Målretning af cathepsin B af cycloastragenol øger antitumorimmuniteten af ​​CD8 T-celler via inhibering af MHC-I-nedbrydning del 1

ABSTRAKT

BaggrundTabet af tumorantigener og udtømning af CD8 T-celler forårsaget af PD-1/PD-L1-vejen er vigtige faktorer for tumorimmunescape. I de senere år har der været stigende forskning i traditionel kinesisk medicin i tumorbehandling. Cycloastragenol (CAG), et effektivt aktivt molekyle i Astragalus membranaceus, har vist sig at have antivirale, antialdrende, antiinflammatoriske og andre funktioner. Imidlertid er dens antitumoreffekt og mekanisme ikke klar.

Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af ​​SOD i hjerte- og levervæv og reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv betydeligt, effektivt opfange forskellige reaktive oxygenradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytte mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en stærk opfangningsevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af ​​SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på spermmembranfunktionen. Cistanche-polysaccharider kan øge aktiviteten af ​​SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af ​​SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescerende mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacosid i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH-frie radikaler og har evnen til at opfange reaktive oxygenarter og forhindre frie radikal-induceret kollagen-nedbrydning, og har også en god reparationseffekt på anionskader af thymin frie radikaler.

Klik på cistanche fordele og ulemper

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

MetoderAntitumoreffekten af ​​CAG blev undersøgt i MC38 og CT26 musetransplanterede tumormodeller. Antitumoreffekten af ​​CAG blev yderligere analyseret via enkeltcellet multi-omics-sekventering. Mål-responsiv tilgængelighedsprofileringsteknologi blev brugt til at finde målproteinet for CAG. Efterfølgende blev antitumormekanismen af ​​CAG undersøgt ved hjælp af konfokal mikroskopi, immunpræcipitation og transfektion af mutante plasmider. Endelig blev den kombinerede antitumoreffekt af CAG- og PD-1-antistoffer i mus eller organoider undersøgt.

ResultaterVi fandt ud af, at CAG effektivt hæmmede tumorvækst in vivo. Vores single-celle multi-omics atlas viste, at CAG fremmede præsentationen af ​​tumorcelleoverfladeantigener og var karakteriseret ved den forbedrede dræbende funktion af CD8 plus T-celler. Mekanistisk bandt CAG til dets målprotein cathepsin B, som derefter hæmmede den lysosomale nedbrydning af det store histokompatibilitetskompleks I (MHC-I) og fremmede aggregatet n af MHC-I til cellemembranen, hvilket øgede præstationen af ​​tumorantigenet. . I mellemtiden forbedrede kombinationen af ​​CAG med PD-1-antistof effektivt tumordræbende tumor-dræbende CD8 plus T-celler i xenograft-mus og kolorektal cancerorganoider. Konklusion Vores data rapporterede for første gang, at cathepsin B-nedregulering bibringer antitumorimmunitet og uddaterer antitumormekanismen for naturligt produkt CAG.

INTRODUKTION

Kolorektal cancer er en af ​​de mest almindelige kræftformer på verdensplan. Dets incidensrate og dødelighed er blandt de tre bedste, hvilket er en alvorlig trussel mod menneskers liv og helbred.1 Almindelige behandlingsmetoder omfatter kirurgiske kemoterapi og strålebehandling, målrettede lægemidler og immunterapi.2-4 Kræftceller udviser dog normalt tab af overfladeantigener og udtrykker høje niveauer af hæmme molekyler for at undslippe overvågningen af ​​immunceller. For at løse problemet med tumorimmunflugt har forskere udviklet immun checkpoint-hæmmere og neoantigen-terapi til at blokere maskeringen af ​​kræftceller til immunceller. celler er ikke blevet im ved væsentligt. Derfor er det særligt vigtigt at finde lægemidler, der kan fremme præsentationen af ​​tumoroverfladeantigener. Genkendelsen af ​​cancerceller af cytotoksiske CD8 plus T-celler afhænger af TCR/CD3/major histocompatibility complex (MHC-I) pathway. TCR modtager antigenet til stede af dendritiske celle/cancercellemembranprotein CI og transmitterer signalet til tæt forbindelse CD3, som derefter strækker sig dybere ind i cytoplasmaet.9 10 Samtidig med aktiveringen af ​​CD28/B7-signalet , CD8 plus T-celler kan coaktiveres til at genkende og dræbe cancerceller.11 Nylige undersøgelser har fundet ud af, at lysosomer i processen med tumorprogression resulterer i en reduktion af MHC-I-aggregering på overfladen af ​​cancerceller, hvilket ikke er effektivt tilstedeværende antigener.12 13 Liu et al rapporterede, at inhibering af PCSK9 kan forhindre nedbrydning af MHC-I i lysosomer og gøre det muligt for MHC-I at vende tilbage til cellemembranen for at præsentere antigener.12 Derfor genoprettes den antigenpræsenterende funktion. af MHC-I er særlig vigtig for at blokere tumorimmunescape.

