Swertiajaponin hæmmer hudpigmentering ved hjælp af dobbelte mekanismer til at undertrykke tyrosinase del 1

ABSTRAKT

Mange hudblegende forbindelser er rettet mod tyrosinase, fordi det katalyserer to hastighedsbegrænsende trin i melaninsyntesen. Selvom mange tyrosinasehæmmere i øjeblikket er tilgængelige til hudblegningsformål, er der også rapporteret om uønskede bivirkninger. Der er således gjort talrige bestræbelser på at udvikle sikrere tyrosinaseinhibitorer fra naturlige produkter. I tråd med dette testede vi halvtreds flavonoider, en gruppe af naturligt forekommende antioxidanter og metalchelatorer, og screenede swertiajaponin som den stærkeste tyrosinasehæmmer i cellefri eksperimenter. Swertiajaponin viste ikke cytotoksicitet i B16F10-, HaCat- og Hs27-celler og udviste stærk antioxidativ aktivitet i eksperimenter med det cellefrie system og B16F10-celler. Det hæmmede markant MSH- eller UVB-induceret melaninakkumulering i B16F10-celler og undertrykte hudpigmentering i en human hudmodel. Som underliggende mekanismer viste i silico og Lineweaver-Burk plotanalyser, at swertiajaponin direkte kan binde til og hæmme tyrosinaseaktivitet ved at danne multiple hydrogenbindinger og hydrofobe interaktioner med tyrosinases bindende lomme. Derudover indikerede Western blotting-resultater, at swertiajaponin hæmmede oxidativ stress-medieret MAPK/MITF-signalering, hvilket førte til et fald i tyrosinaseproteinniveau. Sammen undertrykker swertiajaponin melaninakkumulering ved at hæmme både aktivitet og proteinekspressionsniveauer af tyrosinase. Således ville det være et nyt tilsætningsstof til blegning af kosmetik.

Nøgleord

swertiajaponin; melanogenese; pigmentering; menneskelig hud; tyrosinase

INTRODUKTION

Hud er et stort sted, hvor melaninpigmenter ophobes. Melaninsyntese og -akkumulering forekommer som en beskyttende mekanisme mod ultraviolet (UV) bestråling. Personer med sort hud har således lavere risiko for hudkræft end dem med bleg hud, fordi de er beskyttet mod de mutagene virkninger af UV [1]. Imidlertid er ukontrolleret melanogenese tæt forbundet med pigmenteringsforstyrrelser, herunder melisma, fregner og senile lentiginer [2]. Derudover resulterer unormale ændringer i hudfarve i ugunstige kosmetiske problemer og forringer i sidste ende livskvaliteten. Forebyggelse af unormal melanogenese har således tiltrukket sig betydelig opmærksomhed for udviklingen af ​​hudblegende kosmetik [3-5].

Melanocytten er den vigtigste celletype, der syntetiserer melanin i hudens epidermis. Efter syntese overfører melanocytter melanin til keratinocytter gennem dendritterne, hvilket fører til hudpigmentering. Melanin kan syntetiseres fra L-tyrosin gennem hydroxylerings- og oxidationsprocesser, hvor en multifunktionel kobberholdig tyrosinase spiller en central rolle i melaninsyntesen. Tyrosinase katalyserer to hastighedsbegrænsende trin i melaninsyntese; mycophenolat-hydroxyleringen af ​​L-tyrosin til 3,4-dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA) og oxidationen af ​​L-DOPA til DOPA-kinin [6, 7]. Derfor er tyrosinaseinhibering en god strategi til at lysne huden, men cytotoksicitet og mangel på stabilitet har begrænset anvendelsen af ​​forskellige tyrosinasehæmmere inden for medicinske produkter og kosmetik. Der er således gjort en uophørlig indsats for at finde sikrere tyrosinasehæmmere med stærkere stabilitet og selektivitet fra naturlige kilder.

For at finde forbindelser til bedre og sikrere blegningseffekter for huden, testede vi halvtreds flavonoider, der er tilgængelige naturligt for deres hæmmende virkninger på tyrosinase og screenede swertiajaponin som den stærkeste tyrosinasehæmmer. Vi undersøgte yderligere dets effekt på hudpigmentering ved hjælp af celle- og humane hudmodeller med forskellige biologiske assays og i silico-analyse.

Cistanche er en almindelig urt, der er kendt som "mirakelurten, der forlænger livet". Dens hovedkomponent er cistanosid, som har forskellige virkninger såsom antioxidant, anti-inflammatorisk og immunfunktionsfremme. Mekanismen mellem cistanche og hudblegning ligger i den antioxidante virkning af cistanche-glykosider.

