Tuliposider H-J og bioaktive komponenter fra Amana Edulis-løget

Abstrakt:

Tre nye tulipansider H–J (1–3) og 11 kendte forbindelser blev for første gang opnået fra de methanoliske ekstrakter af løgene fra Amana edulis. Deres strukturer blev belyst ved NMR, MS og IR spektroskopiske data, optisk rotation og Moshers metode. Melanogeneseegenskaberne for alle isolaterne blev evalueret i B16 melanomceller. Følgelig havde tributylcitrat (9) anti-melanogenese-aktivitet, men var cytotoksisk over for B16. (plus )-pyroglutaminsyre (4), (plus )-butyl 5-oxopyrrolidin-2-carboxylat (6), (–)-3-hydroxy-2-methylbutyrolacton (10) ), og 5- (hydroxymethyl)furfural (12) havde øget melaninproduktion og tyrosinaseaktiviteter. Disse aktive komponenter kunne undersøges yderligere som kandidater mod melanom og vitiligo til hudsygdomme eller blegning/hypopigmentering for hår.

I blegningsforskningen fandt vi ud af, at Cistanche også har en blegningseffekt

Først og fremmest er Cistanche rig på polysaccharider og flavonoider. Disse forbindelser fungerer som antioxidanter og kan hjælpe kroppen med at fjerne frie radikaler, bremse hudens aldring og dermed forbedre teint.

For det andet indeholder Cistanche også en række aminosyrer, mineraler og vitaminer, som er meget gavnlige for hudreparation og regenerering. Cistanche kan fremme metabolismen af ​​hudceller, forbedre hudens selvreparerende evne og genoprette huden til en sund farve.

Endelig indeholder Cistanche også nogle organiske syrer og basiske stoffer, og disse ingredienser har også en vis effekt på konditioneringen og omsætningen af ​​hudens neglebånd. Disse stoffer kan effektivt afbalancere hudens pH-værdi, forbedre tykkelsen af ​​stratum corneum og gøre huden mere gennemskinnelig og sart.

Klik hvor du kan købe cistanche

1. Introduktion

Amana edulis (A. edulis; Miq.) Honda, syn. Tulipa edulis (Miq.) Baker tilhører Liliaceae-familien og er en folkemedicinsk plante, der bruges til at behandle kræftsygdomme [1,2]. Der har dog været få fytokemiske og biologiske undersøgelser af denne art rapporteret til dato.

For eksempel kunne 95 procent og 50 procent EtOH-ekstrakter inducere apoptose i henholdsvis humane gastriske (SGC7901) [1] og hepatom (BEL7404, HepG2 og Huh7) [2] karcinomceller. Polysacchariderne fremstillet af A. edulis har antioxidantegenskaber, herunder DPPH, OH− og ABTS plus rensende aktiviteter [3-5]. I forskning af nye midler fra naturlige produkter til hudlidelser, fandt vi ud af, at MeOH-ekstrakterne af løgene fra A. edulis viser potentiel melanogeneseregulering, som endnu ikke er blevet undersøgt. Når den udsættes for ultraviolet stråling fra sollys eller skadelige kemikalier og patogene faktorer, kan moderat melanogenese beskytte vores hud mod generering af reaktive iltarter i keratinocytter og melanocytter [6]. Tyrosinase er et vigtigt enzym i melanogenese for at producere mere melanin, så vi kan forsvare os mod de førnævnte farlige forhold [7].

Derfor er de aktive komponenter i A. edulis værdige til at blive godkendt til yderligere medicinske anvendelser. I denne undersøgelse blev tre nye tulipansider H–J (1–3) og 11 kendte forbindelser (4–14) (figur 1) isoleret fra A. edulis og strukturelt identificeret ved NMR, MS og IR spektroskopiske data, optisk rotation eller Mosher-esterreaktion. Forbindelse 9 kunne reducere melaninindholdet, men være cytotoksisk over for B16-melanomceller. Forbindelser 4, 6, 10 og 12 havde øget melaninproduktion og tyrosinaseaktiviteter. Samlet set viste dette arbejde, at A. edulis og dets aktive komponenter kunne være nye midler til melanin-relaterede sygdomme, såsom melanom og hypopigmentering (hudvitiligo eller hårblegning).

2. Resultater og diskussion

2.1. Strukturbelysning af isolater 1–3

MeOH-ekstraktet (TEM) af løgene fra A. edulis blev delt i EtOAc-opløselige (TEE), n-BuOH-opløselige (TEB) og HO-opløselige (TEW) fraktioner separat. Brøken. virkningen af ​​TEE- og TEB-ekstrakterne gav nye isoprenoidglycosider 1-3 og kendte forbindelser 4-14 (figur 1). Derudover var hovedkomponenterne i TEW-ekstraktet kulhydrater.

