Protease Calpain2a begrænser medfødt immunitet ved at målrette TRAF6 i Teleost Fish

TNF-receptor-associeret faktor 6 (TRAF6) spiller en vigtig signaltransduktionsrolle i både antibakterielle og antivirale signalveje. Imidlertid er de regulatoriske mekanismer af TRAF6 i lavere hvirveldyr mindre rapporteret. I denne undersøgelse identificerer vi calpain2a, som et medlem af den calciumafhængige proteaserfamilie med unik hydrolytisk enzymaktivitet, og fungerer som en nøgleregulator for antibakteriel og antiviral immunitet hos teleostfisk. Ved lipopolysaccharid (LPS) stimulering fremmer knockdown af calpain2a opreguleringen af ​​inflammatoriske cytokiner. Mekanistisk interagerer calpain2a med TRAF6 og reducerer proteinniveauet af TRAF6 ved at hydrolysere. Efter tab af enzymatisk aktivitet hæmmer mutant calpain2a konkurrencedygtigt dimerdannelse og auto-ubiquitinering af TRAF6. Knockdown af calpain2a fremmer også cellulær antiviral respons. Mutant calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, undertrykker ubiquitinering af IFN regulatorisk faktor (IRF) 3/7 fra TRAF6. Tilsammen klassificerer disse resultater calpain2a som en negativ regulator af medfødte immunresponser ved at målrette TRAF6 i teleostfisk.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Som den første forsvarslinje mod invaderende patogener, spiller medfødt immunitet en vigtig rolle i at beskytte kroppen mod bakteriel invasion og virusinfektioner. Mønstergenkendelsesreceptorer (PRR'er) på membranen genkender straks patogen-associerede molekylære mønstre (PAMP'er) 1-3. De tre mest undersøgte PRR'er i medfødt immunitet er Toll-lignende receptorer (TLR'er), RIG-I-lignende receptorer (RLR'er) og NOD-lignende receptorer (NLR'er), som genkender forskellige PAMP'er og udløser signalkaskader til at aktivere proinflammatoriske cytokiner og antiviral faktor 4-6. TNF-receptor-associeret faktor (TRAF) 6 er en uundværlig del af kampen mod bakteriel invasion og virusinfektioner. Som en vigtig signalvej aktiveret af lipopolysaccharid (LPS), er nuklear transkriptionsfaktor-KB (NF-KB)-vejen blevet kortlagt i detaljer. De fleste af proteinfunktionerne i NF-KB-signalvejen er blevet grundigt undersøgt1,7. Myeloid differentieringsfaktor 88 (MyD88) aktiveres først af TLR'er som svar på LPS, og IRAK4 fungerer som en mediator ved at aktivere IRAK1 og IRAK2, som forbinder MyD88 til TRAF68-11. Ubc13 og Uev1A katalyserer den K63-koblede ubiquitinering af TRAF6, som overfører K63 ubiquitinkæden til TAB2 og TAB3, hvilket fører til aktiveringen af ​​TAK112-16. TRAF6-reguleret IKK-aktivator 2 (TRIKA2), som er sammensat af TAK1, TAB1 og TAB2, aktiverer inhibitor af IκB-kinase (IKK) / phosphorylation17-19. Transkriptionsfaktor NF-KB kommer ind i kernen og fremmer produktionen af ​​inflammatoriske cytokiner20. Når TLR7/9 genkender virussen, transmitterer MyD88- IRAKs-TRAF6-komplekset signaler til IFN regulatory factor (IRF) 7, fremmer IRF7-ubiquitinering og aktiverer dets fosforylering ind i kernen21,22. I RLR-signalvejen aktiverer RIG I og melanomdifferentieringsassocieret gen 5 (MDA5) mitokondrielt antiviralt signalprotein (MAVS)23,24. Aggregeringen af ​​MAVS er et vigtigt træk ved begyndelsen af ​​RLR-signaltransmission23,25,26. TRAF2/3/6 er de første faktorer aktiveret af MAVS27,28. TRAF3 vil aktivere TBK1-IRF3-signalering, og MAVS-TRAF6-komplekset vil aktivere NF-KB-signalering, som fremmer IFN-1-ekspression27,29.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Den molekylære mekanisme for TRAF6-aktivering er allerede blevet demonstreret. TRAF6 i dimer form gennemgår autoubiquitinering under katalyse af Ubc13 og Uev1A, som er relateret til Ringfinger-domænet og ZF-fingre-domænet. Modellen af ​​TRAF6/Ubc13~UB bekræfter TRAF6-dimerens vigtige rolle i aggregeringen og transmissionen af ​​K63 ubiquitinkæden30. Derudover er det blevet rapporteret, at ringfinger- og ZF-fingredomænet rekrutterer E2~ub-konjugater i zebrafisk TRAF6-krystalmodellen, og det blev opdaget, at TRAF6 kunne danne en heterodimer med TRAF5 fra den samme TRAF-familie for første gang16. Deubiquitineringsfamilieproteinerne: A20, CYLD, USP2a, USP4 og USP20 målretter TRAF6 for at fjerne K63-koblet ubiquitinering og reducere downstream-signalering31-35. Gær-to-hybridsystemet screener interaktionen mellem UBE2O og TRAF6 og bekræfter, at denne interaktion direkte påvirker aktiveringen af ​​TRAF6 af MyD8836. I nedstrøms signaltransduktionsprocessen af ​​TRAF6 interagerer ECSIT som et mellemprotein med henholdsvis TRAF6 og TAK1, og denne interaktion styrker bindingen af ​​TRAF6 og TAK137. I LPS-induceret TLR4-signalering forhindrer PRDX'er TRAF6 i at rekruttere ECSIT til at levere K63 ubiquitin-kæden og hæmmer også BECN1 aktiveret af TRAF6 i autofagi-vejen38. MST4 aktiverer TRAF6-phosphorylering ved Thr463 og Thr486 og hæmmer TRAF6-dimerisering og ubiquitinering39. Hos pattedyr er proteinreguleringsmekanismen for TRAF6 blevet undersøgt bredt i antibakteriel og antiviral immunitet. Imidlertid er forskningen af ​​TRAF6 i lavere hvirveldyr mindre undersøgt. Immunresponset hos teleostfisk er hovedsageligt afhængig af TLR- og RLR-veje til at udføre immunresponset efter patogeninfektion. Derfor er det afgørende at udforske reguleringsmekanismen for TRAF6-medierede signalveje. calpain2 (m-calpain) er en familie af calciumafhængige proteaser, som er sammensat af mere end 16 medlemmer i pattedyr og mange andre organismer40. Den tidligste undersøgelse af calpain-proteinfamilien er relateret til cellebevægelse41. calpain fremmer cellemigration og viste sig at hæmme neutrofil migration og aktiveringen af ​​p38 MAPK og ERK MAPK42. Aktiviteten af ​​hydrolase er en af ​​de vigtige funktioner af calpain. I immunregulering fremmer calpain-2 frigivelsen af ​​NF-KB ved at hydrolysere IkB og aktiverer signalvejen43. I denne undersøgelse har vi fastslået, at calpain2a interagerer med TRAF6 og fungerer som en negativ regulator i antibakterielle og antivirale reaktioner hos teleost fisk, miiuy croaker (Miichthys miiuy). calpain2a fremmer nedbrydningen af ​​TRAF6-proteinniveauet gennem dets hydrolaseaktivitet. I mellemtiden hæmmer mutant calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, dannelsen af ​​K63 ubiquitinkæden ved at hæmme dimeren af ​​TRAF6. Det afspejles, at både calpain2a og mutant calpain2a afslutter ubiquitineringen af ​​TRAF6 til ECSIT/BENC1/IRF3/IRF7. calpain2a stopper NF-KB og IFN signaleringsprocessen ved at målrette TRAF6. Vores resultater giver et molekyle til undersøgelse af TRAF6-medieret immunregulering hos lavere hvirveldyr.

Resultater

calpain2a interagerer med TRAF6 og regulerer negativt NF-KB-signalering.

