption mellem 280nm og 380nm, og den maksimale absorptionsbølgelængde er 281nm og 333nm. , hvilket indikerer, at phenylethanoid glycosidet af Cistanche deserticola har en god absorptionseffekt på ultraviolette stråler og bedre kan forebygge og lindre skaden af ​​ultraviolet stråling på huden.

Klik jing urter cistanche ekstrakt pulver produkt

Fig. 1. Virkningen af ​​GF1 på melaninindhold og tyrosinaseekspression i humane melanocytter. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) blev behandlet med MNT-1-celler i 24 timer, 48 timer og 72 timer. (A) Melaninindholdet blev derefter analyseret. (B) Tyrosinaseekspressionsniveauet blev analyseret. Derudover blev GF1 (10, 50, 100 uM) behandlet med a-MSH (500 nM)-stimulerede MNT-1-celler i 48 timer og 72 timer. (C) Melaninindholdet blev derefter analyseret. (D) Tyrosinaseekspressionsniveauet blev analyseret. Vi behandlede primære normale humane epidermale melanocytter (NHEM) med GF1 (50 mM og 100 mM) i nærvær eller fravær af a-MSH-stimulering i 48 timer. (E) Melaninindholdet blev derefter analyseret. (F) Tyrosinaseekspressionsniveauet blev analyseret. MNT-1-celler blev behandlet med GF1 (50 mM og 100 mM) i 48 timer i et dyrkningsmedium indeholdende 100 mM eller 500 mM L-tyrosin. (G) Derefter blev melaninindholdet analyseret. GADPH, glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase; GF1, ginsenosid F1.

Her undersøgte vi de anti-melanogene virkninger af GF1 på MNT-1/HaCaT cokulturceller og tredimensionelle (3-D) humane hudækvivalenter. Derudover fokuserede vi på dendritdannelsen i melanocytter og melanosomoverførsel til keratinocytter efter GF1-behandling. Samlet viser vores resultater for første gang, at GF1 viste blegningseffekterne i den menneskelige epidermis, der eksisterede sammen med melanocytter og keratinocytter.

Til denne undersøgelse blev MNT-1-celler dyrket i minimum essentielle medier (MEM) indeholdende 20 procent føtalt bovint serum (FBS), 1 procent gentamicin og 20 mM hydroxyethylpiperazinethansulfonsyre (HEPES). HaCaT-celler blev dyrket i dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) indeholdende 10 procent FBS, 1 procent gentamicin og 20 mM HEPES. Normale humane epidermale melanocytter (NHEM) blev købt fra (Lonza, Basel, Schweiz) og blev dyrket i melanocytvækstmedie-4 (MGM-4). Celler blev inkuberet ved 37 C under en 5% CO2-atmosfære.

For at måle melaninindholdet blev celler (2 105) dyrket i en 6-brøndsplade i 24 timer. Celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af GF1. Derefter blev celler vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter løsnet med trypsin/EDTA. Celler blev lyseret ved at inkubere i 200 ml 1 N NaOH ved 80 C i 2 timer. Cellelysater blev overført til en 96-brøndplade, og absorbans blev målt ved 405 nm.

For at udføre Western blotting blev celler vasket to gange med kold PBS og derefter lyseret i iskoldt modificeret radioimmunpræcipitationsassay (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 procent Nonidet P-40 , 0,5 procent natriumdeoxycholat, 150 mM NaCl) indeholdende proteasehæmmere og phosphatasehæmmercocktailsæt (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Proteiner blev adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev inkuberet med primære antistoffer ved 4 C i 24 timer, derefter vasket med tris-bufret saltvand inklusive 0,1 procent Tween-20, udsat for peroxidase-konjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur, vasket og derefter visualiseret ved hjælp af et Odyssey billedbehandlingssystem.

For at analysere melanosomoverførslen blev MNT{0}}/HaCaT-celler dyrket i en 12-brøndplade i forholdet 1 til 10 i 24 timer, og derefter GF1 blev behandlet med angivet koncentration. Celler blev vasket to gange med kold PBS og fikseret med 3,5 procent paraformaldehyd i 10 min. Celler blev vasket og behandlet med 0,1 procent Triton X-100 i 10 minutter og derefter 0,5 procent bovint serumalbumin (BSA) i 1 time. Antistoffer mod tyrosinase-relateret protein 1 (1:200, rød) og cytokeratin-18 (1:200, grøn) blev brugt til påvisning af melanocytter og keratinocytter.