HRESIMS (høj opløsning elektrospray ionisering massespektrometri) på 1 viste en (M - H- ion ved m/z 351.1652, hvilket indikerer en molekylær formel for CsH2gOg (beregnet for C;5HoOg; 351.1655) og to grader af umættet IR. viste absorptioner for hydroxyl- (3376 cm-l) og carbonyl- (1725 cm-l) funktionaliteter. Femten carbonsignaler, herunder to methyler, fem methylener, syv methiner og en kvaternær carbon, blev observeret i den endimensionelle (1D) NMR spektre på 1 (tabel 1). Det kvaternære carbon blev identificeret som et carbonylcarbon baseret på det kemiske skift 6c 176,6. 1D og HSOC (heteronuclear single quantum coherence) NMR-spektre viste én anomerisk (0/8c: 4,27 (d, J=8.0 Hz)/1{{30}}4,9), fem oxymetholone (0h/8c: 3,21(t, J { {34}}.0 Hz)/75.1, 3.28 (overlap)/71.6, 3.28 (overlap)/78.0, 3.35 (t, J=8.{{67} } Hz)/77,9 og 3,89 (td, I=7.0, 2,5 Hz)/73,6), og tre oxymethylen (6,/6c: 3,57 (dd, J {{64} }.5, 7.0 Hz)4.01 (dd, I {{70}}.5, 2.5 Hz)/73.1, 3.66 (dd, I { {78}},0, 5,0 Hz), 3,85 (brd, I=12,0 Hz)/62,7 og 4,10 (2H, t, J=7,5 Hz)/65,5) signaler. HMBC-korrelationerne (heteronuclear multiple bond correlation) (figur 2) af forbindelse 1 ved methinprotonerne H-2 (8 2.67, kvint med C-1 (6 176. 6)/C-3 (6 73.6)/C-4 (6 73.1)/C-5 (6 13,9) , H-3 (6 3.89, td) med C-1/C-2(6 44.6)/C-4/C -5, H-1' (6 4.27, d) med C-4 og methylprotonerne H-5 (8 1.14 , d) medC-1/C-2/C-3 foreslog, at methyl- og hydroxyldelene var placeret ved henholdsvis C-2 og C-3. Derudover methylenprotonerne ved H,-1" (8 4.10, t) og H-4 (6 3.57dd; 4.01, dd) udviste 3 interaktioner med C{{ 142}} og C-1' (8 104.9), henholdsvis i HMBC-spektret (figur 2), der understøttede tildelingerne af n-butylgruppen ved C-1 og én beta -glukose (H-1', 8 4.27, d, J=8.0 Hz) ved C-4 8].

Figur 2 viser centrale COZY- og HMBC-korrelationer observeret for 1. De relative konfigurationer ved C-2 og C-3 (3-hydroxy-2-methyldel) af 1 kunne bestemmes anti -form ved 3 JH2-H3-værdien af ​​7.0 Hz (antiform: 7.0 Hz; syn-form: 4.0 Hz) [ 9]. For at bestemme den absolutte konfiguration blev forbindelse 1 behandlet separat med (R)- og (S)- -methoxy- -(trifluormethyl)-phenylacetylchlorid [(R)- og (S)-MTPA- Cl] i nærvær af pyridin-d5 for at opnå (S)- og (R)-MTPA-esterne (henholdsvis la og 1b). MTPA-esterne blev genereret med succes ved C-3 og C-20/C-30/C-40, som belyst ud fra 1H NMR og 1H-1H COSY spektre (1a, H-3, δ 5,82, m; H-20, δ 5,70, t, J=9,5 Hz; H-30, δ 4,39, t, J=9,5 Hz; H-40, δ 5,76, t, J=9,5 Hz; 1b, H-3, δ 5,81, m; H{{64 }}, δ 5,56, t, J=9,5 Hz; H-30, δ 4,12, t, J=9,5 Hz; H-40, δ 5,66, t, J=9,5 Hz). Forskellene mellem 1H NMR kemiske skift for 1a og 1b (∆ værdier vist i figur 3) førte til tildelinger af S- og R-konfigurationer ved henholdsvis C-3 og C-2. Som følge heraf blev forbindelse 1 belyst som butyl 4- -D-glucopyranose-(S)-3-hydroxy-(R)-2-methylbutanoat og benævnt tulipanside H.

Forbindelse 2, tulipanside I, gav molekylformlen, C15H28O8, fastsat af HRESIMS (m/z 359,1686 [M plus Na] plus, beregnet for 359,1682). 1D NMR-spektrene for 2 svarede også til dem for 1, bortset fra det faktum, at de kemiske skift af methylensignalet δH 1,65 (sext, J=7.0 Hz) og 1,96 (sext, J=7.0 Hz)/δC 34,6 blev identificeret i stedet for én methin ved C-3 af 1 (tabel 1). Baseret på COSY- og HMBC-dataene (figur 2) blev forbindelse 2 postuleret til at være sammensat af en isoprenoid, en glucose og n-butylgrupperne. HMBC 3 J-korrelationerne af H2-1" (δ 4.04, 2H, t, J=7.5 Hz/δC 65.4) med C-1 (δ 178,5) og H-10 (δ 4,19, d, J=8,0 Hz/δC 104,4) med C-4 (δ 68,4) antydede, at n-butylgruppen og en -glucose del [8] var forbundet ved henholdsvis C-1 og C-4 (figur 2). Nøgle-HMBC- og COSY-korrelationer er vist i figur 2. R-konfigurationen af ​​H3-5 ved C-2 af 2 blev bestemt ved syrehydrolyse af 2 for at give den tilsvarende tulipalinforbindelse, 3-methyldihydrofuran-2(3H)-on (Figur S28) [8] med en positiv optisk rotation værdi ([ ] 23 D plus 18,7, CH2Cl2) (R: [ ] 25 D plus 14,7, CHCl3) [10] Strukturen af ​​forbindelse 2 blev identificeret som butyl 4- -D-glucopyranose-(R){{ 81}}methylbutanoat.

Molekylformlen for 3 blev udledt som C11H20O8 på grund af forekomsten af ​​en [M plus Na] plus ion ved m/z 303,1049 (beregnet for 303,1050) i HRESIMS. Elleve carbonsignaler, herunder en methyl (δ 17,6), tre methylener (δ 34,7, 62,8 og 68,6), seks methiner (δ 37,6, 71,6, 75,1, 77,9, 78,0 og 104,4) og en carbon (δ.6) 1 i 1D NMR-spektrene på 3 (tabel 1). Det kvaternære carbon blev identificeret som et carbonylcarbon baseret på det kemiske carbonskifte ved δ 180,6. Endvidere viste forbindelse 3 lignende spektroskopiske data som dem for 2, bortset fra n-butylsignalerne. I HMBC-spektret (figur S15) udviste den anomere proton ved δ 4,23 (d, J=8,0 Hz) 3 J interaktion med C-4 (δ 68,6), hvilket førte til -glucose lokaliseret ved C-4. Nøgle HMBC- og COSY-forbindelser er vist i figur 2. Forbindelse 3 blev ikke isoleret i en tilstrækkelig mængde til at bestemme den absolutte konfiguration ved C-2. Endelig blev tulipanside J (3), 4- -D-glucopyranose-(R)-2-methylbutansyre, identificeret på grund af de ovennævnte strukturelle belysninger af 1 og 2 i denne undersøgelse.