For at få indsigt i TRAF6-associerede proteiner i medfødt immunitetsrespons hos teleostfisk karakteriserede vi miiuy croaker TRAF6-interaktomet ved hjælp af affinitetsoprensning og massespektrometri. Sorteret efter etiketfri kvantificeringsintensitet (LFQ) opsnappede vi en del af dataene og viste dem (fig. 1a). Blandt TRAF6-associerede proteiner kan calpain2a muligvis regulere TRAF6-aktivitet og påvirkede TRAF6-medierede signalveje. For det første bør forholdet mellem calpain2a og TRAF6 på proteinniveau undersøges, vi kontrollerede interaktionen af ​​calpain2a med TRAF6 i Miiuy croaker nyrecellelinjer (MKC). Endogene co-immunpræcipitationseksperimenter indikerede, at calpain2a interagerer med TRAF6 (fig. 1b, c). Som vist ved forbigående transfektion og co-immunpræcipitationseksperimenter interagerede overudtrykt calpain2a og TRAF6 med hinanden (fig. 1d, e). Alle disse indikerer, at calpain2a interagerer med TRAF6, og yderligere eksperimenter er nødvendige for at undersøge mekanismen for deres virkning. Ved multipel sekvensjustering af mennesker, mus, zebrafisk og muligvis croaker calpain2a-proteiner, er calpain2a evolutionært konserveret mellem fisk og pattedyr (fig. 1f). For at bestemme funktionen af ​​calpain2a i medfødt immunitet undersøgte vi, om calpain2a var forbundet med aktivering af NF-KB induceret af LPS-stimulering. Vi transficerede epithelioma papulosum cyprinid (EPC) celler med NF-KB luciferase reporter, intern kontrol renilla luciferase reporter og vektor kodende for calpain2a eller tom vektor. calpain2a reducerede væsentligt NF-KB-reporteraktivitet efter LPS-stimulering på en dosisafhængig måde (fig. 1g). Desuden var proinflammatoriske cytokiner såsom IL-1 og IL-8-promotor, der reagerede på LPS-stimulering, markant reduceret i calpain2a-overudtrykte EPC-celler (fig. 1h, i), hvilket tyder på en potentiel rolle for calpain2a i inflammatorisk signalering veje induceret af LPS-stimulering.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Negativ regulering af LPS-induceret NF-KB-signalering af calpain2a.

For at undersøge den potentielle rolle af calpain2a i NF-KB-signalering transficerede vi calpain2a i MKC med en tidsgradient af LPS og vurderede proinflammatoriske cytokiner, der reagerede på LPS. Overekspression af calpain2a førte til nedregulering af ekspressionen af ​​IL-1, IL-8 og IL-6 (fig. 2a). Dernæst designede vi to calpain2a-specifikke små interfererende RNA'er (siRNA'er), der effektivt nedregulerede calpain2a (fig. 2b, d). Knockdown af calpain2a forbedrede signifikant LPS-inducerede proinflammatoriske cytokiner, herunder IL-1 og IL-8 i MKC og Miiuy croaker intestine cellelinjer (MIC) (fig. 2c, e). I gruppen af ​​LPS-stimulerede celler øgede knockdown af calpain2a celleproliferation. Tilsvarende fandt vi, i fravær af stimulering, at knockdown af calpain2a også forbedrede celleproliferation (fig. 2f). For at bestemme, om calpain2a inhiberede proteiner i LPS-induceret NF-KB-signalering, hæmmede calpain2a markant endogene proteinniveauer af TRAF6, men ikke MyD88, IRAK4 eller TAK1 (fig. 2g). Sammenfattende antydede kinetikken af ​​calpain2a og proinflammatorisk cytokinekspression funktionel involvering af calpain2a i LPS-induceret NF-KB-signalering.

Fig. 1 calpain2a interagerer med TRAF6 og hæmmer NF-KB-signalvejen. en liste over TRAF6-interaktom baseret på etiketfri kvantificeringsintensitet (afsnit). b, c MKC-celler podet i 6 cm2 skåle. Efter 24 timer blev cellelysater immunpræcipiteret (IP) med anti-TRAF6 eller anti-calpain2a affinitetsgeler. Derefter blev immunpræcipitaterne og cellelysaterne analyseret med IB med henholdsvis anti-TRAF6 og anti-calpain2a Abs. d, e HEK 293-celler podet i 6 cm2 skåle blev transficeret med plasmiderne calpain2a-Flag og TRAF6-Myc (2 ug hver). Efter 24 timer blev cellelysater immunpræcipiteret (IP) med anti-Myc d eller anti-Flag e affinitetsgeler. Derefter blev immunpræcipitaterne og cellelysaterne analyseret med IB med henholdsvis anti-Myc og anti-Flag Abs. f De samme aminosyrer blandt human calpain2a (Hu-calpain2), mus calpain2a (Mu-calpain2), zebrafisk calpain2a (ZF-calpain2a) og miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) er fremhævet med sort baggrund. g-I EPC-celler blev transficeret med calpain2a-Flag eller tom vektor sammen med NF-KB, IL-1 og IL-8 luciferase-reportere. 24 timer efter transfektion blev celler ubehandlet (Mock) eller behandlet med LPS i 6 timer. Luciferaseaktivitetsværdien blev opnået mod Renilla luciferaseaktiviteten (n=3 pr. gruppe). Western blot-analyse blev brugt til at måle ekspressionen af ​​det transient transficerede calpain2a-flag. Ekspressionen af ​​Tubulin blev anvendt som en ladningskontrol. Data blev analyseret ved to-vejs ANOVA (g, h, i). **p < 0.01. Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige eksperimenter.

Interaktionen mellem calpain2a og TRAF6.

Domæneanalyse blev udført ved hjælp af Conserved Domain Database (CDD) NCBI. calpain2a omfatter tre domæner: et Calpain-familie cysteinprotease (CysPc) domæne (aa 46-339), et centralt Calpain stort underenhedsdomæne III (aa 360-499) og et C-terminalt Penta-EF hånddomæne ( aa 500-697). For at bestemme hvilket eller hvilke domæner af calpain2a der var påkrævet for dets interaktion med TRAF6, skabte vi tre trunkeringsmutanter: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697) og calpain (500-697) (Fig. 3a). HEK293-celler blev transficeret med calpain2a-Flag vildtype (WT), calpain2a-Flag trunkeringsmutanter eller TRAF6-HA-vektor. Vi fandt ud af, at både fuldlængde calpain2a og tre trunkeringsmutanter kunne interagere med TRAF6 (fig. 3c). TRAF6 er sammensat af et C-terminalt TRAF-domæne, et coiled-coil-domæne, et zinkfingre-domæne og et ringfingerdomæne38. For at undersøge hvilke(t) domæne(r) af TRAF6 der var påkrævet for dets interaktion med calpain2a, lavede vi en række TRAF6 trunkerede mutanter, herunder TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36 }}) og TRAF6 (400-574). I mellemtiden lavede vi domænemutanterne: TRAF6ΔRing (hvor ringfingerdomænet er slettet), TRAF6ΔZF (hvor zinkfingers domæne er slettet), TRAF6ΔCC (hvori coiled-coil-domænet er slettet) og TRAF6ΔTRAF-C ( hvori C-terminalt TRAF-domæne er slettet) (fig. 3b). calpain2a interagerede med TRAF6 i fuld længde såvel som trunkeringer af TRAF6, der indeholdt C-terminalt TRAF-domæne, et coiled-coil-domæne, et zinkfingre-domæne (fig. 3d, f), men ikke med ringfingerdomæne (fig. 3e) . Luciferase-assays viste, at overekspression af calpain2a og disse trunkeringsmutanter signifikant hæmmede NF-KB- og IL-1-reporteraktivitet i EPC-celler (fig. 3h). Endvidere blev de subcellulære kolokaliseringer af calpain2a med TRAF6 undersøgt. Vi transficerede EPC-celler med TRAF6-GFP og en tom vektor eller calpain2a-mCherry. Konfokal mikroskopianalyse viste, at de grønne signaler af TRAF6 overlappede med de røde signaler af calpain2a, hvilket indikerede, at calpain2a co-lokaliserer med TRAF6 i EPC-celler (fig. 3i, j). Disse data indikerer, at det strukturelle grundlag for multiple domæner af TRAF6 (C-terminalt TRAF-domæne, coiled-coil-domæne, zinkfingre-domæne), men ikke ringfingerdomænet, er afgørende for dets association med calpain2a (fig. 3g).