Klik på Cistanche for at forbedre hudblegning

Spørg for mere:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Melanin i menneskelig hud produceres ved oxidation af tyrosin katalyseret af tyrosinase, og oxidationsreaktionen kræver deltagelse af ilt, så de iltfrie radikaler i kroppen bliver en vigtig faktor, der påvirker melaninproduktionen. Cistanche indeholder cistanosid, som er en antioxidant og kan reducere dannelsen af ​​frie radikaler i kroppen og dermed hæmme melaninproduktionen.

Derudover har cistanche også den funktion at fremme kollagenproduktionen, hvilket kan øge hudens elasticitet og glans og hjælpe med at reparere beskadigede hudceller.

Cistanche Phenylethanol Glycosider har en væsentlig nedregulerende effekt på tyrosinaseaktivitet, og effekten på tyrosinase er vist at være konkurrencedygtig og reversibel hæmning, hvilket kan give et videnskabeligt grundlag for at udvikle og udnytte blegeingredienserne i Cistanche.

Derfor har cistanche en nøglerolle i hudblegning. Det kan hæmme melaninproduktionen for at reducere misfarvning og sløvhed; og fremme kollagenproduktionen for at forbedre hudens elasticitet og udstråling. På grund af den udbredte anerkendelse af disse virkninger af cistanche, er mange hudblegningsprodukter begyndt at tilføre urteingredienser såsom Cistanche for at imødekomme forbrugernes efterspørgsel og dermed øge den kommercielle værdi af Cistanche i hudblegningsprodukter.

Sammenfattende er cistanches rolle i hudblegning afgørende. Dens antioxidantvirkning og kollagenproducerende effekt kan reducere misfarvning og sløvhed, forbedre hudens elasticitet og glans og dermed opnå en blegende effekt. Den brede anvendelse af Cistanche i hudblegningsprodukter viser også, at dens rolle i kommerciel værdi ikke kan undervurderes.

RESULTATER OG DISKUSSION

Swertiajaponin er den stærkeste tyrosinasehæmmer af halvtreds flavonoider

Blandt forskellige naturlige forbindelser har flavonoider, en gruppe af naturligt forekommende antioxidanter og metalchelatorer, været kendt for at undertrykke tyrosinaseaktivitet på grund af deres evne til at danne kobber-flavonoidkomplekser [8, 9]. Vi brugte halvtreds flavonoider, der var kommercielt tilgængelige, for at teste, om de har hæmmende aktivitet mod svampetyrosinase. Kojic acid, en velkendt tyrosinaseinhibitor, blev brugt som en positiv kontrol til at screene bedre tyrosinasehæmmere (figur 1A-1B). Som et resultat udviste prøve nummer 40 (swertiajaponin) (figur 1C) den stærkeste hæmmende aktivitet mod tyrosinase end andre flavonoider (figur 1A-1B og supplerende figur 1). Da den hæmmende aktivitet blev yderligere undersøgt ved et koncentrationsafhængigt eksperiment, var IC50-værdien af ​​kojinsyre 41,26 μM, og den for swertiajaponin var 43,47 μM (Figur 1D), hvilket indikerer, at tyrosinaseaktivitetsinhibering af swertiajaponin er sammenlignelig med den for kojinsyre. på reagensglasforsøg.

Swertiajaponin viser ingen cytotoksicitet in vitro

Swertiajaponin tilhører familien af ​​flavonoid C-glykosider. Den indeholder en kulhydratdel, der er C-glykosidisk bundet til en af ​​flavonoid-rygraden (figur 1C). Det er blevet rapporteret som en forbindelse fundet i hele urten af ​​Swertia japonica [10]. Selvom nogle undersøgelser rapporterede, at Swertia japonica bruges klinisk som et middel mod gastrointestinale symptomer i Japan [11], er få undersøgelser tilgængelige om de biologiske funktioner af swertiajaponin. Således undersøgte vi yderligere dets virkninger af det på melanogenese. Fordi cytotoksicitet er et stort problem for syntetiske tyrosinaseinhibitorer, testede vi, om swertiajaponin viste cellulær toksicitet ved hjælp af flere cellelinjer, herunder HaCat (human keratinocyt), B16F10 (musemelanom) og Hs27 (human fibroblast). Swertiajaponin viste ingen cytotoksicitet i disse cellelinjer (figur 2A-2C).

Swertiajaponin hæmmer melanogenese i B16F10-celler

Vi undersøgte dets effekt på melanogenese ved hjælp af B16F10-celler, der var forbehandlet med kojinsyre eller swertiajaponin efterfulgt af UVB- eller MSH-eksponering, de stærkeste melanogene inducere. Som forventet øgede UVB- eller MSH-eksponering markant melaninniveauerne i B16F10-celler (Figur 2D-2F), og swertiajaponinbehandling reducerede cellulært melaninindhold på en dosisafhængig måde efter UVB- eller MSH-eksponering (Figur 2D{{10 }}F). I celleundersøgelser ser den anti-melanogene virkning af swertiajaponin ud til at være stærkere end kojinsyres (figur 2E- 2F). Tilsvarende blev farven på cellepelleten, der var forbehandlet med swertiajaponin før MSH-behandling, lysnet sammenlignet med de MSH-behandlede celler (figur 2D), hvilket indikerer, at swertiajaponin hæmmer UVB eller MSH-induceret melanogenese.

