Swertiajaponin hæmmer hudpigmentering ved hjælp af dobbelte mekanismer til at undertrykke tyrosinase del 2

Cistancheer en almindelig urt, der er kendt som "mirakelurten, der forlænger livet". Dens hovedkomponent er cistanosid, som har forskellige virkninger såsom antioxidant, anti-inflammatorisk og immunfunktionsfremme. Mekanismen mellem cistanche og hudblegning ligger i cistanche-glykosidernes antioxidante virkning.

Melanin i menneskelig hud produceres ved oxidation af tyrosin katalyseret af tyrosinase, og oxidationsreaktionen kræver deltagelse af ilt, så de iltfrie radikaler i kroppen bliver en vigtig faktor, der påvirker melaninproduktionen.Cistancheindeholder cistanosid, som er en antioxidant og kan reducere dannelsen af ​​frie radikaler i kroppen og dermed hæmme melaninproduktionen.

Klik på Cistanche Tubulosa for at forbedre hudblegning

Spørg for mere:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ud over,cistanchehar også den funktion at fremme kollagenproduktionen, som kan øge hudens elasticitet og glans og hjælpe med at reparere beskadigede hudceller.

CistanchePhenylethanol Glycosider har en væsentlig nedregulerende effekt på tyrosinaseaktiviteten, og effekten på tyrosinase er vist at være konkurrencedygtig og reversibel hæmning, hvilket kan give et videnskabeligt grundlag for at udvikle og udnytte blegeingredienserne i Cistanche.

Derfor,cistanchehar en nøglerolle ihudblegning. Det kan hæmme melaninproduktionen for at reducere misfarvning og sløvhed; og fremme kollagenproduktionen for at forbedre hudens elasticitet og udstråling. På grund af den udbredte anerkendelse af disse virkninger af cistanche, er mange hudblegningsprodukter begyndt at tilføre urteingredienser såsom Cistanche for at imødekomme forbrugernes efterspørgsel og dermed øge den kommercielle værdi af Cistanche i hudblegningsprodukter.

Sammenfattende er cistanches rolle i hudblegning afgørende. Dens antioxidantvirkning og kollagenproducerende effekt kan reducere misfarvning og sløvhed, forbedre hudens elasticitet og glans og dermed opnå enblegningseffekt. Den brede anvendelse af Cistanche i hudblegningsprodukter viser også, at dens rolle i kommerciel værdi ikke kan undervurderes.

Swertiajaponin hæmmer UVB-induceret MAPK-aktivering

Oxidativ stress har vist sig at stimulere melanogenese ved opregulering af mikrophthalmia-associeret transkriptionsfaktor (MITF), en transkriptionsfaktor til at inducere tyrosinase-genekspression [4, 14]. Vi undersøgte, om den antioxidative virkning af swertiajaponin kan regulere MITF-aktivitet. Western blotting-data viste, at UVB-eksponering øgede phosphoryleret MITF, en aktiv form for MITF, hvorimod swertiajaponinbehandling ved 10 μM reducerede det (figur 6A). Konsekvent blev en UVB-medieret stigning i tyrosinaseproteinniveau reduceret ved swertiajaponinbehandling (figur 6A). Fordi oxidativ stress har vist sig at aktivere MITF gennem mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK) [15, 16], blev det undersøgt, om swertiajaponin kan kontrollere MAPK-signalering. UVB-eksponering øgede dramatisk phosphoryleringen af ​​ERK, JNK og p38 (Figur 6B), som er forbundet med den UVB-inducerede ROS- og ONOO-produktion i B16F10-celler (Figur 5C- 5D). Swertiajaponin-behandling kun ved 10 μM reducerede proteinniveauerne af MAPK'er (figur 6B). Dette resultat er i overensstemmelse med den antioxidative aktivitet af swertiajaponin, fordi faldet i UVB-induceret cellulært oxidativt stress kun var tydeligt ved 10 μM swertiajaponin (figur 5C-5D).