Fig. 2 regulerer calpain2a negativ LPS-induceret NF-KB-signalvej. et IL-1, IL-8 og IL-6 mRNA i MKC transduceret med calpain2a-Flag eller tom vektor og behandlet med saltvand (0) eller udfordret med LPS for forskellige gange (2 timer, 4 timer, 6 timer, 8 timer, 10 timer) (n=3 pr. gruppe). b, d MKC-celler og MIC-celler blev transficeret med si-calpain2a #1 og si-calpain2a #2 (100 nM) eller si-ctrl (100 nM). 48 timer efter transfektion blev calpain2a-ekspression målt ved qRT PCR (n=3 pr. gruppe). Niveauet af calpain2a-protein blev bestemt ved Western blotting. c, e IL-1, IL-8 mRNA i MKC og MIC stabilt transduceret med si-calpain2a #1 eller si-ctrl (kontrolvektor) og behandlet med saltvand (0) eller udfordret med LPS for forskellige gange (4 timer, 8 timer) (n=3 pr. gruppe). f MKC-celler blev transficeret med enten si-ctrl eller si-calpain2a #1. 36 timer efter transfektion blev cellerne stimuleret med LPS i 12 timer, hvorefter celleproliferationsassay blev målt (n=3 pr. gruppe). Målestok, 100 μm. g calpain2a-Flag blev transficeret ind i MKC-celler, som blev udfordret med LPS på forskellige tidspunkter (3 timer, 6 timer, 9 timer). Immunoblotanalyse af cellelysater med indikerede Abs. Relativt mRNA-niveau blev normaliseret til ekspressionen af ​​genet kodende for -actin i hver prøve. Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige eksperimenter. Data blev analyseret ved to-vejs ANOVA (a, c, e, f) eller envejs ANOVA (b, d). *p < 0,05, **p < 0,01.

Fig. 3 Interaktionen mellem calpain2a og TRAF6. a, b Skematiske diagrammer af domæneorganisation i miiuy croaker calpain2a, TRAF6 og mutanter blev brugt i denne undersøgelse. "+" repræsenterer interaktionen med TRAF6 eller calpain2a, "-" betyder ingen interaktion. c HEK293-celler blev transficeret med mock, calpain2a-Flag vildtype (WT) og calpain2a-Flag trunkerede mutanter eller TRAF6-HA som angivet. 24 timer efter transfektion blev transficerede celler ekstraheret, og cellelysater blev udsat for immunpræcipitation med anti-HA-antistof efterfulgt af IB under anvendelse af anti-HA eller anti-Flag-antistof. d–f HEK293-celler blev transficeret med mock, TRAF6-HA vildtype (WT) og TRAF6-HA trunkerede mutanter eller calpain2a-Flag som angivet. 24 timer efter transfektion blev transficerede celler ekstraheret, og cellelysater blev udsat for immunpræcipitation med anti-HA-antistof d, f eller anti-Flag-antistof e efterfulgt af IB under anvendelse af anti-HA eller anti-Flag-antistof. g Interaktionsstedet for TRAF6 og calpain2a. h EPC-celler blev transficeret med TRAF6-HA, calpain2a-Flag eller calpain2a-Flag trunkerede mutanter sammen med NF-KB og IL-1 luciferase-reportere. Efter 36 timer efter transfektion blev luciferaseaktivitetsværdien opnået mod renilla luciferaseaktiviteten (n=3 pr. gruppe). I j EPC-celler blev transficeret med mock, calpain2a-mCherry og TRAF6-GFP. DAPI-farvede kerner er vist i blåt. calpain2a blev påvist med rød fluorescens, og TRAF6 blev påvist med grøn fluorescens. Målestok, 10 μm. Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige eksperimenter. Data blev analyseret ved envejs ANOVA (h). **p < 0,01.

calpain2a hæmmer TRAF6-proteinekspressionsniveauet ved proteolytisk aktivitet.

For at udforske den regulatoriske mekanisme af calpain2a på TRAF6 undersøgte vi først, om calpain2a havde en effekt på TRAF6 på proteinniveau. calpain2a-Myc og TRAF6-Flag blev co-transficeret ind i EPC-celler, proteinniveauet af TRAF6 blev delvist nedbrudt efter 30 timer (fig. 4a). Som vist i fig. 4b fremmede calpain2a nedbrydningen af ​​TRAF6 på en dosisafhængig måde. I nærvær af calpain2a påvirkede det ikke mRNA-niveauet af TRAF6, hvilket indikerer, at calpain2a kun påvirker proteinniveauet af TRAF6. I mellemtiden viste inhibitorcycloheximid (CHX) assayet, at calpain2a kunne accelerere halveringstiden af ​​TRAF6-proteinet (fig. 4c). Overekspression af calpain2a i MKC-celler resulterede i destabilisering af endogen TRAF6 (fig. 4d). For at undersøge, om nedbrydningen af ​​TRAF6 medieret af calpain2a var afhængig af ubiquitin-proteasom, autophagosom, lysosomale veje eller andre, blev EPC-celler behandlet med reagenserne, der inhiberede disse veje: MG132, 3-MA og NH4Cl. Den calpain2a-medierede destabilisering af TRAF6 blev imidlertid ikke vendt af den proteasomale inhibitor MG132, autofagisk inhibitor 3-MA eller lysosomal inhibitor NH4Cl (fig. 4e). Dernæst blev EPC-celler behandlet med reagenserne: E-64 (en calpain-hæmmer, som inaktiverer calpain-hydrolaseaktivitet) og PMSF (uspecifik serinproteaseinhibitor). Vi fandt, at calpain-hæmmer E-64 forhindrede nedbrydning på TRAF6-proteinniveauet (fig. 4f). Som vist i fig. 4g vendte E-64 også nedbrydningen af ​​endogene TRAF6-proteinniveauer af calpain2a.

Fig. 4 calpain2a inhiberer TRAF6-proteinekspression. a Tidsgradienteksperimentet af tomme vektorer eller calpain2a-Myc-plasmider sammen med TRAF6--flag blev udført i EPC-celler. Cellelysaterne blev udsat for IB med anti-Myc, anti-Flag og anti-Tubulin Abs. RNA blev ekstraheret fra celler og revers transskriberet, og derefter blev TRAF6 og actin amplificeret med PCR-primere. b EPC-celler blev podet i 12-brøndplader natten over og co-transficeret med TRAF6-Flag og calpain2a-Myc (0.3, 0.6 eller {{ 18}}.9 ug) i 48 timer. Ekspressionen af ​​TRAF6-Flag- og calpain2a-Myc-proteiner blev påvist ved Western blotting. RNA blev ekstraheret fra celler og revers transskriberet, derefter blev TRAF6 og actin amplificeret ved PCR-primere. c calpain2a-Myc eller tomme vektorer blev co-transficeret med TRAF6-Flag ind i EPC-celler. 36 timer efter transfektion blev de transficerede celler behandlet med cycloheximid (CHX) i 2 eller 4 timer. d MKC-celler blev transficeret med calpain2a-Flag eller tomme vektorer. 48 timer efter transfektion blev cellelysaterne underkastet IB med anti-TRAF6, anti-Flag og anti-Tubulin Abs. e, f EPC-celler blev transficeret med de angivne plasmider i nærvær eller fravær af MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 eller 75 μM) eller PMSF i 6 time før immunoblotanalyse blev udført. g MKC-celler blev transficeret med calpain2a-Flag i nærvær eller fravær af E{{50}} (50 eller 75 μM) i 6 timer, før immunoblotanalyse blev udført. h calpain2a-Flag og calpain2a-ΔCysPc-Flag blev co-transficeret med TRAF6-HA ind i EPC-celler. 48 timer efter transfektion blev cellelysaterne underkastet IB med angivne Abs. I calpain2a-Flag og calpain2a-ΔCysPc-Flag blev cotransficeret ind i MKC-celler. 48 timer efter transfektion blev cellelysaterne underkastet IB med anti-TRAF6, anti-Flag og anti-Tubulin Abs. j IL-1, IL-8 mRNA i MKC stabilt transduceret med calpain2a-Flag og calpain2a-ΔCysPc-Flag og behandlet med saltvand (0) eller udfordret med LPS i 4 timer (n=3 pr gruppe). Relativt mRNA-niveau blev normaliseret til ekspressionen af ​​genet kodende for -actin i hver prøve. Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige eksperimenter. Data blev analyseret ved to-vejs ANOVA (j). **p < 0,01.