Et stigende antal undersøgelser har fundet ud af, at anvendelsen af ​​aktive molekyler fra traditionel kinesisk medicin n antitumorintervention har store perspektiver.14 15 Cycloastragenol (CAG) er et effektivt aktivt molekyle n Astragalus membranaceus, som har antiviral, antibakteriel, anti- inflammatoriske og andre farmakologiske virkninger, men dens antitumoreffekt er sjældent rapporteret.16-19 I denne undersøgelse fandt vi, at CAG hæmmede væksten af ​​transante tumorer i tyktarmskræfttumorer. Mekanismen indebar hovedsageligt hæmning af nedbrydningen af ​​MHC-I, medieret af cathepsin B (CTSB), der fremmer antigenpræsentationen af ​​kræftceller og øger derefter dræbeevnen af ​​CD8 plus T-celler.

MATERIALER OG METODER

Antistoffer og reagenser

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 procent). Antistoffer af CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), Actin (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695) ​​og Anti-mus/kanin immunhistokemi detektionskit (Cat#PK10006) blev købt hos Proteintech. Antistoffer af H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), og CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) blev købt fra Santa Cruz Biotechnology. Antistof af Ki-67 (kat#12202, PRID: AB_2620142) blev købt fra Cell Signaling Technology. Antistof af Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) blev købt fra Abcam. Flowcytometri-antistoffer af CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003) og CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) blev købt fra BD Bioscience. Flowcytometri-antistof af Gzmb-FITC (kat. nr. 515403, RRID: AB_2114575) blev købt fra BioLegend. Flowcytometri-antistoffer af NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) og IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) blev købt hos Thermo Fisher Scientific. DMEM-medium (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122) og føtalt bovint serum (Cat#C04001-500) blev købt fra Biological Industries. Gedeserum (kat#88RNG001) og Pierce BCA proteinassaykit (kat#23225) blev købt fra Thermo Fisher Scientific. Antistofferne af anti-human PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) og anti-muse PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) blev købt fra Bio X celle. MACS Tumor Tissue Dissociation Kit (Cat#130-095-929) blev købt fra Miltenyi Biotec.

Cellekultur

Muse tyktarmskræftcellelinjer MC38 og CT26 blev vedligeholdt i vores laboratorium.20 De humane tyktarmskræft-l-linjer HCT-116 blev opnået fra Type Culture Collection fra det kinesiske videnskabsakademi (Shanghai, Kina). MC38-, CT26- og HCT-116-cellerne blev dyrket i et DMEM-medium indeholdende 10 procent føtalt bovint serum og 1 procent penicillin/streptomycin ved 37 grader i en 5 procent CO2-inkubator.

Transplantation tumor eksperiment

Seks-otte uger gamle C57BL/6JGpt hunmus, BALB/c mus og BALB/,c nøgne mus blev købt fra GemPharmatech (Nanjing, Kina). MC38 eller CT26 cancerceller (1×106) blev podet subkutant i hver mus. Når tumoren voksede til 100 mm3, blev mikrofonen tilfældigt opdelt i phosphatbufret saltvandsgruppe (PBS) (f.eks. en gang om dagen) og CAG-gruppen (f.eks. 50 mg/kg en gang om dagen). Tumorvolumener blev bestemt ved calipermåling ved hjælp af formlen V=længde×bredde2/2. Når tumorvolumenet af PBS-gruppemusene nåede 1000 mm3, blev tumoren fra mus taget ud, fotograferet og vejet.

Enkeltcellet dissociation fra musen for enkeltcellet RNA/ATACseq

Faste tumorer fra mus blev fordøjet under anvendelse af Tumor Dissociation Kit til opnåelse af enkeltcellede enkeltceller. EnkeltcelleEnkeltcelle med en koncentration på 1000 celler/1000 celler indlæst på 10×genomics kromcontrollerenkeltcellede enkeltceller efter 10×genomics-producentens protokol. Revers transkriptionsreagenser, stregkodede gelperler og partitioneringsolie blev blandet med cellerne til gen for at generere gelperler i emulsioner (GEM) til omvendt transkription. scRNA-seq data forbehandling og kva y kontrol.