Selvom swertiajaponin er hovedforbindelsen af ​​hele urten af ​​Swertia japonica, der er blevet brugt som en japansk medicin, viste vores undersøgelse ikke afgørende beviser for sikkerheden af ​​swertiajaponin til dets anvendelse på menneskelig hud. Imidlertid udviste swertiajaponin ikke cytotoksicitet i cellelinjer af Hs27 (human fibroblast), HaCat (human keratinocyt) og B16F10 (mus melanom) i vores eksperimentelle omgivelser. Desuden var der ingen synlige tegn på cytotoksicitet, herunder dannelse af cellerester eller celleløsning baseret på mikroskopisk observation, når swertiajaponin blev behandlet i den humane hudmodel med koncentrationer, der ikke viste cytotoksicitet i cellelinjerne. I betragtning af at sikkerhedsspørgsmål er de største bekymringer ved hudblegningsforbindelser, der er tilgængelige i øjeblikket, er der behov for yderligere in vivo-undersøgelser for at undersøge deres sikkerhed i fysiologi.

Sammen hæmmede swertiajaponin melaninakkumulering op til en tilfredsstillende grænse både i celle- og humane hudmodeller ved hjælp af dobbeltmekanismer til at undertrykke tyrosinase gennem direkte binding til og kompetitivt hæmning af tyrosinase og undertrykkelse af oxidativ stress-medieret MAPK/MITF-signalering (figur 7). I betragtning af de negative virkninger og manglen på langsigtet effektivitet af kendte hudblegningsmidler såsom kojinsyre og arbutin [17], kan swertiajaponin påføres mere sikkert til at undertrykke hudpigmentering og ville være et nyt tilsætningsstof til blegende kosmetik.

MATERIALER OG METODER

Tyrosinase aktivitet assay ved hjælp af svampe tyrosinase

Swertiajaponin og kojinsyre (50 μM) blev fyldt i en 96-brønds mikroplade (Nunc, Danmark) i tyrosinasebuffer (200 μL) indeholdende svampetyrosinase (1000 U), 1 mM L-tyrosinopløsning og 50 mM fosfat buffer (pH 6,5) [5]. Pladen blev inkuberet ved 37 grader i 15 minutter, og dopaquinon blev evalueret ved spektrofotometri (450 nm). Baseret på målingen blev IC50 beregnet ved hjælp af log-lineære kurver og deres ligninger.

Dockingsimulering af swertiajaponin og tyrosinase

AutoDock Vina blev brugt til in silico protein-ligand docking-simulering. Den tredimensionelle struktur af tyrosinase blev brugt i krystalstrukturen af ​​Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X). Det foruddefinerede bindingssted for tyrosin blev påført som en dockinglomme. Efter at der blev udført docking-simuleringer mellem tyrosinase og swertiajaponin eller kojinsyre, blev LigandScout 3.0-softwaren brugt til at forudsige bindingsrester mellem forskellige forbindelser og tyrosinase.

Kinetisk analyse af tyrosinaseinhibering af swertiajaponin

L-DOPA blev fremstillet i koncentrationer på 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 og 0.0625 mM og swertiajaponin blev fremstillet ved 20, 40 og 80 μM. Reaktionsblandingsopløsningen blev fremstillet i en 96-brøndsplade, hvori 20 μL tyrosinasesubstrat (L-DOPA), 10 μL af en vandig svampetyrosinaseopløsning (200 E) og 50 mM kaliumphosphatbuffer (pH) 6.5) blev tilføjet. Dopachromproduktionshastigheden af ​​reaktionsblandingen blev målt ved en bølgelængde på 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser. Tyrosinaseinhiberingshastigheden for swertiajaponin blev derefter beregnet ved anvendelse af Lineweaver-Burk plotanalyse. Michaelis-konstanten (Km) og maksimal hastighed (Vmax) blev også beregnet ved Lineweaver-Burk-plot med forskellige koncentrationer af L-DOPA-substrat [3].