For at bestemme, om nedbrydningen af ​​TRAF6 var afhængig af hydrolaseaktiviteten af ​​calpain2a. Ved at udnytte tidligere strukturelle og biokemiske undersøgelser af calpain2a hos pattedyr muterede vi cystein-, histidin- og asparaginresterne af calpain2a til alanin (calpain2a C105A, H262A, N286A og 3 A), hvilket mistede den katalytiske-44-46-koordination. Vi observerede, at nedbrydningen af ​​TRAF6 ikke var påvirket af denne mutation (Supplerende Fig. 1a). Så vi muterede proteasedomænet, som er Calpain-familiens cysteinprotease (CysPc) domæne af calpain2a (benævnt calpain2a-ΔCysPc). Hverken overudtrykt TRAF6 eller endogen TRAF6 er påvirket af calpain2a-ΔCysPc (fig. 4h, i). Imidlertid påvirkes proinflammatoriske cytokiner IL-1 og IL-8 samtidigt af vildtype eller muteret calpain2a ved LPS-stimulering (fig. 4j). Mutant calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, påvirker ikke proteinniveauet af TRAF6, men mutant calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, påvirkede stadig ekspressionen af ​​nedstrøms pro-inflammatoriske cytokiner. Dette udløste vores undersøgelse af de potentielle mekanismer, hvorved calpain2a regulerer TRAF6. Tilsammen afslører disse resultater, at calpain2a regulerer NF-KB-signalering ved at undertrykke ekspressionen af ​​TRAF6-proteinniveauer gennem dets calpainhydrolaseaktivitet.

calpain2a hæmmer TRAF6 ubiquitin-ligase aktivitet.

Dernæst undersøgte vi de molekylære mekanismer, hvorved calpain2a negativt regulerer TRAF6-aktiveret NF-KB-signalering, og om calpain2as interaktion med TRAF6 ved tab af enzymatisk aktivitet modulerer dens ubiquitin-ligaseaktivitet. Vi behandlede MKC-celler med LPS og immunpræcipiterede derefter TRAF6. Ubiquitineringsassay med oprensede rekombinante proteiner bekræftede, at calpain2a og calpain2a-ΔCysPc reducerede ubiquitinering af TRAF6 (fig. 5a). Som vist i fig. 5b, c, reducerede både calpain2a og calpain2a-ΔCysPc signifikant de WT- og K63-ubiquitinerede proteiner af TRAF6. Koncentrationsgradienter af calpain2a og calpain2a-ΔCysPc reducerede WT og K63 ubiquitinerede proteiner af TRAF6 på en dosisafhængig måde. calpain2a-ΔCysPc forhindrede stadig K63 ubiquitin-kædeaggregation af TRAF6 uden at påvirke TRAF6-proteinniveauet (fig. 5d, e). Derefter transficerede vi MKC-celler for at udtrykke Myc-mærket TRAF6 i nærvær eller fravær af Flag-mærket calpain2a-ΔCysPc, udførte derefter immunpræcipitationseksperimenter med et anti-Myc-antistof og analyserede ved immunoblot med anti-UB. En sådan ubiquitinering af TRAF6 blev væsentligt svækket af calpain2a-ΔCysPc (fig. 5f). Stimuleret af LPS leverer TRAF6 K63-koblet ubiquitinkæde til TAK1, hvilket stimulerer TAK1-autofosforylering og aktiverer NF-κB18. WT- og K63-ubiquitinproteiner af TAK1 blev signifikant forbedret i nærvær af TRAF6, hvorimod TAK1--koblet ubiquitinering blev hæmmet i nærvær af calpain2a-ΔCysPc (fig. 5g, h). Disse data understøtter, at mutant calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, på samme måde hæmmer TRAF6 ubiquitin-ligaseaktivitet uden at påvirke TRAF6-proteinniveauer.

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

calpain2a hæmmer TRAF6 homo-oligomerisering.

Lys63 ubiquitin-kæden syntetiseret af TRAF6 spiller en nøglerolle i signaltransduktion. Det er blevet rapporteret, at dimeriseringen af ​​TRAF6 er essentiel for syntesen af ​​dens ubiquitinkæde16. Dimeriseringsmodellen er tæt forbundet med kombinationen af ​​Ubc13 for at producere K63 ubiquitination16,30. For at verificere, om fisk TRAF6 kunne danne dimerer, brugte vi TRAF6-plasmider med forskellige tags: Myc-mærket TRAF6 og HA-mærket TRAF6 til co-IP-eksperimenter. IP-assay blev udført under anvendelse af et anti-HA-antistof, HATRAF6 interageret med Myc-TRAF6 (fig. 6a). For at udforske den hæmmende effekt af calpain2a i TRAF6--dimer-interaktionen blev Flag-mærket calpain2a, HA-mærket TRAF6 og Myc-mærket TRAF6 forbigående udtrykt i HEK293-celler. Som forventet blev TRAF6--dimer-interaktionen reduceret i nærvær af calpain2a (fig. 6b). På samme tid, for at undgå tilstedeværelsen af ​​nedbrydning af TRAF6 af calpain2a. Vi transficerede Flag-mærket calpain2a-ΔCysPc og fandt ud af, at TRAF6--dimer-interaktionen gradvist blev reduceret i nærvær af calpain2a-ΔCysPc (fig. 6c). Som vist i fig. 6d, e, fandt vi HA-TRAF6-forstærket WT- og K63-ubiquitinering af Myc-TRAF6. Mens HEK293-celler blev co-transficeret med calpain2a og calpain2a-ΔCysPc, ville den forbedrede ubiquitinering blive undertrykt. Disse resultater tyder på, at både vildtype-calpain2a og mutant-calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, hæmmer TRAF6-homoligomerisering og auto-ubiquitinering.

calpain2a hæmmer leveringen af ​​TRAF6 ubiquitination til ECSIT og BECN1.