Forbindelser 1-3 er tulipansider, en slags specialiseret produkt bestående af 4-hydroxy2-methylenbutansyre (HMBA) og/eller (3S)-3,4-dihydroxy -2-methylenbutansyre (DHMBA)-grupper acyleret ved C-1- og/eller C-6-positioner af en -D-glucose (Glc), der hovedsageligt findes i slægten Tulipa [8,11] . Indtil videre har tulipansideanaloger, inklusive 1-tulipanside A, 6-tulipanside A, 1-tulipanside B, 6-tulipanside B og tulipanside D–G , er blevet isoleret fra Tulipa [8,11]. Strukturen af ​​tulipanside C er dog ikke blevet rapporteret og kan mangle i tidligere litteratur [11]. Tulipaliner, såsom tulipalin A og (–)-tulipalin B, er aglycondelene af tulipansider, som spontant lactoner efter frigivelse af HMBA- og/eller DHMBA-grupper ved hjælp af tulipansidekonverterende enzymer [8,11]. I denne undersøgelse tilhører forbindelser 1-3 kaldet tulipansider H-J til tulipansider, men deres dobbeltbindinger ved C-2 blev reduceret, og -D-glucosegrupperne blev knyttet til C-4 (oxymethylen) ), i stedet for C-1 (O-acylfunktionalitet) i HMBA eller DHMBA (figur 1). Derudover er forbindelse 10 (2S,3S) tulipalin, men kunne ikke metaboliseres fra 1 (2R,3S) på grund af de forskellige konfigurationer ved C-2. De mulige biosynteser af tulipansider 1-3 er vist i figur S29 [8,11].

Derudover blev 11 kendte forbindelser inklusive tre pyroglutaminsyreanaloger (4-6), tre citronsyrederivater (7-9), to furanon (10-11), en furan (12) og to steroider (13-14) isoleret fra A. edulis for første gang. Forbindelser 1-9 og 10-14 blev opnået fra henholdsvis TEB- og TEE-råfraktioner. De blev identificeret som (plus)-pyroglutaminsyre (4) [12], (plus )-methyl 5-oxopyrrolidin-2-carboxylat (5) [12], (plus)-butyl {{23 }}oxopyrrolidin-2-carboxylat (6) [12], 1-butylcitrat (7) [13], 1,10 -dibutyl 5-methylcitrat (8) [ 13], tributylcitrat (9) [13], (–)-3-hydroxy-2-methylbutyrolacton (10) [14-16], (–)-methyl 3-hydroxy{{ 44}}oxo-tetrahydrofuran-3-carboxylat (11) [17], 5-(hydroxymethyl)furfural (12) [18], sitosterol (13) [19] og sitosterol-3- -D -glukose (14) [20] fra de spektroskopiske data og sammenlignet med litteraturen.

2.2. Kemiske komponenter Belysning af TEW

1H og 13C NMR-spektrene for TEW, en vandopløselig rå fraktion fra TEM-ekstrakt, viste sig meget lig kulhydraternes (figur S16 og S17). Polysaccharider fremstillet fra denne art er blevet rapporteret at besidde rhamnose, xylose, arabinose, galactose, mannose, glucose og fructose efter monosaccharidanalyse [3,8]. NMR-spektroskopiske data og TLC-retentionsfaktoren (tyndtlagskromatografi) for TEW sammenlignet med sukkerstandarderne (figur S18-S23) antydede, at D-glucose og D-fructose var hovedkomponenterne i TEW-ekstrakter.

2.3. Virkninger af ekstrakter og isolater på melanogenese

MeOH-ekstraktet (TEM) af denne art blev adskilt i TEE-, TEB- og TEW-råfraktioner, og de førnævnte fire ekstrakter blev evalueret for cytotoksicitet og melanogeneseeffekter i B16-melanomceller ved koncentrationer fra 12,5 til 200 µg/ml (figur S24) . TEE viste tydelig cytotoksicitet over for B16 ved 200 µg/mL, og TEB samt TEW havde cytotoksiske aktiviteter ved koncentrationer fra 12,5 til 200 µg/mL (figur S24A-1, B-1, C{{13} }, D-1). I bioassayet blev -melanocytstimulerende hormon (-MSH) brugt til at aktivere B16-celler for at syntetisere mere melanin, og TEM kunne moderat stimulere melanogenese (figur S24A-2).

De fleste af alle isolater (figur 1), med undtagelse af 13 og 14, blev yderligere analyseret for regulering af melanogenese-effekter ved koncentrationer fra 10 til 40 µM, med arbutin anvendt som en positiv kontrol (figur 4). Som vist i figur 4 hæmmede forbindelse 9 åbenlyst og dosisafhængigt melaninproduktion, der var et resultat af cytotoksicitet over for B16-celler med en IC50-værdi (halv maksimal inhiberende koncentration) på 81,9 µM (figur S25). Isolater 4, 6, 10 og 12 øgede melaninindholdet dosisafhængigt op til de maksimale procentdele på henholdsvis 11,9 procent, 29,8 procent, 27,2 procent og 17,6 procent ved 40 µM uden cellulær toksicitet. Tyrosinase spiller en nøglerolle i de første to trin af melanogenese [6]; derfor blev virkningerne af forbindelser 4, 6, 10 og 12 på intracellulær tyrosinase evalueret yderligere. -MSH øgede tyrosinaseaktiviteten op til 254,3-305,5 procent sammenlignet med kontrolgruppen (100 procent) (figur 5 og tabel S1).