Cellekultur og levedygtighedsanalyse

B16F10 melanomceller blev købt fra Korea Cell Line Bank. Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 5 procent føtalt bovint serum (FBS) og 1 procent penicillin, streptomycin, L-glutamin og natriumpyruvat. Cellerne blev holdt ved 37 grader i en befugtet 95 procent luft/5 procent CO2 atmosfære. Til cellelevedygtighedsanalysen blev celler podet i 96-brøndsplader. B16F10 melanomceller blev behandlet med swertiajaponin i forskellige koncentrationer i 48 timer. Ez-Cytox (10 μL) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 2 timer. De dannede formazankrystaller blev målt ved spektrofotometri ved 450 nm. Cellelevedygtighed blev beregnet under anvendelse af celler uden swertiajaponin-behandling som kontrolgruppe.

Melaninindhold i B16F10-celler

Melaninniveauet blev målt ved hjælp af metoden tidligere beskrevet med små modifikationer [18]. B16F10-celler fik lov til at vokse til 70-80 procent konfluens i 6-brøndsplader. Cellerne blev forbehandlet med swertiajaponin eller kojinsyre i 2 timer. Bagefter blev MSH eller UVB behandlet med det swertiajaponin- eller kojinsyreholdige medium og inkuberet i yderligere 48 timer. Efter vask med PBS blev cellerne løsnet under anvendelse af trypsin og opløst i 90 μL 1 N NaOH-opløsning indeholdende DMSO (5 procent). Efter inkubation ved 60 grader i 1 time blev melaninindholdet bestemt ved at måle absorbans ved 405 nm. Et kommercielt tilgængeligt UV-kammer (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Korea) blev brugt til UVB-eksponering af B16F10-celler.

Western blotting

Proteinprøver isoleret fra B16F10-celler (30 ug) blev adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese under anvendelse af 10-12 procent acrylamidgeler og overført til polyvinylidenfluoridmembraner, som derefter straks blev anbragt i blokeringsbuffer ( 5 procent fedtfri mælk) i 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl og 0,1 procent Tween 20. Membranen blev vasket i TBS-Tween-buffer i 30 minutter og derefter inkuberet med specifikke primære antistoffer (1:1{ {24}} fortynding) angivet i figurforklaringerne ved 4 grader natten over. Efter vask med TBS-Tween-buffer blev membranen inkuberet med et peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse-antistof (Santa Cruz, 1:10,000), et anti-kanin-antistof (Santa Cruz, 1:10, 000), eller et anti-gede-antistof (Santa Cruz, 1: 10.000) ved 25 grader i 1 time. Immunoblotterne blev visualiseret ved hjælp af Western Bright Peroxide-opløsning (Advansta, CA, USA) og ChemiDoc Touch-billeddannelsessystem (Bio-Rad, USA) i henhold til producentens instruktioner. Antistoffer brugt i denne undersøgelse er som følger: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tyrosinase (cellesignalering-104976), pMITF (Abcam{{40 }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (Cell Signaling-921L), p38 (Cell Signaling-9212S), pERK (Cell Signaling-4370L ), ERK (Cell Signaling-9201L), pJNK (Cell Signaling-9251L), JNK (Cell Signaling-9252S) og -actin (Santa Cruz-47778) .

Måling af ROS og ONOO- niveauer

Den antioxidative aktivitet af swertiajaponin blev undersøgt under anvendelse af fluorescerende 2,7-dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA) for ROS og dihydrorhodamin (DHR) 123 for ONOO-. Kort fortalt, for at bestemme ROS-niveau, blev DCFDA (25μM) tilsat til cellehomogenater til et slutvolumen på 250 ul. For at måle ONOO-niveau blev 10 µl cellehomogenater tilsat til en rhodaminopløsning (50 mM natriumphosphatbuffer, 90 mM natriumchlorid, 5 mM diethylentriaminpentaeddikesyre [DTPA] og DHR123). For begge assays blev fluorescens målt hver 5. minut i 30 min. på en fluorescenspladelæser med excitations- og emissionsbølgelængder indstillet til henholdsvis 485 og 530 nm.