Som afbildet i fig. 5d fandt vi, at calpain2a interfererede med ubiquityleringsprocessen fra TRAF6 til TAK1. Det er blevet rapporteret, at ECSIT fungerede som et adapterprotein af TAK1 og TRAF6 for at fremme NF-KB-signalering ved LPS-stimulering37. For at verificere, om ECSIT havde de nævnte funktioner i teleostfisk, udførte vi flere sekvensjusteringer af ECSIT-proteiner i mennesker, mus og kan croaker (Supplerende Fig. 1b). Vi transficerede EPC-celler med NF-KB luciferase-reporter, ECSIT forbedrede signifikant NF-KB-reporteraktivitet efter LPS-stimulering (Supplerende Fig. 1c). Overekspression af ECSIT i MKC-celler førte til opregulering af mRNA-niveauet af TNF- (Supplerende Fig. Id). Efter transficeret fisk ECSIT og TRAF6 i HEK293-celler fandt vi, at TRAF6 interagerede med ECIST (fig. 7a). Tilsvarende blev ECSIT og TAK1 co-transficeret, og de to proteiner opretholdt også interaktion (fig. 7b). Efterfølgende, for at verificere, om calpain2a-ΔCysPc hæmmer dannelsen af ​​TRAF6-ECSIT-komplekset, transficerede vi de tre plasmider ind i HEK293-celler og fandt ud af, at calpain2a-ΔCysPc forhindrede TRAF6-ECSIT-komplekset (fig. ). For at verificere transmissionsprocessen af ​​ubiquitinkæden i NF-KB-signalering. Som vist i fig. 7d kunne TRAF6 fremme ubiquitineringen af ​​ECSIT; som forventet hæmmede calpain2a-ΔCysPc processen, hvorved TRAF6 transmitterede ubiquitinkæden til ECSIT. BECN1 er et vigtigt protein i LPS-induceret autofagi. Det er blevet bekræftet, at K63 ubiquitinering kunne ændre og aktivere BECN1. Deubiquitinerende enzym A20 fjerner ubiquitinering af BECN1 og hæmmer autofagi forårsaget af LPS, og TRAF6 er E3-ligasen, der er ansvarlig for BECN1-ubiquitinering i dette signal47. Som vist i fig. 7e interagerede TRAF6 med BECN1 og fremmede ubiquitineringen af ​​BECN1. Derefter transficerede vi BECN1, TRAF6, calpain2a og calpain2a-ΔCysPc i HEK293-celler, TRAF6 fremmede ubiquitineringen af ​​BECN1. calpain2a-ΔCysPc inhiberede processen, hvorved TRAF6 transmitterede ubiquitinkæden til BECN1 (fig. 7f). Disse resultater tyder på, at vildtype calpain2a og mutant calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, hæmmer ubiquitineringsevnen af ​​TRAF6 i LPS-induceret autofagi og NF-KB-signalering.

Negativ regulering af antiviral respons af calpain2a.

I RLR-vejen fungerer TRAF6 som en E3-ligase rekrutteret af MAVS til at aktivere NF-KB, produktionen af ​​IFN'er og cytokiner. Vi undersøgte derefter, om calpain2a spillede en rolle i at forhindre TRAF6 i den IFN-medierede antivirale proces. I EPC-celler blev IFN-1-, ISRE- og IRF3-promotordrevne luciferase-reportere udtrykt. Vi fandt, at calpain2a væsentligt reducerede disse promotordrevne luciferaseaktiviteter på en dosisafhængig måde efter Ploy(I:C)-stimulering og Siniperca-snyder rhabdovirus (SCRV)-infektion (fig. 8a, b). Knockdown af calpain2a forbedrede signifikant Ploy(I:C) og SCRV-udløst genekspression, herunder Viperin, Mx1 og ISG15 (fig. 8c, d). Knockdown af calpain2a resulterede i højere ekspression af cellelevedygtighed efter SCRV-infektion i MKC-celler (fig. 8e). Som vist i fig. 8f afslørede celleproliferationsassays, at knockdown af calpain2a forstærkede celleproliferation ved SCRV-infektion. Overekspression af calpain2a fremmede kraftigt virusudbredelsen, som afspejlet af viral replikation efter SCRV-infektion (fig. 8g). calpain2a og calpain2a-ΔCysPc reducerede væsentligt IFN-1, ISRE og IRF3-promotordrevne luciferase-reportere efter Ploy(I:C)-stimulering og SCRV-infektion (Supplerende Fig. 2a, b). Disse resultater tyder på, at calpain2a negativt kan regulere RLR-signalvejen gennem inhibering af TRAF6 og derved hæmme aktiveringen af ​​IFN.

Fig. 5 calpain2a inhiberer TRAF6 ubiquitin-ligase aktivitet. en ubiquitinering af endogen TRAF6 i MKC-celler transduceret med calpain2a-Flag og calpain2a-ΔCysPc-Flag og uanfægtet (-) eller udfordret med LPS (+), vurderet ved immunoblot-analyse med anti-ubiquitin efter immunpræcipitation med anti-TRAF6-analyse og input-immunoblot-analyse med angivet Abs. b, c HEK293-celler blev cotransficeret med TRAF6-HA og WT-ubiquitin-His eller K63O ubiquitin-His (hvori kun lysin 63 opbevares) sammen med calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og oprenset med Ni-NTA agarose. d, e HEK293-celler blev cotransficeret med TRAF{{30}}HA og WT-ubiquitin-His eller K63O-ubiquitin-His (hvori kun lysin 63 opbevares) sammen med calpain2a-Flag ({{45 }},5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og oprenset med Ni-NTA agarose. f Ubiquitinering af overudtrykt TRAF6 i MKC-celler transduceret med calpain2a-ΔCysPc-Flag, vurderet ved immunoblotanalyse med anti-ubiquitin efter immunpræcipitation med anti-Myc og input-immunoblotanalyse med angivne Abs. g, h HEK293-celler blev cotransficeret med TAK1-Myc, TRAF6-HA og WT-ubiquitin-His eller K63O-ubiquitin-His (hvori kun lysin 63 opbevares) sammen med calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og oprenset med Ni-NTA agarose. Alle immunpræcipitater og input immunoblotanalyse med anti-Myc, anti-Flag, anti-HA og anti-Tubulin Abs. Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige eksperimenter.

calpain2a undertrykker ubiquitinering af IRF3 og IRF7 fra TRAF6.

Det rapporteres, at i det antivirale signal, der udløses af MAVS-TRAF3/6-komplekset, er aktiviteten af ​​TRAF6 nødvendig for aktiveringen af ​​IRF3 og NF-KB48. Som vist i fig. 9a, b fremmer TRAF6 WT- og K63--koblet ubiquitinering af IRF3, og denne forstærkning hæmmes af ekspressionen af ​​calpain2a-ΔCysPc. I mellemtiden, når virussen udløser et TLR-afhængigt signalsignal, er TRAF6 tæt relateret til IRF7 og fremmer ubiquitineringen af ​​IRF7 sammen med aktiverede antivirale faktorer22,49,50. TRAF6 fremmer WT- og K63--koblet ubiquitinering af IRF7, og denne forbedring hæmmes af ekspressionen af ​​calpain2a-ΔCysPc (fig. 9c, d). Disse data tyder på, at vildtype-calpain2a og mutant-calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, hæmmer TRAF6-medieret ubiquitinering af IRF3 og IRF7.

Diskussion

TRAF6 er et af de syv medlemmer af Tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated factors (TRAFs) familien, som er blevet identificeret som en signaladapter og udøver signaltransduktion51,52. TRAF-familien indeholder Ringfinger-domænet, som ejer E3-ligaseaktiviteten. E3-ligaser med HECT-domænet fremmer substratpolyubiquitinering, og E3'er med Ring-domænet kræver E2~ub for at transmittere polyubiquitinering53,54. Det dimer Ub-bindende enzym Ubc13/Uev1A er blevet bekræftet at være involveret i aggregeringen af ​​TRAF6 polyubiquitination16. Mens K124 af mus TRAF6 er slået ud, vil TRAF6 miste aktiviteten af ​​K63 auto-ubiquitinering, og mutationen på dette sted eliminerer ubiquitineringen af ​​TRAF6-medieret NEMO og aktiveringen af ​​TAK1, IKK og NF-KB55 . Det er præcist, fordi PRDX1 binder til TRAF6 Ring Finger-domænet indeholdt i K124 og eliminerer ubiquitineringen af ​​TRAF638. Det er blevet rapporteret, at ubiquitinering af TRAF6 er tæt forbundet med dimeriseringen af ​​dets N-terminale domæne (ringfinger- og ZF-fingers domæne). Flere N-terminale interaktionssteder med Ubc13 blev muteret, og Ubc13 kunne ikke transmittere poly~ub til TRAF616. Interaktionen mellem calpain2a og TRAF6 mutanter viste, at de fleste af domænerne af TRAF6 interagerede med calpain2a, bortset fra ringfingerdomænet. På grund af interaktionen mellem calpain2a og ZF-fingers domæne af TRAF6, spekulerede vi i, at calpain2a kunne hæmme auto-ubiquitinering ved at blokere dimeriseringen af ​​TRAF6. Efterfølgende verificerede vi interaktionen mellem forskellige tags af TRAF6. Efterhånden som ekspressionen af ​​mutant calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, steg, svækkedes interaktionen mellem forskellige tags af TRAF6. HA-mærket TRAF6 fremmer ubiquitineringen af ​​Myc-mærket TRAF6, og mutant calpain2a hæmmer ubiquitineringen forstærket af HA-mærket TRAF6. Som et mellemled i processen med TRAF6-TAK1-signaltransmission binder ECSIT til det C-terminale domæne i TRAF6 (CC-domæne og TRAF-C-domæne) og er bekræftet at være involveret i NF-KB-signalering37. Ekspressionen af ​​proinflammatoriske cytokiner faldt i ECSITKD THP-1-celler. Efter overekspression af ECSIT i ECSITKD THP-1-celler steg gener såsom IRF7, IL-1 og CD44 imidlertid signifikant37. PRDX1 binder til ringfingerdomænet af TRAF6 og hæmmer ubiquitineringen af ​​ECSIT og BECN1 i NF-KB og autofagi-signaler ved at hæmme dannelsen af ​​TRAF6 polyubiquitinering38. Hos teleostfisk bekræftede vi den ECSIT-aktiverede NF-KB-signalvej, interagerede med henholdsvis TRAF6 og TAK1 og transmitterede polyubiquitinkæden produceret af TRAF6. calpain2a bundet til ZF-domænet, CC-domænet og TRAF-C-domænet i TRAF6, hvilket hæmmede interaktionen af ​​TRAF6-ECSIT. Vi bekræftede, at mutant calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, forhindrede polyubiquitinkæden fra TRAF6 til ECSIT og BECN1.