MelanoDerm Skin Tissue Model (TM) er en levedygtig rekonstitueret {{0}}D human hudækvivalent indeholdende normale melanocytter og keratinocytter (MatTek Corp., Ashland, MA). Vi brugte MelanoDerm TM (MEL-300-A), som stammer fra asiatiske donorer. De blev vedligeholdt i det nye vedligeholdelsesmedie-113 som anbefalet af producenten. GF1 blev påført MelanoDerm TM på dag 0, 4, 6, 8, 11, 13 og 15. Før GF1-behandling blev vævene vasket med 1 ml PBS for at fjerne enhver resterende forbindelse. Væv blev fikseret på dag 18 til histologisk analyse. Histologisk evaluering blev udført under et lysmikroskop (Bx-41; Olympus, Tokyo, Japan), og mikrofotografier blev taget ved hjælp af et digitalkamera (DP72; Olympus). Melanoderm blev fikseret i en 4 procent bufret formaldehydopløsning til farvningen. Prøverne blev indlejret i paraffinvoks, skåret til en tykkelse på 3 mm og farvet med Hematoxylin og Eosin og Fontana og Mason farvningsopløsning. Alle data er udtrykt som middel SD (standardafvigelse) værdier, og Student t-testen blev brugt til statistiske sammenligninger. En p-værdi < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant (individuelle p-værdier er angivet i figurforklaringer).

For at fastslå effekten af ​​GF1 på humane melanocytter behandlede vi højtpigmenterede humane melanomceller (MNT-1) med GF1 i 24, 48 og 72 timer, efterfulgt af en analyse af det intracellulære melaninindhold og ekspression af tyrosinaseprotein . Som vist i fig. 1A havde GF1 ingen inhiberende virkning på melaninindholdet inden for et koncentrationsområde på 10e100 mM. Derudover blev tyrosinaseekspression ikke reduceret af GF1 i MNT-1-celler (fig. 1B, sfig. 2A). Behandling af a-MSH-stimulerede MNT-1-celler med GF1 i 48 timer og 72 timer resulterede ikke i undertrykkelse af melaninindholdet (fig. 1C) eller tyrosinaseekspression (fig. 1D, sf. 2B). For yderligere at bekræfte effekten af ​​GF1 på humane melanocytter behandlede vi primær NHEM med GF1 i nærvær eller fravær af a-MSH-stimulering i 48 timer. I lighed med data opnået med MNT-1-celler påvirkede GF1 ikke melaninindholdet (fig. 1E) eller tyrosinaseekspression (fig. 1F, sfig. 2C) i NHEM. Til sidst vurderede vi, om L-tyrosinniveauet i dyrkningsmediet påvirker GF1-aktivitet, fordi L-tyrosin er substratet for tyrosinase til melaninsyntese. Følgelig blev MNT-1-celler behandlet med GF1 i 48 timer i dyrkningsmediet indeholdende 100 mM eller 500 mM L-tyrosin. Som vist i fig. 1G inhiberede GF1 ikke melaninindholdet i MNT-1-celler, uanset koncentrationen af ​​L-tyrosin.

Fig. 2. Effekten af ​​GF1 på dendritdannelse og melanosomoverførsel i MNT-1/HaCaTcokulturerede celler og en 3-D human hudækvivalent. Samdyrkede MNT-1/HaCaT-celler blev behandlet med 100 mM GF1 i nærvær eller fravær af a-MSH (500 nM) stimulering i 48 timer. (A) Efter fikseringen observerede vi dendritdannelse i melanocytter ved hjælp af optisk mikroskopi (Skala bar; 50 mm). (B) Til immunfarvning farvede vi melanosomer med TRP-1-antistof (rød farve) og keratinocytter med cytokeratin-18 (grøn farve). Hvide pile angiver overført melanosom til HaCaT fra MNT-1-celler (skalalinje; 20 mm). Human hudækvivalent (MelanoDerm; n ¼ 3) blev behandlet med 1 procent Kojic syre som en reference blegeforbindelse og GF1 (10 og 50 ug/ml) i 18 dage. (C) Efter behandling blev hudækvivalenter fotograferet. (D) 6 L værdi (lyshedsgrad sammenlignet med vehikelbehandlet kontrol) for hver testprøve blev beregnet. (E) Hæmatoxylin og Eosin (H&E) farvning af vævssnit. (F) Fontana-Mason (F&M) farvning af vævssnit. Objektglassene blev fikseret i en formaldehydopløsning og indlejret i paraffinvoks til farvningen (skalastang; 50 mm). Sorte pile angiver det overførte melanosom fra melanocytter i basallaget til keratinocytter i det øvre lag. Blå pile indikerer melanocytter, der danner de udvidede dendritter. (*p < 0,05, **p < 0,01, *p < 0,001). CON, kontrol; GF1, ginsenosid F1; KA, Kojic syre.