Baseret på musereferencegenomet GRCm38 (mm10), CellRanger V.4.0.0 pipeline (10×Genomics) til at behandle enkeltcellet RNA sekvensdata for hvert eksperiment (GSE197229). Digitale genekspressionsmatricer blev zed i R (V.4.0.4) ved hjælp af Seurat (V.4.0.0)-pakken.21 Før dBeforem-analyse blev celler filtreret efter UMI-nummer (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq dataforbehandling og kvalitetskontrol

De enkeltcellede ATAC-seq-data (GSE197229) blev forbehandlet af celle ranger-at (V.2.0.0) med count-kommandolinjen. Til den efterfølgende scATAC-seq databehandling og analyse brugte vi ArchR (V.1.0.1) pakken.24 Derefter brugte vi addArchRGethe nome ('mm10') funktionen til genom annotering og oprettede en pilfil med cre ArrowFiles-funktionen med standardparametrene. Dernæst brugte vi filterDoublets-funktionen til at slette de potentielle dubletter og oprettede et ArchR-projekt ved hjælp af ArchRProject-funktionen med standardparametre. Vi brugte derefter Harmony-pakken til at fjerne batch-effekten af ​​addHarmony-funktionen.25 Til dimensionsreduktion bruger vi addIterativeLSI-funktionen i ArchR til at køre med def t-parametrene. Til indlejring af enkeltceller valgte vi reduceret Dims-objektet med harmoni og brugte addTSNE-funktionen med parameteren 'perplexity=30' til visualisering.

Integreret analyse af siRNA-seq og scATAC-seq data

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. For at forbedre nøjagtigheden af ​​forudsigelserne for bedre at integrere de to datasæt, integrerede vi endnu en gang scATAC-seq og scRNA-seq-dataene ved hjælp af 'begrænset integration'-tilstand. Kort fortalt annoterede vi scATAC-seq-dataene med celletyper baseret på genscorerne for scATAC-seq. Derefter oprettede vi en begrænset liste, således at genekspressionslighed kun blev beregnet i den samme celletype for både scATAC-seq og scRNA-seq. Uovervåget klyngedannelse med t-SNE afslørede 13 subcelleklynger, som blev annoteret af kendte eller formodede markører i online supplerende tabel 1.

Pseudotids-slægtsbane

Cellelinjebanen for cancerceller blev udledt ved at bruge Monocle2 (V.2.18.0) R-pakke.26 Monocytter lærer den eksplicitte mastergraf fra enkeltcellede genomiske data ved Reversed Graph Embedding til at sortere celler og dermed løse komplekse biologiske processer robust og præcist.27 Vi brugte ''differentialGeneTest''-funktionen til at udlede DEG fra hver klynge, og efter at have konstrueret cellebanen, detekterede vi de differentielt udtrykte gener i pseudotiden. Alle pseudotidsafhængige gener blev visualiseret af plot_pseudotime_heatmap-funktionen, der tog et CellDataSet-objekt. Linjebaneplot og glatte udtrykskurver baseret på CellDataSet blev genereret af plot_celle_trajectory og plot_gener_i henholdsvis_pseudotid.28

Enkeltcellet kopinummervariationsopkald

For at identificere maligne celler med klonale storskala kromosomale kopiantal variationer (CNV), brugte vi inferCNV R-pakken til at udlede de genetiske profiler for hver celle baseret på den gennemsnitlige ekspression af store gensæt i hver kromosomal region af tumorgenomet sammenlignet med normale celler.29 På prøve-for-prøve basis blev immuncellerne brugt som reference til at estimere CNV'er i de cancerrelaterede celler.