Fig. 6 calpain2a dæmper autoubiquitinering af TRAF6. en HEK293-celler blev transficeret med TRAF6-Myc, TRAF6-HA eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og IP analyseret med HA-antistof. b HEK293-celler blev transficeret med TRAF6-Myc, TRAF6-HA, tom vektor eller calpain2a-Flag. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og IP analyseret med HA-antistof. c HEK293-celler blev transficeret med TRAF6-Myc, TRAF6-HA, tom vektor eller forskellige koncentrationer af calpain2a-ΔCysPc-Flag. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og IP analyseret med HA-antistof. d, e HEK293-celler blev cotransficeret med TRAF6-Myc, TRAF6-HA og WT-ubiquitin-His eller K63O-ubiquitin-His (hvori kun lysin 63 opbevares) sammen med calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og oprenset med Ni-NTA agarose. Immunpræcipiterer og input immunoblot-analyse med anti-Myc, anti-Flag, anti-HA og anti-Tubulin Abs. Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige eksperimenter.

Fig. 7 calpain2a hæmmer TRAF6-medieret ubiquitinering af ECSIT og BECN1. en HEK293-celler blev transficeret med ECSIT-Myc, TRAF6-flag eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og IP analyseret med Flag-antistof. b HEK293-celler blev transficeret med TAK1-flag, ECSIT-Myc eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og IP analyseret med Myc-antistof. c HEK293-celler blev transficeret med TRAF6-Myc, ECSIT-HA, tom vektor eller forskellige koncentrationer af calpain2a-ΔCysPc-Flag. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og IP analyseret med Myc-antistof. d HEK293-celler blev cotransficeret med ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His sammen med calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og oprenset med Ni-NTA agarose. e HEK293-celler blev transficeret med BECN1-Flag, TRAF6-Myc eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og IP analyseret med Myc-antistof. f HEK293-celler blev cotransficeret med BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His sammen med calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og oprenset med Ni-NTA agarose. Immunpræcipiterer og tilfører anti-Myc, anti-Flag, anti-HA og anti-Tubulin Abs. Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige eksperimenter.

Vi bemærker, at calpain2a har hydrolaseaktivitet som en af ​​den calciumafhængige proteasfamilie. m-calpain (calpain-2) spiller en positiv regulerende rolle i HepG2-levercellernes NF-KB-signalvej. Uafhængigt af 26 s proteasomtilgangen hydrolyserer calpain2a IkB for at frigive transkriptionsfaktoren NF-KB. Den specifikke hæmmer af calpainprotein forhindrer nedbrydning af IkB 56. For calpain er der dog få undersøgelser af fisks medfødte immunrespons. I MKC-celler hæmmede overekspression af calpain2a NF-KB nedstrøms proinflammatoriske cytokiner induceret af LPS. Dette fænomen var i modstrid med resultaterne i HepG2-leverceller. Det kan være, at artsspecificiteten af ​​calpain-proteinfamilien forårsagede forskellige virkninger. På samme måde brugte vi den specifikke hæmmer af calpainproteinet E-64 for at forhindre calpain2a i at hydrolysere TRAF6. Mutant calpain2a, der mangler hydrolaseaktivitet, hæmmer TRAF6 ubiquitin-ligaseaktivitet uden at påvirke dets proteinniveauer. Vi fandt ikke enzymaktive steder for calpain2a. Ifølge tidligere undersøgelser i pattedyr er de tre steder: cystein (C105A), histidin (H262A) og asparaginrester (N286A). Vores eksperimenter bekræfter imidlertid, at de tre aktive steder i miiuy croaker calpain2a ikke påvirker ekspressionen af ​​TRAF6-proteinniveauer, men mutant calpain2a, der mangler hydrolasedomæne, gør. Derfor valgte vi at mutere hele det enzymaktiverende strukturelle domæne. Selvom protein calpain2a er relativt konserveret i pattedyr og lavere hvirveldyr, fortjener de specifikke enzymatiske aktivitetssteder yderligere undersøgelse.

cistanche planteforøgende immunsystem

Sammenfattende identificerede vi calpain2a som en negativ regulator af LPS-induceret NF-KB-signalering og virus-induceret IFN-aktivering (fig. 9e). I massespektrometri kan calpain2a interagere med TRAF6, og vi demonstrerede dette fænomen ved endogent co-immunpræcipitationseksperiment. Vi fandt ud af, at calpain2a er involveret i reguleringen af ​​den LPS-inducerede NF-KB-signalvej. Derudover spiller TRAF6 også en vigtig rolle i antivirale signalveje. Vi brugte SCRV og Ploy (I: C) til at stimulere IFN-signalvejen og fandt ud af, at calpain2a også kan hæmme IFN-signalering ved at regulere proteinniveau og autoubiquitinering af TRAF6. Da TLR3 kan genkende den dobbeltstrengede RNA (dsRNA) struktur produceret af virale infektioner. Vi er mere interesserede i at belyse calpain2a-regulering af TRAF6-medieret IFN-signalvej, men udelukker ikke et potentielt forhold mellem calpain2a og TLR3-signalvej. calpain2a fremmede nedbrydningen af ​​TRAF6 på en hydrolytisk måde og interagerede med TRAF6 for at hæmme dannelsen af ​​dimerer og auto-ubiquitinering. Denne hæmning forhindrede interaktionen mellem TRAF6 og ECSIT og ubiquitineringsoverførselsprocessen fra TRAF6 til ECSIT, BECN1, IRF3 og IRF7. Vores nuværende resultater vil bidrage til forståelsen af ​​de negative reguleringsmekanismer ved at målrette TRAF6 i medfødte immunresponser. Derudover viser denne forskning nøglerollen af ​​TRAF6-homoligomerisering og auto-ubiquitinering i processen med fisks medfødte immunrespons. Samtidig foreslås calpain2a som et regulatorisk protein til at hæmme immunresponset af TRAF6 og forhindre de normale og velordnede signalveje. Indsigten er nyttig til at forstå hvirveldyrs immunologi og udviklingen af ​​hvirveldyrs immunsystem.