Efter opdagelsen af, at GF1 ikke udøver en anti-melanogen effekt i mono-dyrkede humane melanocytter, analyserede vi yderligere, om GF1 påvirker melaninsyntesen i melanocytter i et eksperimentelt system indeholdende både keratinocytter og melanocytter med mulighed for celle-celle kommunikation. MNT-1- og HaCaT-celler (en immortaliseret human normal keratinocytcellelinje) blev dyrket sammen med 100 mM GF1 i nærvær eller fravær af UV-B-bestråling. Efter 48 timer (sfig. 3A) eller 72 timer (sfig. 3B) vurderede vi melaninindholdet fra isolerede MNT-1 og samdyrkede celler. Vores data viste, at GF1 ikke hæmmer melaninsyntese i både isolerede MNT-1 og co-dyrkede cellegrupper.

Ud over melaninsyntese fokuserede vi på den hæmmende effekt af GF1 på melanosomoverførsel fra melanocytter til keratinocytter. Specifikt blev samdyrkede MNT-1/HaCaT-celler behandlet med 100 mM GF1 i nærvær eller fravær af a-MSH-stimulering (fig. 2A), efterfulgt af en undersøgelse af dendritdannelse i melanocytter, som er nødvendig for melanosomoverførsel . Interessant nok blev aMSH-inducerede strakte dendritter trukket tilbage efter GF1-behandling. Derefter farvede vi TRP-1-positive melanosomer (røde) for MNT1-celler og cytokeratin-18 (grøn) for HaCaT-celler i cokulturer. Som vist i fig. 2B blev TRP-1-positive melanosomer i MNT-1-celler overført til HaCaT-celler efter a-MSH-stimulering, som var signifikant inhiberet af GF1. Disse resultater indikerer, at GF1 undertrykker melanosomoverførsel, hvilket forårsager dendrit-tilbagetrækning af melanocytter.

For at udvide denne undersøgelse til et mere fysiologisk system undersøgte vi GF1's blegeevne i en 3-D human hudækvivalent, som er et epidermalt lag bestående af melanocytter og keratinocytter. I fig. 2C virkede GF1--behandlet væv lettere end kontrolvæv, og L-værdien (et lyshed/mørkeindeks) blev ændret ved GF1-behandling (fig. 2D). Desuden afslørede hæmatoxylin- og eosinfarvning af vævssnit ingen vævskollaps eller toksicitet (fig. 2E). Fontana og Mason farvningseksperimenter viste, at GF1 hæmmer dendritdannelse af melanocytter i basallaget og samtidig undertrykker melanosomoverførsel fra melanocytter i basallaget til keratinocytter i det differentierede øvre lag (fig. 2F). Disse resultater understøtter tilsammen den hæmmende virkning af GF1 i melanosomoverførsel, hvilket fører til fremme af blegning i den humane hudvævsmodel.

I den foreliggende undersøgelse inhiberede GF1 ikke melaninsyntese og tyrosinaseekspression; snarere øgede GF1 en smule intracellulært melaninindhold og tyrosinaseekspression i MNT-1-celler og co-dyrkede celler (fig. 1A og 1B og sf. 3A). Men samtidig fandt vi, at GF1 hæmmede melanosomoverførsel gennem den reducerede dendritdannelse af melanocytter. Vi formoder, at øget intracellulært melaninindhold af GF1 kan være forårsaget af melanosomakkumulering på grund af blokaden af ​​melanosomoverførsel og induktion af tyrosinaseekspression. Synlig hudpigmentering bestemmes af mængden af ​​spredning af melanosomer fra de forskellige områder af udvidede dendritter af melanocytter til omgivende keratinocytter [4]. Adskillige forbindelser, såsom centaureidin og methylophiopogonanon B, viste blegningseffektivitet, hvilket førte til tilbagetrækning af melanocytdendrit uden at påvirke melanogen enzymekspression eller melaninsyntese [5]. Derfor betragtes blokaden af ​​melanosomoverførsel til keratinocytter fra melanocytter som en effektiv tilgang til at inducere en blegningseffekt, selvom melaninbiosyntesen ikke hæmmes. Derfor mente vi, at øget melaninindhold af GF1 har ringe indflydelse på GF1's blegningseffektivitet. Derudover ville akkumulerede melanosomer blive nedbrudt af autofagi til hudhomeostase, selvom melanosomernes skæbne er uklar [6].