Berigelsesanalyse

KEGG-sti- og GO-annotationsanalyser blev udført ved hjælp af R-pakken clusterProfiler (V.3.11.1) med parametrene PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 og MaxGSSize=500.20Gensætberigelsesanalyse (GSEA) blev anvendt ved hjælp af 50 kendetegnende gensæt (h.all.V.7.4.symbols. gmt) for at identificere signifikant berigede funktionelle veje via GSEA-software (V.4.1.0), med screeningskriterier for nominel P-værdi<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Kvantitativ PCR-analyse i realtid

MC38- og HCT-116-celler blev podet i plader med seks brønde i 6 timer og derefter behandlet med CAG i yderligere 24 timer. Cellerne blev vasket tre gange med kold PBS og centrifugeret ved 18 0g i 5 minutter ved 4 grader. På samme tid, efter slibning af tumorvævet. Total RNA blev ekstraheret fra MC38, HCT-116-celler og tumorvæv ved hjælp af TRIzol-reagenset i henhold til producentens instruktioner. Reaktionsvolumenet var 20 µL indeholdende: 1 µg RNA, 5 µL 5×Hiscript III qRT SuperMix og RNase Free dH2 O. cDNA'et blev underkastet kvantitativ PCR, med et reaktionsvolumen på 10 µL med 1 µL cDNA, 5 µL qPCR5-mixer, 5µL qPCR5-mixer. (Forward og Reverse) og 3,25 µL RNase-fri dH2O. Primerne blev syntetiseret af GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Kina) i henhold til følgende sekvenser (online supplerende tabel 2).

Målopdagelse via en mål-responsiv tilgængelighedsprofileringstilgang

Screeningen af ​​CAG-bindende proteiner blev udført som beskrevet tidligere.31 32 Kort fortalt blev den target-responsive accessibility profiling (TRAP) tilgang anvendt til at opdage bindingsproteinerne for CAG i cellemiljøet ved at overvåge ligand engagement-induceret lysin tilgængelighedsændringer på proteomniveau. Kort fortalt blev to skåle af celler behandlet med henholdsvis 1 0 µM CAG og dimethylsulfoxid (DMSO). Efter 1-timers inkubation blev cellerne permeabiliseret af M-PER-buffer (Thermo Scientific), og de resulterende lysater blev kovalent mærket ved tilsætning af formaldehyd og boran-pyridinkompleks, der sammen specifikt mærker proteinholdige lysinrester ved stuetemperatur til tilgængelighedsprofilering . Derefter blev lysaterne præcipiteret med organisk opløsningsmiddel, og de opsamlede pellets blev genopløst i 8 mol/L urinstof, reduceret med dithiothreitol (DTT) ved 56 grader i 30 minutter, efterfulgt af alkylering under anvendelse af iodacetamid (IAA) i mørke i 30 minutter. En passende mængde DTT-opløsning blev tilsat igen for at reagere med overskydende IAA. Efterfølgende blev proteomet fortyndet med ammoniumbicarbonatopløsning, indtil slutkoncentrationen af ​​urinstof når 1 mol/L. De opsamlede proteinfordøjelser blev afsaltet på C18 HLB-søjler (Waters, Milford, Massachusetts, USA), og de berigede peptider blev tørret og rekonstitueret i 0,1 procent myresyre (FA) vandig opløsning. AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF-system (Waters) blev anvendt til at analysere prøverne for kvantitativ profilering af lysintilgængelighedsændringerne som reaktion på CAG-binding til målopdagelse. Dataafhængighedsopsamling i positiv tilstand blev anvendt til dataindsamling. Dataanalyse blev udført under anvendelse af PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Canada). Specifikt blev cys-alkylering valgt som en fast modifikation, og methioninoxidation og lysindimethylering, opnået ved TRAP-mærkning, blev sat som variable modifikationer. Kort fortalt blev peptider, der indeholder TRAP-induceret dimethylering og udviste signifikante abundanceændringer med og uden CAG-inkubation, tildelt som mål-responsive peptider. Forholdet mellem mængden af ​​hvert TRAP-mærket peptid indikerer omfanget af tilgængelighedsændring og er tæt forbundet med ligand-bindingsaffinitet. Students t-test blev udført for at vurdere, om de påviste tilgængelighedsændringer af mærkede peptider er statistisk signifikante. En intergruppe-p-værdi (s<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Organoid kultur

De humane kolorektal cancerorganoider blev konstrueret og dyrket af Chongqing Kingbiotech.33 Patientvævsprøver erhvervet ved den kirurgiske operation blev hakket i så små stykker som muligt med sterile sakse. Vævsstykkerne blev blandet grundigt med Matrigel (Corning, Cat#356231) i det omtrentlige forhold på 1:4 på is. Den efterfølgende behandling refererede til offentliggjorte protokoller. Kort fortalt blev stykkerne-Matrigel-suspensionerne podet hurtigt i multibrøndspladen for at danne halvkugleformede dråber og overført til 37 grader i 15-20 minutter, hvilket tillod dråberne at størkne. Tilføjede den passende mængde dyrkningsmedium (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​til hver brønd, og ændrede mediet hver 2.-4. dag.