Fig. 8 calpain2a inhiberer SCRV- eller Poly(I:C)-induceret IFN-aktivering. ab EPC-celler blev transficeret med forskellige koncentrationer af calpain2a-Flag eller tom vektor sammen med IFN-1-, ISRE- og IRF3-pro-luciferase-reportere. 24 timer efter transfektion blev celler falske inficerede eller inficerede med SCRV eller Poly(I:C) i 12 timer (n=3 pr. gruppe). Western blot-analyse blev brugt til at måle ekspressionen af ​​forbigående transficeret calpain2a-Flag. Ekspressionen af ​​Tubulin blev anvendt som en ladningskontrol. c, d Viperin, Mx1, ISG15 mRNA i MKC stabilt transduceret med si-calpain2a #1 eller si-ctrl (kontrolvektor) og behandlet med saltvand (0) eller udfordret med SCRV eller Poly(I:C) for 24 timer. Relativt mRNA-niveau blev normaliseret til ekspressionen af ​​genet, der koder for -actin i hver prøve (n=3 pr. gruppe). e, f MKC-celler blev transficeret med enten si-ctrl eller si-calpain2a #1. 24 timer efter transfektion blev cellerne stimuleret med SCRV i 24 timer, derefter blev cellelevedygtighedsassay og celleproliferationsassay målt (n=3 pr. gruppe). Målestok, 100 μm. g MKC-celler blev transficeret med calpain2a-Flag eller pcDNA3.1, derefter inficeret med SCRV i 24 timer (n=3 pr. gruppe). qRT-PCR-analysen blev udført for intracellulær og supernatant SCRV RNA-ekspression. Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige eksperimenter. Data blev analyseret ved envejs ANOVA (a, b), tovejs ANOVA (c, d, e, f) eller to-halet Students t-test (g). *p < 0,05, **p < 0,01.

Metoder

Cellekultur.

Humane embryonale nyre (HEK) 293 cellelinjer og Epithelioma papulosum cyprini (EPC) cellelinjer, blev købt fra American Type Culture Collection og opbevaret i vores laboratorium. Miiuy croaker (M. miiuy) nyrecellelinjer (MKC) og Miiuy croaker intestine cellelinjer (MIC) blev dyrket fra nyre- og tarmvæv fra miiuy croaker57,58. Miiuy croaker nyrecellelinjer og Miiuy croaker tarmcellelinjer blev dyrket ved 26 grader i en befugtet inkubator indeholdende 0,5 % CO2 i L-15 medium (HyClone, USA) suppleret med 15 % FBS (Gibco) , USA), 100 U/ml penicillin (Gibco, USA), 100 ug/ml streptomycin (Gibco, USA) og 20 U/ml heparin (Solarbio, Kina). Epithelioma papulosum cyprini-celler blev dyrket ved 26 grader i en fugtig inkubator indeholdende 5 % CO2 i medium 199 (Hyclone) suppleret med 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin. Humane embryonale nyre 293-celler blev dyrket ved 37 grader i en fugtig inkubator indeholdende 5 % CO2 i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Invitrogen) suppleret med 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 mg. /ml streptomycin.

Fig. 9 calpain2a hæmmer TRAF6-medieret ubiquitinering af IRF7 og IRF3. b HEK293-celler blev cotransficeret med IRF3-Myc, TRAF6-HA og WTubiquitin-His eller K63O-ubiquitin-His (hvori kun lysin 63 opbevares) sammen med calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc -Flag eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og oprenset med Ni-NTA agarose. c, d HEK293-celler blev cotransficeret med IRF7-Myc, TRAF6-HA og WT-ubiquitinHis eller K63O-ubiquitin-His (hvor kun lysin 63 opbevares) sammen med calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-Flag eller tom vektor. Efter 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og oprenset med Ni-NTA agarose. Alle immunpræcipitater og input med anti-Myc, anti-Flag, anti-HA og anti Tubulin Abs. Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige eksperimenter. e Model, der beskriver calpain2as roller i TRAF6-medierede signalveje. Ved LPS og virus kunne TRAF6 aktiveres, homo-oligomerisering og auto-ubiquitinering. BECN1, ECSIT, IRF7 og IRF3 er ubiquitineret af TRAF6 og udløser aktiveringen af ​​downstream-signaler. calpain2a som en negativ regulator målretter TRAF6 for at hæmme TRAF6-medierede signalveje.

Referencer

1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Patogengenkendelse og medfødt immunitet. Cell 124, 783-801 (2006).

2. Takeuchi, O. & Akira, S. Mønstergenkendelsesreceptorer og inflammation. Celle 140, 805-820 (2010).

3. Wu, J. & Chen, ZJ Medfødt immunfornemmelse og signalering af cytosoliske nukleinsyrer. Annu. Rev. Immunol. 32, 461-488 (2014).

4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Toll-lignende receptorer. Curr. Biol. 21, R488-R493 (2011).

5. Schlee, M. Master sensorer af patogen RNA - RIG-I lignende receptorer. Immunobiologi 218, 1322-1335 (2013).

6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS. NLR-proteiner: integrerede medlemmer af medfødt immunitet og mediatorer af inflammatoriske sygdomme. J. Leukoc. Biol. 83, 13-30 (2008).

7. Akira, S. & Hemmi, H. Genkendelse af patogen-associerede molekylære mønstre af TLR-familien. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).

8. Kawai, T. & Akira, S. Rollen af ​​mønstergenkendelsesreceptorer i medfødt immunitet: opdatering om Toll-lignende receptorer. Nat. Immunol. 11, 373-384 (2010).

9. Kawagoe, T. et al. Sekventiel kontrol af Toll-lignende receptorafhængige responser af IRAK1 og IRAK2. Nat. Immunol. 9, 684-691 (2008).

10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4-en delt NF-kappaB-aktivator i medfødt og erhvervet immunitet. Trends Immunol. 27, 566-572 (2006).

11. Kawai, T. & Akira, S. TLR-signalering. Celledød er forskellig. 13, 816-825 (2006).

12. Deng, L. et al. Aktivering af IkappaB-kinasekomplekset af TRAF6 kræver et dimert ubiquitin-konjugerende enzymkompleks og en unik polyubiquitinkæde. Cell 103, 351-361 (2000).

13. Ninomiya-Tsuji, J. et al. Kinase TAK1 kan aktivere NIK-I kappaB såvel som MAP kinase kaskaden i IL-1 signalvejen. Nature 398, 252-256 (1999).

14. Takaesu, G. et al. TAB2, et nyt adapterprotein, medierer aktivering af TAK1 MAPKKK ved at forbinde TAK1 til TRAF6 i IL-1-signaltransduktionsvejen. Mol. Celle. 5, 649-658 (2000).

15. Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm-medieret translokation af TRAF6 og TAB2 i den interleukin-1-inducerede aktivering af NF-kappa BJ Biol. Chem. 276, 41661-41667 (2001).

16. Yin, Q. et al. E2-interaktion og dimerisering i krystalstrukturen af ​​TRAF6. Nat. Struktur. Mol. Biol. 16, 658-666 (2009).

17. Wang, C. et al. TAK1 er en ubiquitin-afhængig kinase af MKK og IKK. Nature 412, 346-351 (2001).

18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF-celletypespecifik funktion af TAK1 i medfødt immunsignalering. Trends Immunol. 34, 307-316 (2013).

19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW & Cohen, P. En uventet drejning til aktiveringen af ​​IKKbeta: TAK1 primer IKKbeta til aktivering ved autophosphorylering. Biochem. J. 461, 531-537 (2014).

20. Emmerich, CH et al. Aktivering af det kanoniske IKK-kompleks med K63/M1--koblede hybride ubiquitinkæder. Proc. Natl Acad. Sci.110, 15247-15252 (2013).

21. Kawai, T. et al. Interferon-alfa-induktion gennem Toll-lignende receptorer involverer en direkte interaktion af IRF7 med MyD88 og TRAF6. Nat. Immunol. 5, 1061-1068 (2004).

22. Kitagawa, Y. et al. Humant parainfluenzavirus type 2 V-protein hæmmer TRAF6-medieret ubiquitinering af IRF7 for at forhindre TLR7- og TLR9--afhængig interferoninduktion. J. Virol. 87, 7966-7976 (2013).

23. Kawai, T. et al. IPS-1, en adapter, der udløser RIG-I- og Mda5-medieret type I-interferoninduktion. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).

24. Zust, R. et al. Ribose 2'-O-methylering giver en molekylær signatur til skelnen mellem selv- og ikke-selv-mRNA afhængig af RNA-sensoren Mda5. Nat. Immunol. 12, 137-143 (2011).