Som følge heraf øgede 4 (14,1-21,9 procent), 6 (15,8-21,9 procent), 10 (8,5-13,1 procent) og 12 (7,5-11,8 procent) moderat aktiviteten af ​​enzymet tyrosinase på en dosisafhængig måde ved koncentrationer på 10 til 40 µM sammenlignet med -MSH-gruppen (figur 5 og tabel S1). En korrelationsgraf mellem det cellulære melaninindhold og virkningerne på tyrosinasen af ​​forbindelser 4, 6, 10 og 12 er vist i figur S26. For at bekræfte de melanogenese-inducerende virkninger af 4, 6, 10 og 12 blev hver forbindelse endvidere tilsat i B16-celler uden co-behandlet -MSH, der blev brugt som en positiv kontrol i denne analyse (figur S27). Som følge heraf øgede individer 4, 6, 10 og 12 ikke melaninproduktion alene (figur S27) svarende til dem, der er vist i figur 4. Det blev foreslået, at de ovennævnte fire forbindelser blot kunne øge melanogenesevirkningerne af -MSH. Følgelig yderligere signalveje i melanogenese, såsom tyrosinase-relateret protein-1 (TRP-1), TRP-2, mikrophthalmi-associeret transkriptionsfaktor, melanocortin 1-receptor, cyklisk adenosinmonofosfat, protein kinase A, cAMP-respons element-bindende protein, c-Jun N-terminale kinaser, ekstracellulær signalreguleret kinase, p38 og phosphoinositide 3-kinase/proteinkinase B [7,21], bør yderligere testes og bekræftes for disse aktive komponenter.

3. Materialer og metoder

3.1. Generelle eksperimentelle procedurer

NMR-spektre blev målt på et Bruker Avance Ill 500 MHz instrument (BrukerBillerica, Amerika) for 1H og 125 MHz for 13C-NMR. Værdierne for kemisk skift (0) var i ppm, og koblingskonstanter () var i Hz med CD; OD, CDCI og/eller D, O blev anvendt som opløsningsmidler. Optiske rotationer blev opnået på et JASCO-P-2000 polarimeter (JASCO, TokyoJapan) (cellelængde 10 mm). IR-spektre blev optaget på et PerkinElmer Spectrum TwoFT-IR-spektrometer (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Lav- og højopløsnings ESIMSelectrospray ioniserings massespektrometri) blev målt på henholdsvis et Bruker Daltonics EsquireHCT ultra højkapacitets fældemassespektrometer og et Orbitrap massespektrometer (LIOOrbitrap XL, Thermo Fisher Scientific). TLC blev udført på Kieselgel60 F254 (0,25 mm; Merck) og/eller RP-18 F254S (0,25 mm; Merck), coatede plader og derefter farvet ved sprøjtning med 5 procent (o/u) svovlsyre syre i en MeOH-opløsning og opvarmning på en varmeplade. Silicagel (Silicycle: 70 230 og 230 400 mesh), RP-18 (LiChroprepe 4063 um: Merck. Sephadexn C20 CE episode 0 pe open w Bre application foSupelcoTM, Bellefonte) og MCI CHP20P (SupelcoTcolumn chromatography. En Shimadzu LC-20AT-pumpe og en Shimadzu RID-10En brydningsindeksdetektor (Shimadzu Inc, Kyoto, Japan) sammen med en Cosmosil 5C18-MS-II ( 250 x 10 mm id, 5 um) søjle med en strømningshastighed på 2,0 ml/min blev brugt til HPLC Sukkerreagenser inklusive D-glucose (MP Biomedicals, LLC, Illkirch, Frankrig) og D-fructose (TCI, Tokyoapan) blev bruges til analyse af vandopløselig råfraktion (TEW).

3.2. Plantemateriale

Tørre løg af A. edulis (tidligere T. edulis) blev købt fra et traditionelt kinesisk medicinapotek i Taichung, Taiwan, i september 2018 og identificeret af forfatteren Prof. Chang. En kuponprøve (TE201809) blev deponeret på Chinese Medicine Research and Development Center, CMUH Taiwan.

3.3. Udvinding og isolering

Løgerne af A. edulis (5,0 kg) blev ekstraheret otte gange med MeOH (8,0 L hver) ved stuetemperatur for at opnå et råekstrakt. MeOH-ekstrakten (TEM, 525.0 g) blev delt tre gange mellem ethylacetat (EtOAc) og H2O (1500:1500, v/v) for at give et EtOAc -opløselig fraktion (TEE, 45,0 g) og en vandig fase, som blev yderligere delt med n-BuOH/H2O (1500:1500, v/v × 3) og derefter separeret i n-BuOH-opløselig (TEB, 53,6 g) ) og H2O-opløselige (TEW, 410,0 g) fraktioner.