Isolering og dyrkning af humane CD8 T-celler

Tilsæt den samme mængde normalt saltvand til det perifere blod hos raske mennesker, der indeholder antikoagulantia for at fortynde fuldblodet. Tilføj en vis mængde separationsopløsning til et 15 ml centrifugerør, tilsæt langsomt det fortyndede fuldblod langs rørvæggen til toppen af ​​separationsopløsningen, og centrifuger ved 750 g i 20 min. Efter centrifugering skal du bruge en pipette til forsigtigt at suge monocytterne i det mellemste hvide lag ind i et 15 ml centrifugerør, tilsæt en vis mængde PBS for at resuspendere, centrifuger 250 g i 5 minutter og kassér supernatanten. Efter tilsætning af humane CD8 magnetiske perler til cellepræcipitaterne blev CD8 T-celler sorteret efter LS-sorteringskolonne. CD8 T-celler blev tilføjet til den perforerede plade præ-coated med 5µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) antistof og derefter 10ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) og 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) funktionelle antistoffer blev tilsat dyrket i 24 timer.

Samkultur

Efter at organoiderne var inkuberet med CAG i 24 timer, blev det friske dyrkningsmedium erstattet, og derefter blev organoiderne og aktiverede CD8 T-celler suspenderet i matrixgelen, hvorefter suspensionen blev tilsat til seks-brøndspladen og placeret i 37 graders inkubator i 15 minutter, og derefter blev 2 ml serumfrit komplet dyrkningsmedium tilsat i 24 timer.

Vestlig blot

MC38- og HCT-116-celler blev podet i plader med seks brønde i 6 timer og derefter behandlet med CAG i yderligere 24 timer. Cellerne blev vasket tre gange med kold PBS og centrifugeret ved 180 g i 5 minutter ved 4 grader. Det totale protein blev lyseret med WB-IP-lyse indeholdende 1 procent proteaseinhibitor i 30 minutter på is. Totalt protein blev vurderet under anvendelse af et BCA-proteinkvantificeringskit. Proteinprøver blev adskilt ved 10 procent –12 procent SDS polyacrylamid gelelektroforese og overført til PVDF (polyvinylidenfluorid) membraner ved 350 mA i 90 min. PVDF-membranerne blev blokeret med 5 procent BSA i 1 time, strimlerne med det angivne primære antistof natten over og med det sekundære antistof inkuberet i 90 minutter ved stuetemperatur. Til sidst blev strimlerne detekteret under anvendelse af et LumiGLO kemiluminescerende substratsystem (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

Flowcytometri

Efter fordøjelsen af ​​tumorvæv og enkeltcellesuspensionen blev fremstillet. Overfladefarvning blev udført med overfladeantigen-antistoffer i FCM (Flow Cytometri) bufferen (PBS indeholdende 1 procent FBS) og farvet på is med passende antistoffer i 30 min. Reaktive farvestoffer (eBioscience) blev brugt til at fjerne døde celler. Intracellulær cytokinfarvning blev udført med BD-cellefiksativ opløsning/ekstracellulær membranopløsning, og cellerne blev fikseret og gennemtrængt og derefter farvet med antistoffer mod cytokiner i Perm/Wash buffer (BD Biosciences).

CTSB mutant plasmider transficeret

HCT-116-celler blev podet i 6-brøndsplader i 12 timer og derefter transficeret med CTSB-WT-EGFP- eller CTSB-mutantplasmider (Y75A, A77V og G198A) i 36 timer.

Transfektionsinterferens eller overekspressionsplasmid af CTSB i MC38-celler eller HCT-116-celler

MC38-celler (1×106/brønd) blev inokuleret i 6-brøndsplader i 6 timer, derefter transficeret med CTSB-interfererende RNA (sekvens: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT og Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) i 48 timer, og mRNA- eller proteinekspressionsniveauerne af Ctsb og H2-k1 blev detekteret. HCT-116-celler (1×106/brønd) blev inokuleret i 6-brøndsplader i 6 timer, derefter transficeret med CTSB-interferens (sekvens: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) eller overekspressionsplasmid i 48 timer, og mRNA'et eller proteinekspressionsniveauer af CTSB og HLA-A blev påvist.