Swertiajaponin hæmmer melanogenese i en human hudmodel

For at bekræfte, at swertiajaponin undertrykker hudpigmentering hos mennesker, dyrkede vi en levedygtig, tredimensionel, rekonstitueret human epidermis bestående af humane melanocytter og keratinocytter, som har været kendt for at gennemgå spontan melanogenese med tiden [12]. Vi forbehandlede den menneskelige hudmodel med swertiajaponin i 1 time og dyrkede den i vedligeholdelsesmediet i 5 dage. Sammenlignet med dag 1 blev den menneskelige hudmodel mørklagt på dag 5, og swertiajaponin-behandling forhindrede det på en koncentrationsafhængig måde (figur 3A-3B). Tilsvarende viste Fontana-Masson-farvning, at swertiajaponin markant reducerede melaninniveauet i epidermis (figur 2C), hvilket tyder på, at swertiajaponin nedsætter pigmentering imenneskelig hudmodel.

Swertiajaponin kan binde til og inaktivere tyrosinase

Vi undersøgte derefter mekanismer, der ligger til grund for de swertiajaponin-medierede anti-melanogene virkninger ved hjælp af B16F10-celler. Fordi swertiajaponin undertrykte tyrosinaseaktivitet i de cellefrie eksperimenter med svampetyrosinase (figur 1B), antog vi, at det direkte binder til og deaktiverer tyrosinase. For at teste dette blev protein-ligand docking-simulering udført for at forudsige bindingsaffinitet ved hjælp af AutoDock Vina. Den forudsagte bindingsaffinitet mellem tyrosinase og kojinsyre var -5,4 kcal/mol, og affiniteten mellem tyrosinase og swertiajaponin var -6,3 kcal/mol (figur 4A og 4C), hvilket tyder på, at swertiajaponin kan binde til tyrosinase med stærkere affinitet end kojinsyre gør. For yderligere at undersøge bindingsmåden mellem forbindelser og tyrosinase blev farmakoforanalyse udført under anvendelse af LigandScout 3.1-software. Mens kojinsyre hovedsageligt kan binde til tyrosinase via hydrogenbindinger med ASN260- eller GLU256-resten af ​​tyrosinase (Figur 4B), danner swertiajaponin multiple hydrogenbindinger med HIS85, ASN81, ASN260, HIS244 og ARG268-rester af tyrosinase-rester og hydrophob48ina-rester, og METROB248-rester, og PHE264-rest af tyrosinase (figur 4D), hvilket sandsynligvis forklarer den højere bindingsaffinitet af swertiajaponin til tyrosinase.

Fordi et foruddefineret bindingssted for tyrosin blev anvendt som en docking-lomme i protein-ligand-docking-simuleringen [3], er det sandsynligt, at swertiajaponin konkurrerende kan binde til tyrosinase med tyrosin. For at undersøge dette blev der udført en Lineweaver-Burk analyse. Da koncentrationen af ​​swertiajaponin steg, steg Km-værdierne også, mens Vmax-værdier var konsistente (Figur 4E-4F), hvilket indikerer, at swertiajaponin er en kompetitiv hæmmer af tyrosinase.

Swertiajaponin er en antioxidant, der undertrykker UVB-induceret MITF/tyrosinase-signalering

Selvom IC50-værdien for swertiajaponin svarer til kojinsyre-værdien i det cellefrie eksperiment, er den faktiske hæmning af melanogenese større i de swertiajaponin-behandlede celler end de kojic-syre-behandlede celler, hvilket indikerer, at den direkte binding til tyrosinase muligvis ikke er den eneste mekanisme, der ligger til grund for swertiajponin-medieret hæmning af melanogenese. Det er veldokumenteret, at de biologiske funktioner af flavonoider er forbundet med deres antioxidative virkninger [13]. Derfor undersøgte vi, om swertiajaponin regulerer oxidativt stress ved cellefri reaktiv oxygen (ROS) og peroxynitrit (ONOO-) rensende assays. Swertiajaponin udviste stærke ROS- og ONOO-fjernende aktiviteter, der kan sammenlignes med Trolox og penicillamin, velkendte henholdsvis ROS- og ONOO-hæmmere (figur 5A-5B). Vi testede yderligere, om den antioxidative aktivitet af swertiajaponin også blev vist i B16F10-celler efter UVB-eksponering. UVB-eksponering øgede ROS- og ONOO-produktionen signifikant, hvorimod swertiajaponin reducerede dem på en koncentrationsafhængig måde, hvilket tyder på, at swertiajaponin er en antioxidant (figur 5C-5D).

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501