Vi demonstrerede for første gang, at GF1 undertrykker a-MSH-induceret dendritdannelse, hvilket resulterer i hæmning af melanosomoverførsel til keratinocytter i humane celle-samkulturer. Derudover forstyrrede GF1 melaninoverførslen fra melanocytter i basallaget til keratinocytter i det øvre lag, hvilket udøvede en blegende effekt i den menneskelige hudækvivalent. Nylige cokultur eksperimenter indikerer, at melanocytter leverer pigment til keratinocytter via dendritiske morfologiændringer, såsom desorganisering af b-tubulin mikrofilamenter i det intracellulære cytoskelet [7,8]. Cyklisk adenosinmonofosfat, en melanogenese-inducer, medierer dendritdannelse gennem opregulering af Rac og nedregulering af Rho-aktivitet [9,10]. Derfor vil fremtidige undersøgelser af vores gruppe fokusere på en omfattende evaluering af målproteinerne i GF1, såsom molekyler involveret i den cykliske adenosinmonophosphat-signalvej.

Samlet giver vores resultater foreløbige beviser for, at GF1 har potentiale for udvikling som et effektivt blegende reagens til behandling af pigmentforstyrrelser og lysere mørk hudfarve som en kosmetisk ingrediens.

Interessekonflikt

Alle medvirkende forfattere erklærer ingen interessekonflikter.

Anerkendelser

Denne forskning blev støttet og finansieret af Amorepacific R&D Center.

Referencer

[1] Lin M, Zhang BX, Zhang C, Shen N, Zhang YY, Wang AX, Tu CX. Ginsenosider Rb1 og Rg1 stimulerer melanogenese i humane epidermale melanocytter via PKA/CREB/MITF-signalering. Evid. Baseret. Komplement. Alternativ Med 2014;2014: 892073

[2] Han J, Lee E, Kim E, Yeom MH, Kwon O, Yoon TH, Lee TR, Kim K. Rolle af epidermal gd T-celle-afledt interleukin 13 i den hudblegende effekt af Ginsenoside F1. Exp Dermatol 2014;23:860e2.

[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. Ginsenosid F1 dæmper hyperpigmentering i B16F10 melanomceller ved at inducere dendrittilbagetrækning og aktivere Rho-signalering. Exp Dermatol 2015;24:150e2.

[4] Ando H, Niki Y, Ito M, Akiyama K, Matsui MS, Yarosh DB, Ichihashi MJ. Melanosomer overføres fra melanocytter til keratinocytter gennem processerne med pakning, frigivelse, optagelse og dispersion. Invest Dermatol 2012;132:1222e9.

[5] Ebanks JP, Wickett RR, Boissy RE. Mekanismer, der regulerer hudpigmentering: stigning og fald i teintfarvning. Int J Mol Sci 2009;10:4066e87.

[6] Katsuyama Y, Taira N, Yoshioka M, Okano Y, Masaki H. Afbrydelse af melanosomtransport i melanocytter behandlet med theophyllin forårsager deres nedbrydning ved autofagi. Biochem Biophys Res Commun 2017;485: 126e30.

[7] Ni J, Wang N, Gao L, Li L, Zheng S, Liu Y, Ozukum M, Nikiforova A, Zhao G, Song Z. Effekten af ​​den NMDA-receptorafhængige signalvej på cellemorfologi og melanosomoverførsel i melanocytter. J Dermatol Sci 2016;84:296e304.

[8] Scott G. Rac og rho: historien bag melanocytdendritdannelse. Pigment Cell Res 2002;15:322e30

[9] Scott G, Leopardi S. cAMP-signalvejen har modsatrettede virkninger på Rac og Rho i B16F10-celler: implikationer for dendritdannelse i melanocytiske celler. Pigment Cell Res 2003;16:139e48.

[10] Ma HJ, Ma HY, Yang Y, Li PC, Zi SX, Jia CY, Chen R. a-Melanocyt-stimulerende hormon (MSH) og prostaglandin E2 (PGE2) driver melanosomoverførsel ved at fremme filopodia-levering og udskille sfæroide granulat: bevis fra atomkraftmikroskopiobservation. J Dermatol Sci 2014;76: 222e30.

Chang-Seok Lee 1,3 , Gibaeg Nam 1 , Il-Hong Bae 1 , Junseong Park 1,2,*

1 Amorepacific CO R&D Center, Yongin-si, Republikken Korea

2 Institut for Ingeniørkemi, Chungbuk National University, Cheongju-si, Chungbuk, Republikken Korea

3Department of Beauty and Cosmetic Science, College of Health Science, Eulji University, Seongnam-si, Republikken Korea

For more information:1950477648nn@gmail.com