Docking teknologi

3D-strukturen af ​​CTSB blev downloadet fra proteindatabasen (PDB ID: 2iPP), og strukturerne af CAG blev downloadet fra PubChem. Docking-processen blev udført i Autodock 2 med grov docking ved hjælp af en simuleret annealing-algoritme og en efterfølgende forfining ved hjælp af en genetisk algoritme.

Cellulært termisk skift-assay

MC38-cellerne blev podet i 10 cm plader natten over og derefter behandlet med CAG eller 0,1 procent DMSO i yderligere 2 timer. Cellerne blev opsamlet, vasket med kold PBS og centrifugeret ved 180 g i 5 minutter. Cellerne blev derefter jævnt fordelt i centrifugeringsrør (70 µL hvert rør) og opvarmet i 3 minutter ved følgende temperatur: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 og 67 grader, prøverne blev afkølet i 3 minutter ved temperaturer og derefter holdt på is. Derefter blev prøverne anbragt i et køleskab ved -80 grader natten over. Prøverne blev optøet ved stuetemperatur i 30 minutter og derefter nedkølet ved -80 grader i 4 timer. Til sidst blev prøverne centrifugeret ved 12, 000 g i 25 minutter, supernatanten blev tilsat til ladningsbufferen og analyseret ved Western blotting.

Immunhistokemisk farvning

Paraffinsnit af tumorvæv blev nedsænket i xylen i 20 minutter for at afvokse og derefter i 100 procent, 75 procent og 50 procent ethanol i 10 minutter. Efter at skiverne var blevet udsat for antigenreparation med natriumcitratantigenreparationsopløsning, blev det endogene hydrogenperoxid inaktiveret med 3 procent hydrogenperoxid. Efter blokering med 5 procent gedeserum i 1 time blev anti-Ki67-antistoffet (1:200) tilsat og inkuberet natten over ved 4 grader. Den anti-mus/kanin HRP-mærkede polymer (100 µL) blev tilsat, og prøver blev inkuberet ved 37 grader i 30 minutter, efterfulgt af 100 µL DAB-arbejdsopløsning og inkubation ved stuetemperatur i 5 minutter. Efter 1 minuts farvning med hæmatoxylin blev prøver vasket i 50 procent, 75 procent og 100 procent ethanol og xylen i 5 minutter, og neutral gummi blev brugt til at forsegle filmen. Filmen blev observeret og fotograferet under et mikroskop.

Statistiskanalyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-software (V.8.0). Alle resultater er udtrykt som middel ±SEM af tre uafhængige eksperimenter. En en-vejs variansanalyse efterfulgt af Dunnetts post hoc test blev brugt til at evaluere forskellene, når der var mere end to grupper. Elevens t-test blev brugt til at evaluere den signifikante forskel mellem de to grupper. En statistisk signifikans blev sat til s<0.05.

RESULTATER

Enkeltcellet multi-omics analyse af CAG, der hæmmer væksten af ​​transplanteret tyktarmskræft hos mus

For at undersøge, om CAG har en antitumoreffekt, transplanterede vi først MC38-kræftceller i C57BL/6-mus. Vi bemærkede, at CAG signifikant hæmmede væksten af ​​tumorer (online supplerende figur S1A, B). Efterfølgende transplanterede vi CT26-celler i BALB/c-mus og fandt ud af, at CAG også hæmmede væksten af ​​tumorer (online supplerende figur S1C, D).

For yderligere at afsløre den specifikke mekanisme, hvorved CAG hæmmer tumorvækst, analyserede vi det ved hjælp af scRNA-seq og scATAC-seq-teknikkerne (figur 1A). Vi opdelte cellepopulationen i fire grupper: cancerceller, fibroblaster, myeloidceller og lymfocytter (figur 1B, online supplerende figur S2A, B). Vi fandt ud af, at kræftceller (52 procent) og fibroblaster (41 procent) hovedsageligt blev infiltreret i tumorvæv, mens immunceller kun udgjorde 7 procent. Vi opdelte derefter kræftceller i otte undergrupper og fibroblaster i tre undergrupper (figur 1C-E). Efterfølgende viste berigelsesanalysen af ​​højt udtrykte gener i hver cellepopulation, at MHC-I molekylære veje i cancerceller blev beriget, ligesom antitumorsignalerne fra T-celler og NK-celler (online supplerende figur S2C). Derefter blev fire grupper af celler også fundet ved hjælp af scATAC-seq og scRNA-seq integrationsanalyse (figur 2D-G). Efter sammenligningen fandt vi ud af, at kræftceller (C01, C03-celler), CD8 plus T-celler, Spp1 plus TAM-celler og fibroblaster (F01- og F02-celler) optrådte i ATAC-sekventering (figur 1F, G) og yderligere udtrykte højt. transkriptionsfaktorer blev beriget i disse celler (figur 1H). Gennem disse analyser spekulerer vi i, at hæmningen af ​​tumorvækst af CAG er tæt forbundet med ændringer i disse celler.