Melaninophobning i en human hudmodel

En levedygtig, rekonstitueret, tredimensionel human epidermis (Neoderm-ME, Tego Science) blev brugt til at undersøge den anti-melanogene effekt af swertiajaponin i en human hudmodel. Den menneskelige hudmodel blev forbehandlet med DMSO (vehikel) eller swertiajaponin i 1 time og dyrket i vedligeholdelsesmediet leveret af virksomheden i 5 dage med DMSO- eller swertiajaponinbehandling. Mikroskopisk analyse blev udført fra dag 1 til dag 5 for at observere hudpigmentering. De mikroskopiske billeder blev analyseret med Image J-software for at semi-kvantificere mørkfarvningen af ​​huden. Til Fontana-Masson-farvning blev hudprøver fikseret i 4 procent paraformaldehyd natten over ved stuetemperatur, og prøverne blev analyseret af et kommercielt tilgængeligt firma (Garam Meditech, Sydkorea).

Statistisk analyse

Alle data er præsenteret som middel ± SEM. Forskellige grupper blev sammenlignet ved hjælp af en envejsvariansanalyse efterfulgt af Dunnetts post-test. P < 0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.

INTERESSEKONFLIKT

Der er ingen interessekonflikter at erklære.

FINANSIERING

Dette arbejde blev støttet af Grant K17281 fra Korea Institute of Oriental Medicine, Ministeriet for Undervisning, Videnskab og Teknologi (MEST), Republikken Korea.

REFERENCER

1. Bradford PT. Hudkræft i farvet hud. Dermatol Nurs. 2009; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Kemiske og instrumentelle tilgange til behandling af hyperpigmentering. Pigment Cell Res. 2003; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(Benzo[d]thiazol-2-ylamino)-5- (substitueret benzyliden) thiazol-4(5H)-on-derivater som nye tyrosinaseinhibitorer. Biol Pharm Bull. 2015; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P, et al. (Z)-5-(2,4-dihydroxybenzyliden) thiazolidin- 2,4-dion forhindrer UVB-induceret melanogenese og rynkedannelse ved at undertrykke oxidativt stress i HRM{{7} } hårløse mus. Oxid Med Cell Longev. 2016; 2016: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR, et al. (2R/S,4R)-2-(2,4-dihydroxyphenyl)thiazolidin- 4-carboxylsyre forhindrer UV-induceret rynkedannelse ved at hæmme NF-kappaB-medieret inflammation. J Dermatol Sci. 2015; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonoler fra Heterotheca inkluderer: tyrosinaseinhiberende aktivitet og strukturelle kriterier. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identifikation af rester af aktive steder involveret i metalcofaktorbinding og stereospecifik substratgenkendelse i pattedyrtyrosinase. Implikationer for den katalytiske cyklus. Biokemi. 2002; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoider som svampe-tyrosinaseinhibitorer: en fluorescensslukningsundersøgelse. J Agric Food Chem. 2006; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Flavonoidderivater som potente tyrosinasehæmmere - en undersøgelse af nylige fund mellem 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Undersøgelser af Swertia japonicas bestanddele. II. Isolering og struktur af nyt flavonoid, swertiajaponin. Chem Pharm Bull (Tokyo). 1967; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Effekter af Swertia japonica-ekstrakt og dets hovedforbindelse swertiamarin på gastrisk tømning og gastrointestinal motilitet hos mus. Fitoterapia. 2011; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Hæmmende virkning af 2-methyl-naphtho[1,2,3-de]quinolin-8-on på melanosomtransport og hudpigmentering. Sci Rep. 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. Flavonoiders rolle i oxidativt stress. Curr Top Med Chem. 2001; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Unge blade af rør (Phragmites communis) undertrykker melanogenese og oxidativ stress i B16F10 melanomceller. Biomed Pharmacother. 2017; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signalveje i melanogenese. Int J Mol Sci. 2016; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihydromyricetin fra Ampelopsis grossedentata hæmmer melanogenese gennem nedregulering af MAPK, PKA og PKC signalveje. Chem Biol Interact. 2016; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Ekstrakt af Ganoderma formosanum mycelium som en yderst potent tyrosinasehæmmer. Sci Rep. 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 stimulerer tyrosinase-genekspression og melanogenese i differentierede melanocytter. Pigment Cell Res. 2001; 14: 328-36.