TEE blev udsat for åben søjlekromatografi på en silicagel ({{0}}.063–0.200 mm, søjle: 7 × 26 cm, diameter × længde), ved hjælp af gradienter af hexan–EtOAc–MeOH (3{{20}}:1:0; 1:1:0; { {67}}:0:1, v/v/v) og gav 14 underbrøker (TEE1–TEE14). Præcipitat 14 (249,0 mg; isolationsudbytte: 0.{{100}}0498 procent) opnået fra underfraktion TEE12 (2,2 g) blev filtreret og vasket med MeOH. TEE9 (3,6 g) blev fraktioneret i syv underfraktioner (TEE9-1 til 9-7) med silicagel (søjle: 5 × 24 cm; CH2Cl2-MeOH, 7:1; 1:1; 0:1 , v/v), med underfraktion TEE9-4 (1,1 g), og derefter udsat for Sephadex LH-20-søjlekromatografi (søjle: 5 × 54 cm; CH2Cl2-MeOH, 1:1 til 0: 1, v/v), for at give syv underbrøker (TEE9-4-1 til 9-4-7). TEE9- 4-5 og TEE9-4-6 blev kombineret (i alt 551,7 mg) og gentagne gange oprenset med RP-HPLC (MeOH-H2O, 45:55; 20:80, v/v) for at give 12 (21,0 mg) ; tR=13 min; isolationsudbytte: 0,00042 procent) og en moderlud (131,2 mg), som yderligere blev underkastet RP-HPLC (MeOH-H2O; 10:90, v/v) for at give forbindelser 10 ( 35,5 mg; tR=13 min; isolationsudbytte: 0,00071 procent) og 11 (1,2 mg; tR=15 min; isolationsudbytte: 0,000024 procent). Fraktion TEE6 (2,7 g) blev isoleret med Sephadex LH-20 (søjle: 2,5 × 45 cm; CH2Cl2-MeOH, 1:1; 0:1, v/v) for at få 13 (6,8 mg; isolationsudbytte: 0,000136 procent).

TEB blev kromatograferet over en Diaion HP{{0}} kolonne (6 × 60 cm; H2O–MeOH– acetone, 100:{{15} }:0; 25:75:0; 50:5{{20}}:0; 75:25:{{41 }}; 0:10{{70}}:{{90}}; {{1{{105} }0}}:0:100, v/v/v) for at give seks underbrøker (TEB1–TEB6). Subfraktion TEB5 (502.0 mg) blev oprenset ved RP-HPLC (MeOH–H2O, 85:15, v/v) for at opnå forbindelser 8 (9,3 mg; tR {{34} } min; isolationsudbytte: 0.000186 procent ) og 9 (144,2 mg; tR {{4{{2{{2{{218} }9}}3}}}} min; isolationsudbytte: 0,002884 procent). Fraktion TEB3 (5,5 g) blev underkastet RP-18-kromatografi (søjle: 7 × 25 cm; MeOH–H2O, 1:1; 1:0, v/v) og subfraktion TEB3-6 ( 1,0 g) blev yderligere isoleret med Sephadex LH-20 (søjle: 5 × 54 cm; MeOH) for at opnå syv underfraktioner (TEB3-6-1 til 3-6-7). TEB3-6-4 (377,1 mg) blev adskilt ved MCI-gelkromatografi (søjle: 2,5 × 23 cm; H2O-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 40:60; 20:80; 0: 100, v/v) for at give syv underbrøker (TEB3-6-4-1 til 3-6-4-7). TEB3-6-4-4 (38,1 mg) blev oprenset ved RP-HPLC (MeOH-H2O, 45:55 i 0,1 procent myresyre, v/v) for at give ren 1 (12,2 mg; tR=17 min; isolationsudbytte: 0,000244 procent). Derudover blev TEB3-6-4-6 (31,0 mg) udført med RP-HPLC (MeOH-H2O, 40:60 i 0,1 procent myresyre, v/v) for at give 6 (7,1 mg; tR=28 min. isolationsudbytte: 0,000142 procent). TEB3-6-5 (410,7 mg) blev isoleret ved MCI-gelkromatografi (søjle: 2,5 × 23 cm; H2O-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30: 70; 20:80; 0:100, v/v) for at give otte underbrøker (TEB3-6-5-1 til 3-6-5-8). TEB3-6-5-3 (75,1 mg) blev oprenset ved MCI-gelkromatografi (søjle: 1 × 20 cm; H2O-MeOH, 80:20; 70:30; 0:100, v/v) for at give forbindelse 4 (59,3) mg; isolationsudbytte: 0,001186 procent) og 5 (10,2 mg; isolationsudbytte: 0,000204 procent). Subfraktion TEB3-6-5-4 (97,0 mg) blev oprenset ved RP-HPLC (MeOH-H2O, 40:60 i 0,1 procent myresyre, v/v) for at opnå 7 (46,4 mg; tR=18 min; isolationsudbytte: 0,000928 procent). TEB3-10 (925,4 mg) blev kromatograferet over en MCI-gelkromatografi (søjle: 2,5 x 28 cm; H2O-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30 :70; 10:90; 0:100, v/v) for at give otte underfraktioner (TEB3-10-1 til 3-10-8) og ren 2 (393,4 mg; isolationsudbytte: 0,007868 procent). Forbindelse 3 (6,3 mg; tR=8 min; isolationsudbytte: 0,000126 procent) blev opnået fra TEB3-10-2 (20,9 mg) ved RP-HPLC-oprensning (MeOH-H2O, 30:70 i 0,1 procent myresyre syre, v/v).

3.3.1. Tuliposid H (1)

[]23D -23,1 (c 0.12, MeOH); IR (ren) νmax 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C=O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 10415, 10415 (C) C), 926, 900, 632, 521 cm-1; 1H og 13C NMR spektroskopiske data, se tabel 1; HRESIMS m/z 351,1652 [M-H]- (beregnet for C15H27O9, 351,1655).

3.3.2. Tuliposid I (2)

[]23D -25,8 (c 0.2, MeOH); IR (ren) νmax 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 10377 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 10377 (C C), 897, 736, 625, 517 cm-1; 1H og 13C NMR spektroskopiske data, se tabel 1; HRESIMS m/z 359,1686 [M plus Na] plus (beregnet for C15H28O8Na, 359,1682).

3.3.3. Tuliposid J (3)

[ ] 23 D plus 9. 0 (c 0.1, MeOH); IR (ren) vmax 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C=O), 1632, 1441, 1401 (C-O-C), 1284, 1205, 11202, 1 , 1078, 1039, 893, 768, 721 cm-1; 1H og 13C NMR spektroskopiske data, se tabel 1; HRESIMS m/z 303,1049 [M plus Na] plus (beregnet for C11H2008Na, 303,1050).