Cag fremmer tumorcelleantigenpræsentation

For at analysere antitumormekanismen af ​​CAG analyserede vi først tumorcellepopulationen og opdelte kræftcellerne i otte undergrupper (figur 2A, B, online supplerende figur S3A). Resultaterne viste, at sammenlignet med PBS-gruppen faldt C05-gruppeceller signifikant, mens C07-gruppeceller steg (figur 2C). I mellemtiden sammenlignede vi CNV af lymfocytter og myeloidceller som referenceceller for at verificere nøjagtigheden af ​​vores tumorcelle-klynger. Resultaterne viste, at kræftcellers CNV var signifikant højere end for immunceller (online supplerende figur S3B). Ved analyse af undergrupperne af cancerceller fandt vi, at interferon-responsgenerne Isg15, Irf7, Ifit3 og Ifi47 var stærkt udtrykt i C07- og C08-cellepopulationerne i CAG-gruppen sammenlignet med PBS-gruppen (online supplerende figur S3C). Analysen af ​​tumorcellepopulationen viste, at antigenpræsentationsrelaterede veje var signifikant beriget i multiple cellepopulationer. Derfor spekulerer vi i, at CAG kan fremme antigenpræsentationen af ​​cancerceller til at spille en antitumorrolle (figur 2D). Derefter valgte vi de antigenpræsentationsrelaterede gener og fandt ud af, at ekspressionsniveauet i CAG-gruppen var signifikant højere end i PBS-gruppen (figur 2E, online supplerende figur S3D). Vi fandt også, at CAG fremmede antigenpræsentation i tumorvæv (figur 2F, G).

Dernæst brugte vi scATAC-seq til at analysere de specifikke årsager bag CAG-fremmende tumorcelleantigenpræsentation. Vi fandt, at tumorcellepopulationen i høj grad udtrykte transkriptionsfaktorerne Fos, Junb, Jund, Fosb og Fosl1 (figur 2H, I). Efterfølgende konstruerede vi et kort over interaktionen mellem transkriptionsfaktorer og tilsvarende gener for at forklare, at CAG fremmede ekspressionen af ​​tumorcelleantigen-præsenterende-relaterede gener (figur 2J). I tumorvæv fandt vi også, at transkriptionsfaktorer Junb, Fos, Jund og Fosb var signifikant overudtrykt i PBS-gruppen under CAG-behandling (figur 2K-N, online supplerende figur S3E-I). Indtil videre har vi fundet ud af, at CAG kan fremme ekspressionen af ​​transkriptionsfaktorer af antigen-præsenterende-relaterede gener og derved forbedre den antigen-præsenterende funktion af cancerceller. Men hvordan disse kræftceller reagerer på immuncelleresponser er stadig uklart.

For at afdække det fænomen, hvorved CAG fremmer antigenpræsentationen af ​​kræftceller, udførte vi baneanalyse for at undersøge, hvordan kræftceller ændrer hinanden som reaktion på immuncelleresponser. Vi fandt ud af, at C07-kræftceller over tid blev transformeret til C05-, C06- og C08-celler, og genberigelse viste også, at kræftceller ville transformere til antigenpræsentation (figur 3A-E).

CAG øger immuncellernes dræbende funktion

Disse resultater viser, at CAG kan præsentere tumorcelleantigener, så vil en forøgelse af tumorcelleantigenpræsentation føre til en forbedring af immuncellefunktionen? For at finde ud af dette analyserede vi henholdsvis lymfocytter og myeloidceller. Resultaterne viste, at CAG fremmede infiltrationen af ​​CD8 plus T-celler i tumorvæv, og infiltrationen af ​​CD8 plus T-celler og NK-celler blev også øget, detekteret ved flowcytometri (online supplerende figur S4A-F). Vi observerede også, at CAG forbedrede ekspressionen af ​​Ifitm2-, Cxcr6- og S100a6-gener i CD8 plus T-celler,