25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ Identifikation og karakterisering af MAVS, et mitokondrielt antiviralt signalprotein, der aktiverer NF kappaB og IRF 3. Cell 122, 669-682 (2005).

26. Xu, LG et al. VISA er et adapterprotein, der kræves til virusudløst IFN beta-signalering. Mol. Celle. 19, 727-740 (2005).

27. Yoshida, R. et al. TRAF6 og MEKK1 spiller en central rolle i den RIG-I-lignende helicase antivirale vej. J. Biol. Chem. 283, 36211-36220 (2008).

28. Liu, S. et al. MAVS rekrutterer flere ubiquitin E3-ligaser for at aktivere antivirale signalkaskader. Elife 2, e00785 (2013).

29. Ivashkiv, LB & Donlin, LT Regulering af type I interferonresponser. Nat. Rev. Immunol. 14, 36-49 (2014).

30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. Mekanisme for ubiquitinoverførsel fremmet af TRAF6. Proc. Natl Acad. Sci. 115, 1783-1788 (2018).

31. Boone, DL et al. Det ubiquitin-modificerende enzym A20 er påkrævet for at afslutte Toll-lignende receptorresponser. Nat. Immunol. 5, 1052-1060 (2004).

32. Kovalenko, A. et al. Tumorsuppressoren CYLD regulerer negativt NF kappaB-signalering ved deubiquitinering. Nature 424, 801-805 (2003).

33. He, X. et al. USP2a regulerer negativt IL-1beta- og virus-induceret NF kappaB-aktivering ved at deubiquitinere TRAF6. J. Mol. Cell Biol. 5, 39-47 (2013).

34. Xiao, N. et al. Ubiquitin-specifik protease 4 (USP4) retter sig mod TRAF2 og TRAF6 til deubiquitinering og hæmmer TNFalpha-induceret cancercellemigration. Biochem. J. 441, 979-986 (2012).

35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Ubiquitin-specifik peptidase 20 er rettet mod TRAF6 og human T-celleleukæmivirus type 1-skat for negativt at regulere NF-kappaB-signalering. J. Virol. 85, 6212-6219 (2011).

36. Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O regulerer TRAF6-medieret NF-kappaB-aktivering negativt ved at hæmme TRAF6-polyubiquitinering. Cell Res. 23, 366-377 (2013).

37. Wi, SM et al. TAK1-ECSIT-TRAF6-komplekset spiller en nøglerolle i TLR4-signalet for at aktivere NF-kappaB. J. Biol. Chem. 289, 35205-35214 (2014).

38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY Inhibering af TRAF6 ubiquitin-ligase-aktivitet af PRDX1 fører til inhibering af NFKB-aktivering og autofagi-aktivering. Autophagy 14, 1347-1358 (2018).

39. Jiao, S. et al. Kinasen MST4 begrænser inflammatoriske responser gennem direkte phosphorylering af adapteren TRAF6. Nat. Immunol. 16, 246-257 (2015).

40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 og Calpain-2: Yin og Yang af Synaptisk Plasticitet og Neurodegeneration. Tendenser Neurosci. 39, 235-245 (2016).

41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Regulering af cellemigration: calpains gør snittet. J. Cell Sci. 118, 3829-3838 (2005).

42. Katsube, M. et al. Calpain-medieret regulering af de forskellige signalveje og cellemigration i humane neutrofiler. J. Leukoc. Biol. 84, 255-263 (2008).

43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Virkningerne af calpain-hæmning på IkB-alfa-nedbrydning efter aktivering af PBMC'er: identifikation af calpain-spaltningssteder. Neurochem. Res. 29, 1443-1451 (2004).

44. Tompa, P. et al. Om de sekventielle determinanter for calpain-spaltning. J. Biol. Chem. 279, 20775-20785 (2004).

45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL Bestemmelse af peptidsubstratspecificitet for mu-calpain ved en peptidbiblioteksbaseret tilgang: vigtigheden af ​​primede sideinteraktioner. J. Biol. Chem. 280, 40632-40641 (2005).

46. ​​DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Calpain-spaltningsforudsigelse ved hjælp af multiple kernel learning. PLoS One. 6, e19035 (2011).

47. Shi, CS & Kehrl, JH TRAF6 og A20 regulerer lysin 63-koblet ubiquitination af Beclin-1 for at kontrollere TLR4-induceret autofagi. Sci. Signal. 3, ra42 (2010).

48. Loo, YM & Gale, M. Immunsignalering af RIG-I-lignende receptorer. Immunity 34, 680-692 (2011).

49. Ling, T. et al. TARBP2 hæmmer IRF7-aktivering ved at undertrykke TRAF6-medieret K63-koblet ubiquitinering af IRF7. Mol. Immunol. 109, 116-125 (2019).

50. Zhou, Z. et al. Zebrafisk otud6b regulerer negativt antivirale responser ved at undertrykke K63-koblet ubiquitinering af irf3 og irf7. J. Immunol. 207, 244-256 (2021).

51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. Rollen af ​​TRAF6 i signaltransduktion og immunrespons. Mikrober inficerer. 6, 1333-1338 (2004).

52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, en molekylær bro, der spænder over adaptiv immunitet, medfødt immunitet og osteoimmunologi. Bioessays 25, 1096-1105 (2003).

53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: strukturer, funktioner, mekanismer. Biochim. Biofys. Acta. 1695, 55-72 (2004).

54. Pickart, CM & Fushman, D. Polyubiquitin-kæder: polymere proteinsignaler. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 610-616 (2004).

55. Lamothe, B. et al. Stedspecifik Lys-63-koblet tumornekrosefaktorreceptorassocieret faktor 6 auto-ubiquitinering er en kritisk determinant for I kappa B-kinaseaktivering. J. Biol. Chem. 282, 4102-4112 (2007).

56. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Tumornekrosefaktor-alfa-inducerbar IkappaBalpha-proteolyse medieret af cytosolisk m-calpain. En mekanisme parallel med ubiquitin-proteasom-vejen til nuklear faktor-kappa B-aktivering. J. Biol. Chem. 274, 787-794 (1999).

57. Chu, Q. et al. Et meget konserveret cirkulært RNA circRasGEF1B forbedrer antiviral immunitet ved at regulere miR-21-3p/MITA-vejen hos lavere hvirveldyr. J. Virol. 95, e02145-20 (2021).

58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a inducerer autofagi til at blokere NF-kappaB-signalering og apoptose for at lette Vibrio harveyi-infektion. iScience 26, 106105 (2023).

59. Sepulcre, MP et al. Udvikling af lipopolysaccharid (LPS) genkendelse og signalering: fisk TLR4 genkender ikke LPS og regulerer negativt NF kappaB aktivering. J. Immunol. 182, 1836-1845 (2009).

60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. Det lange ikke-kodende RNA NARL regulerer immunresponser via mikroRNA-medieret NOD1-nedregulering i teleostfisk. J. Biol. Chem. 296, 100414 (2021).

61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Exon-Intron cirkulært RNA circRNF217 fremmer medfødt immunitet og antibakteriel aktivitet i teleostfisk ved at reducere miR-130-3p Fungere. J. Immunol. 208, 1099-1114 (2022).

62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Rhabdovirus-inducerbart mikroRNA-210 modulerer antiviralt medfødt immunrespons via målretning efter STING/MITA i fisk. J. Immunol. 201, 982-994 (2018).

63. Bi, D. et al. Anerkendelse af lipopolysaccharid og aktivering af NF-kappaB af cytosolisk sensor NOD1 i Teleost Fish. Foran. Immunol. 9, 1413 (2018).

64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 og IRF8 Regulerer NF-kappaB-signalering ved at målrette MyD88 i Teleost Fish. Foran. Immunol. 11, 606 (2020).

65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k hæmmer NF-kappaB-signalering ved at målrette MyD88 for ATG5-medieret autofagisk nedbrydning i teleostfisk. J. Biol. Chem. 298, 101730 (2022).