3.4. (R)- og (S)-MTPA-derivater af 1

Fremstillingen af ​​(S)-MTPA-esterderivatet af 1 blev udført ved en passende Mosher-esterprocedure [22,23]. Forbindelse 1 (3,4 mg, 0.01 mmol) blev overført til et rent NMR-rør og derefter tørret fuldstændigt under vakuum, før det var fyldt med nitrogen. Desuden C5D5N ({{20}},5 ml) og (R)-(−)- -methoxy- -(trifluormethyl)-phenyl-acetylchlorid (MTPA-chlorid, 12,2) mg, 0,05 mmol) blev straks tilsat til det forseglede NMR-rør, der blev rystet yderligere forsigtigt for at blande prøven og MTPA-chlorid. 1H NMR- og 1H-1H COSY-spektrene for blandingen efter reaktion i 24 timer ved stuetemperatur blev registreret. (R)-MTPA-esteren af ​​1 blev også fremstillet på lignende måde ved den førnævnte fremgangsmåde. Forbindelse 1: 1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0,78 (H-400, t), 1,26 (H-300, sekst), 1,28 (H3-5, d), 1,52 ( H-200, kvint), 3,08 (H-2, kvint), 3,95 (H-50, m), 4,03 (H-4a, dd), 4,05 (H -20, overlap), 4,15 (H-100, t), 4,23 (H-30, overlap), 4,23 (H-40, overlap), 4,36 (H{{ 68}}a, dd), 4,39 (H-3, overlap), 4,43 (H-4b, dd), 4,53 (H-60b, d) og 4,95 (H -10, d).

3.4.1. (S)-MTPA Ester af 1 (1a)

1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0,77 (H-400, t), 1,17 (H-300, sekst), 1,21 (H3-5, d) , 1,37 (H-200, kvint), 3,18 (H-2, kvint), 3,92 (H-100, t), 3,97 (H-4a, dd), 4,33 (H-50, m), 4,39 (H-30, t), 4,49 (H-4b, brd), 4,64 (H-60a, dd), 4,96 (H-10, d), 5,05 (H-60b, d), 5,70 (H-20, t), 5,76 (H-40, t) og 5,82 (H-3, m).

3.4.2. (R)-MTPA-ester af 1 (1b)

1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0,79 (H-400, t), 1,26 (H-300, sekst), 1,30 (H3-5, d) , 1,50 (H-200, kvint), 3,33 (H-2, kvint), 3,60 (H-50, m), 3,94 (H-4a, dd), 4,11 (H-100, t), 4,12 (H-30, t), 4,13 (H-60a, dd), 4,50 (H-4b, brd), 4,70 (H-10, d), 4,85 (H-60b, d), 5,56 (H-20, t), 5,66 (H-40, t) og 5,81 (H-3, m).

3.5. Syrehydrolyse af Tuliposid I (2)

Isolat 2 (78,6 mg) blev hydrolyseret i 1 M HCI (1,5 ml) ved 1 00 ◦C i 2 timer [8]. Efter afkøling blev reaktionsblandingen ekstraheret med CH2Cl2 (2,0 ml x 3) for at give tulipalinanalog, 3-methyldihydrofuran-2(3H)-on (11,1 mg). []23D plus 18,7 (c 1,1, CH2Cl2); 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 1,30 (3H, d, J=7,0 Hz), 1,94 (m), 2,45 (m), 2,61 (m), 4,20 (ddd, J {{43} },8, 6,8, 6,4 Hz), 4,33 (ddd, J=8,8, 8,8, 2,8 Hz). 13C NMR (CDCI3, 100 MHz) 5 15,2, 30,7, 34,1, 66,2, 180,1 (figur S28); ESIMS m/z 101,06 [M plus H] plus.

3.6. Cellekultur

De murine B16 melanomceller blev dyrket i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; GIBCO Invitrogen corporation, New York, NY, USA) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum, 100 U/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycin ved 37 ◦C i en 5 procent CO2 inkubator.

3.7. Måling af B16-cellelevedygtighed

Cytotoksiciteten af ​​B16-celler for testforbindelserne blev målt ved MTT med en tidligere beskrevet protokol med små modifikationer [6]. Cellerne blev podet i 96-brøndsplader (1 × 103 celler/brønd) og dyrket i 24 timer før de blev behandlet med forbindelser i yderligere 72 timer. Derefter blev mediet fjernet, 100 µL MTT-reagens (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) (ved den endelige koncentration på 0,5 mg/ml) blev tilsat til hver brønd og derefter inkuberet ved 37 ◦C i 1 time. Formazankrystallen blev opløst i 100 µL DMSO, og den optiske densitet blev målt ved anvendelse af en mikropladelæser (SPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Tyskland) ved 570 nm.

3.8. Måling af melaninindhold i B16-celler

Melaninindholdet i B16-celler blev analyseret efter en tidligere beskrevet metode med små modifikationer [6]. Cellerne blev podet med en tæthed på 5 x 103 celler/brønd i 24-brøndsplader i 24 timer. Mediet blev erstattet af et 500 µL frisk dyrkningsmedium indeholdende 0,5 µM -MSH med eller uden forbindelser i 72 timer. Arbutin (1 mM) blev anvendt som den positive kontrol. Derefter blev mediet fjernet og vasket med PBS (pH 6,8) to gange. Cellerne blev høstet med NaOH (200 µL, 2 N) og derefter opvarmet ved 85 ◦C i 30 min. Efter afkøling til stuetemperatur og centrifugering blev absorbansen målt ved 405 nm under anvendelse af en mikropladelæser.