Fcer1g-, Gzmb-, AW112010- og Zfp36i2-gener i NK-celler og Nfkbia- og Junb-gener i CD4 plus T-celler (online supplerende figur S4G). Ekspressionen af ​​Ifng og Gzmb i CD8 plus T-celler blev også signifikant forbedret, som påvist ved flowcytometri (online supplerende figur S4H, I). Endvidere fandt vi, at efter CAG-behandling faldt ekspressionen af ​​de hæmmende receptorer Lag3, Tigit og Havcr2 på overfladen af ​​CD8 plus T-celler, og ekspressionen af ​​Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 og Pdcd1 generne, der karakteriserer aktivering af CD8 plus T-celler, steg signifikant (online supplerende figur S4J). For yderligere at verificere, at CAG forbedrede drabsfunktionen af ​​CD8 plus T-celler ved at fremme forbedret tumorantigenpræsentation, transplanterede vi CT26-celler i transplanterede tumorer i nøgne mus og observerede, at CAG ikke effektivt kunne hæmme væksten af ​​tumorer (online supplerende figur S4K-M ).

Efter dette analyserede vi myeloide celler og fandt ud af, at Spp1 plus TAM-celler steg efter CAG-behandling, mens antallet af C1qc plus TAM-celler faldt, og antallet af Il1b plus monocytter steg (online supplerende figur S5A-D). Efter CAG-behandling var Spp1 plus TAM og C1qc plus TAM celler mere modtagelige for pro-inflammatorisk TAM transformation. Berigelsesanalyse viste, at den hovedsageligt fokuserede på Tnf-, Ifn-g og den inflammatoriske responssignalvej (online supplerende figur S5E-H). Baseret på de ovennævnte resultater konkluderer vi, at CAG forbedrer genkendelsen og dræberfunktionen af ​​immunceller ved at fremme antigenpræsentation i cancerceller. Hvordan CAG reguleres er dog ikke klart.

Opdagelse af CAG-målproteinet CTSB ved fælde

Dernæst vil vi undersøge det specifikke CAG-målprotein, der spiller en antitumorrolle. Vi valgte kræftceller som forskningsobjekt, fordi vi fandt ud af, at CAG kan forbedre antigenpræsentationen af ​​kræftceller og derved forbedre immuncellernes dræbende funktion. Vi syntetiserede først biotinderivatet af CAG og fandt ud af, at kun 3-OH kunne reagere (online supplerende figur S6A). Vi undersøgte derefter, om CAG-biotin også fremmer ekspressionen af ​​antigenpræsentationsrelaterede gener i muse MC38-tumorcellelinjen. Resultaterne viser, at CAG-biotin ikke påvirkede ekspressionen af ​​H2-K1-, Cd74- og Anxa1-gener (online supplerende figur S6B-D).

Derfor brugte vi den tidligere TRAP-målsøgningsmetode i laboratoriet.32 CAG og DMSO blev begge inkuberet med MC38-cellelinjen (figur 4A). Vi valgte proteinet med FC større end eller lig med 2 og ap Mindre end eller lig med 0.05 som kandidatmålproteinet for CAG. Efter princippet om, at binding af små molekyler til proteiner vil føre til den lave mærkningseffektivitet af lysin, valgte vi CTSB til undersøgelsen (figur 4B). Dernæst brugte vi cellulær termisk skift-assay (figur 4C) og mikroskala termoforese (MST) (figur 4D) for at verificere bindingen mellem CAG og CTSB og fandt ud af, at affiniteten mellem CAG og CTSB var 26,6 nM (figur 4D). Efterfølgende forudsagde vi bindingsstederne mellem CAG og CTSB i henhold til proteinkrystalstrukturen af ​​CTSB i PDB-biblioteket. Vi fandt ud af, at hydroxylgrupperne i begge ender af CAG og ALA77 og GLY198 stederne i CTSB var bundet af en hydrogenbinding, mens TYR75, PR076 og ALA173 stederne i CAG og CTSB var bundet af van der Waals kraft (figur 4E) . For at verificere bindingsstedet mellem CAG og CTSB transficerede vi mutantplasmidet af CTSB i HCT-116-celler. Resultaterne viser, at affiniteten mellem mutantplasmidet ved A77V og G198A og CAG var hundredvis af gange højere end affiniteten for WT-plasmidet (figur 4F, G). I det næste afsnit udforsker vi den specifikke mekanisme, hvorved CAG spiller en antitumorrolle gennem CTSB.

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】