3.9. Intracellulær tyrosinaseaktivitet

Intracellulær tyrosinaseaktivitetsanalyse blev udført ved en let modificeret metode, som tidligere blev rapporteret [6]. Cellerne blev podet i 24-brøndsplader ved en tæthed på 5 × 103 celler/brønd i 24 timer. Cellerne blev behandlet i DMEM indeholdende 0,5 µM -MSH med eller uden forbindelser i 72 timer. Efter fjernelse af mediet blev cellerne vasket med kold PBS (pH 6,8) to gange. Cellerne blev lyseret med 100 µL lyseringsbuffer (1 procent triton X-100 i PBS) og frosset ved -80 ◦C i 15 min.

Derefter blev cellelysaterne centrifugeret ved 13.200 x g ved 4 ◦C i 30 minutter for at opnå supernatanten. Det totale proteinindhold i supernatanten blev kvantificeret ved BCA-proteinassay. Derefter blev hvert kvantificeret lysat (30 µg/90 µL) blandet med 10 µL L-DOPA (15 mM) i en 96-brøndsplade og derefter inkuberet ved 37 ◦C i 1 time, og absorbansen blev målt ved 405 nm ved hjælp af en mikropladelæser.

4 konklusioner

Samlet set blev 14 rene forbindelser, inklusive tre nye isoprenoidglykosider og tulipansider H-J (1-3), isoleret fra A. edulis. Citronsyrederivat 9, tributylcitrat, havde signifikant anti-melanogenese-aktivitet, men viste cytotoksicitet over for B16-melanomceller, der kunne undersøges yderligere for anti-melanom-lægemidler. Mens pyroglutaminsyreanalog 4 og 6, furanon 10 og furan 12 havde dosisafhængigt øget melaninindhold og aktiveret tyrosinase, der kunne undersøges yderligere for vitiligo hudsygdom eller anti-blegnings- og antihypopigmenteringsmidler til hår. In vitro mekanismer og/eller in vivo undersøgelser er imidlertid nødvendige for at blive undersøgt mere detaljeret for at verificere effektiviteten af ​​de aktive komponenter.

Supplerende materialer:

Følgende er tilgængelige online, figur S1-S5: NMR-spektraldata for forbindelse 1, figur S6-S10: NMR-spektraldata for forbindelse 2, figur S11-S15: NMR-spektraldata for forbindelse 3, figur S16-S22: NMR-spektraldata af TEW, Figur S23: TLC-analyse af TEW, Figur S24: Cytotoksicitet og reguleringen af ​​melanogeneseeffekter af TEM, TEE, TEB og TEW, Figur S25: Cytotoksicitetsdata for forbindelser 1-12, Figur S26: En korrelationsgraf mellem cellulære melaninindhold og virkningerne på tyrosinase af forbindelser 4, 6, 10 og 12, Figur S27: Melanogenesevirkninger af forbindelser 4, 6, 10 og 12 alene uden -MSH, Figur S28: NMR-spektrale og optiske rotationsdata for produkt opnået ved syrehydrolyse af forbindelse 2, figur S29: Mulig biosyntese af forbindelser 1−3, tabel S1: Tyrosinaseaktivitetseffekter af forbindelser 4, 6, 10 og 12.

Forfatterbidrag:

Konceptualisering, C.-LL; plantemateriale identifikation, Y.-SC; udførelse af isolering og oprensning, C.-LL og Z.-AG; udførelse af bioassays, Y.-LJ; al spektralanalyse og strukturbestemmelse, C.-LL og C.-JC; skrivning af det originale udkast til forberedelse, C.-LL Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering:

Denne forskning blev finansieret af ministeriet for videnskab og teknologi (MOST 108-2320-B039-035-) og China Medical University (CMU108-MF-84), Taiwan. APC blev finansieret af "Chinese Medicine Research Center, China Medical University" fra The Featured Areas Research Center Program inden for rammerne af Higher Education Sprout Project af Undervisningsministeriet (MOE) i Taiwan (CMRC-CHM{{5} }).

Udtalelse fra det institutionelle revisionsudvalg:

Ikke anvendelig.

Erklæring om informeret samtykke:

Ikke anvendelig.

Erklæring om datatilgængelighed:

Ikke anvendelig.

Anerkendelser:

Dette arbejde blev økonomisk støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MOST 108-2320-B-039-035-) og China Medical University (CMU108-MF-84), Taiwan, samt "Chinese Medicine Research Center, China Medical University" fra The Featured Areas Research Center Program inden for rammerne af Higher Education Sprout Project af Undervisningsministeriet (MOE) i Taiwan (CMRC-CHM-1) tildelt til C .-LL

Interessekonflikt:

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Eksempel tilgængelighed:

Prøver af forbindelser 1-14 er tilgængelige fra forfatterne.

Referencer

1. Lin, R.; Li, Z.; Lin, J.; Ja, J.; Cai, Q.; Chen, L.; Peng, J. Ethanolisk ekstrakt af Tulipa edulis Bak inducerer apoptose i SGC-7901 humane gastriske carcinomceller via den mitokondrielle signalvej. Oncol. Lett. 2015, 10, 2371-2377. [CrossRef] [PubMed]

2. Fan, Y.; Hou, X.; Guo, P.; Lv, X.; Zhao, L.; Wang, H.; Zhou, L.; Feng, Y. Ekstraktion af Amana edulis inducerer leverkræftapoptose. Evid.-baseret komplement. Altern. Med. 2018, 2018, 3927075. [CrossRef] [PubMed]

3. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Fysisk-kemisk og antioxidant potentiale af polysaccharider sekventielt ekstraheret fra Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 131, 453-460. [CrossRef]

4. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ De rheologiske egenskaber og emulgerende adfærd af polysaccharider sekventielt ekstraheret fra Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 137, 160-168. [CrossRef]

5. Cao, YY; Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Hu, F.; Zhang, JG; Wei, ZJ Effekter af sulfaterede, phosphorylerede og carboxymethylerede modifikationer på antioxidantaktiviteterne in vitro af polysaccharider sekventielt ekstraheret fra Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2020, 146, 887-896. [CrossRef]

6. Lai, KY; Hu, HC; Chiang, HM; Liu, YJ; Yang, JC; Lin, YA; Chen, CJ; Chang, YS; Lee, CL Nye diterpenes leojaponins G−L fra Leonurus japonicus. Fitoterapia 2018, 130, 125−133. [CrossRef]

7. Ullah, S.; Chung, YC; Hyun, CG Induktion af melanogenese af fosfomycin i B16F10-celler gennem opregulering af P-JNK og P-p38 signalveje. Antibiotika 2020, 9, 172. [CrossRef] [PubMed]

8. Christensen, LP; Kristiansen, K. Isolering og kvantificering af tulipansider og tulipaliner i tulipaner (Tulipa) ved højtydende væskekromatografi. Kontakt Dermat. 1999, 40, 300-309. [CrossRef]

9. Tripathi, A.; Puddick, J.; Prinsep, MR; Lee, PPF; Tan, LT Hantupeptiner B og C, cytotoksiske cyclodepsipeptider fra den marine cyanobakterie Lyngbya majuscula. Phytochemistry 2010, 71, 307−311. [CrossRef]

10. Qabaja, G.; Wilent, JE; Benavides, AR; Bullard, GE; Petersen, KS Nem syntese af alsidige enantioberigede -substituerede hydroxyestere gennem en Brønsted syrekatalyseret kinetisk opløsning. Org. Lett. 2013, 15, 1266-1269. [CrossRef]

11. Nomura, T.; Kato, Y. Identifikation af tuliposid G, et nyt glucosidester-type tuliposid, og dets fordeling i tulipaner. Z. Naturforsch. CJ Biosci. 2020, 75, 75−86. [CrossRef]

12. Gang, FL; Zhu, F.; Li, XT; Wei, JL; Wu, WJ; Zhang, JW Syntese og bioaktivitetsevaluering af L-pyroglutaminsyreanaloger fra naturligt produkt bly. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 4644-4649. [CrossRef]

13. Vereshchagin, AL; Anikina, EV; Syrchina, AI; Lapin, MF; Azin, LA; Semenov, AA Kemisk undersøgelse af bitterstofferne i frugten af ​​Lonicera caerulea. Chem. Nat. Compd. 1989, 25, 289-292. [CrossRef]

14. Jaime, C.; Ortuño, RM; Font, J. Di- og trisubstituerede -lactoner. En konformationel undersøgelse af molekylære mekaniske beregninger og koblingskonstantanalyse. J. Org. Chem. 1986, 51, 3946-3951. [CrossRef]

15. Larchevêque, M.; Henrot, S. Enantiomert rene, -epoxyestere fra -hydroxylactoner: Syntese af -hydroxyestere og (−)-GABOB. Tetrahedron 1990, 46, 4277−4282. [CrossRef]

16. Jaime, C.; Segura, C.; Dinarés, I.; Font, J. Substituerede -lactoner med nærliggende hydrogenatomer. Konformationsundersøgelse ved MM2-beregninger og koblingskonstantanalyse. J. Org. Chem. 1993, 58, 154-158. [CrossRef]

17. Mori, K.; Fukamatsu, K. En syntese af (1R,5S)-(plus)-frontalin fra (S)-(−)-2-hydroxyparaconsyre. Liebigs Ann. Chem. 1992, 11, 1191−1193.

18. Miyazawa, M.; Anzai, J.; Fujioka, J.; Ishikawa, Y. Insekticide forbindelser mod Drosophila melanogaster fra Cornus officinalis Sieb. et Zucc. Nat. Prod. Res. 2003, 17, 337-339. [CrossRef] [PubMed]

19. Lee, CL; Wang, CM; Hu, HC; Yen, HR; Sang, YC; Yu, SJ; Chen, CJ; Li, WC; Wu, YC Indolalkaloider indigo-doler A–C fra luftdele af Strobilanthes køkken i den traditionelle kinesiske medicin Qing Dai har anti-IL-17 egenskaber. Phytochemistry 2019, 162, 39−46. [CrossRef] [PubMed]

20. Faizi, S.; Ali, M.; Saleem, R.; Irfanullah; Bibi, S. Fuldfør 1H- og 13C-NMR-tildelinger af stigma-5-en-3-O- -glucosid og dets acetylderivat. Magn. Reson. Chem. 2001, 39, 399-405. [CrossRef]

21. Kuo, YH; Chen, CC; Wu, PY; Wu, CS; Sung, PJ; Lin, CY; Chiang, HM N-(4-methoxyphenyl)-caffeamid-inducerede melanogenese-hæmningsmekanismer. BMC komplement. Altern. Med. 2017, 17, 71. [CrossRef] [PubMed]

22. Ohtani, I.; Kusumi, T.; Kashman, Y.; Kakisawa, H. Højfelt FT NMR-anvendelse af Moshers metode. De absolutte konfigurationer af marine terpenoider. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4092-4096. [CrossRef]

23. Lee, CL; Chang, FR; Hsieh, PW; Chiang, MIN; Wu, CC; Huang, ZY; Lan, YH; Chen, M.; Lee, KH; Yen, HF; et al. Cytotoksiske en-abietane diterpener fra Gelonium aequoreum. Phytochemistry 2008, 69, 276−287. [CrossRef] [PubMed]

1 Department of Cosmeceutics, China Medical University, Taichung 406040, Taiwan.

2 Forsknings- og udviklingscenter for kinesisk medicin, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taiwan.

3 Chinese Medicine Research Center, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan.

4 Institut for kinesisk farmaceutisk videnskab og ressourcer til kinesisk medicin, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan.

5 Graduate Institute of Integrated Medicine, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan.

6 Proteomics Core Laboratory, Department of Medical Research, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taiwan.

For more information:1950477648nn@gmail.com