Systematisk identifikation og sammenligning af de udtrykte profiler af exosomale MiRNA'er hos grise inficeret med NADC30-som PRRSV-stamme

Enkel oversigt:Exosomer spiller en unik rolle i virusinfektion, antigenpræsentation og undertrykkelse/fremme af kroppens immunitet. Porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus (PRRSV) er et af de mest skadelige patogener i svineindustrien. Her brugte vi PRRSV NADC30-lignende CHsx1401-stammen til kunstigt at inficere 42-daggamle grise, isolere serumeksosomer og identificere 33 signifikant differentielt udtrykte (DE) exosomale miRNA'er mellem infektions- og kontrolgrupper og 18 DE miRNA'er forbundet med PRRSV-infektion og immunitet blev screenet som potentielle funktionelle molekyler involveret i reguleringen af ​​PRRSV-virusinfektion af exosomer.

Abstrakt:Exosomer er biologiske vesikler, der udskilles og frigives af celler, der fungerer som mediatorer af intercellulær kommunikation og spiller en unik rolle i virusinfektion, antigenpræsentation og undertrykkelse/fremme af kropsimmunitet. Porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus (PRRSV) er et af de mest skadelige patogener i svineindustrien og kan forårsage reproduktionsforstyrrelser hos søer, luftvejssygdomme hos grise, nedsat vækstpræstation og andre sygdomme, der fører til svinedødelighed. I denne undersøgelse brugte vi PRRSV NADC30-lignende CHsx1401-stammen til kunstigt at inficere 42-daggamle grise og isolere serumeksosomer. Baseret på high-throughput sekventeringsteknologi blev 305 miRNA'er identificeret i serum exosomer før og efter infektion, blandt hvilke 33 miRNA'er blev signifikant differentielt udtrykt mellem grupper (13 relativt opregulerede og 20 relativt nedregulerede). Sekvenskonserveringsanalyse af CHsx1401-genomet identificerede 8 konserverede regioner, hvoraf i alt 16 differentielt udtrykte (DE) miRNA'er blev forudsagt at binde til den konserverede region tættest på de 30 UTR af CHsx1401-genomet, inklusive 5 DE miRNA'er, der er i stand til at binde til CHsx'et1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). Yderligere analyse afslørede, at målgenerne for differentielt udtrykte miRNA'er var bredt involveret i exosomal funktionsrelaterede og medfødte immunitetsrelaterede signalveje og 18 DE miRNA'er (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 osv.) i forbindelse med PRRSV-infektion og immunitet blev screenet som potentielle funktionelle molekyler involveret i reguleringen af ​​PRRSV-virusinfektion af exosomer.

cistanche planteforøgende immunsystem

Nøgleord:PRRSV; serum exosom; miRNA'er

1. Introduktion

Porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus (PRRSV) er et enkeltstrenget positivstrenget RNA-virus med en kappestruktur, der tilhører ordenen Nidovirales, familien Arteriviridae, slægten Betaarterivirus [1,2]. Det er sfærisk eller ellipseformet med en diameter på 50-65 nm under et frysende elektronmikroskop [3,4]. PRRSV-genomet er omkring 15 kb i længden med en 50 cap og en 30 polyA-hale og indeholder mindst 10 åbne læserammer (ORF'er) flankeret af utranslaterede regioner (UTR'er) ved både 50 og 30 termini [5,6] og er pakket ind af nukleocapsidprotein med lipid-dobbeltlagscoating for at danne viruspartikler. Exosomer tilhører vesikler med monolagsmembranstrukturer og har samme topologiske struktur som celler [7]. Formen er "kopformet" eller "skiveformet" under et elektronmikroskop [8,9]. Exosomer kan eksistere i kredsløbssystemet i lang tid, og stoffer i exosomer kan absorberes af tilstødende celler eller fjerne receptorceller og derefter regulere receptorcellerne til at deltage i udvekslingen af ​​genetiske materialer mellem celler [10,11]. De er hovedsageligt sammensat af membranoverfladesubstanser og båret indhold, herunder celleoverfladereceptorer, membranproteiner, opløselige proteiner, lipider, RNA (mRNA, miRNA, lncRNA og viralt RNA osv.), genomisk DNA, mitokondrie-DNA [12-14 ]. MikroRNA'er (miRNA'er) er en klasse af 18-25 nukleotider (nt) evolutionært konserverede endogene ikke-kodende enkeltstrengede små RNA'er, som hæmmer translationsprocessen ved at inducere nedbrydningen af ​​mål-mRNA eller ved at binde til 30 UTR mål-mRNA, hvilket fører til til post-transkriptionel gendæmpning, hvorefter genekspressionen reguleres på post-transkriptionelt niveau [15-17]. Det anslås, at miRNA'er regulerer mere end 60% af pattedyrsgener post-transkriptionelt [18,19]. MiRNA'er spiller en vigtig rolle i intercellulær kommunikation og kan også bruges som et potentielt funktionelt molekyle til sygdom og virusinfektion, transmission og forsvar [20]. Et stigende antal undersøgelser har vist, at miRNA'er kan være til stede i kropsvæsker, såsom spyt, urin, modermælk og blod, og virke gennem kroppens væskekredsløb [21,22]. Eksosomale miRNA'er anses for at være endogene regulatorer af genekspression og metabolisme og kan indikere forskellige patologiske tilstande [23,24].

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

I løbet af de sidste to årtier er det blevet vist, at miRNA'er har afgørende roller i reguleringen af ​​immuncelleudvikling, medfødte immunresponser og erhvervede immunresponser. Nogle andre miRNA'er rapporteres at hæmme PRRSV-infektion på følgende måder, direkte målrette PRRSV-genomet eller PRRSV-receptoren eller spille en rolle ved at regulere værtens medfødte immunrespons. miR-26-familien kan beskadige virusreplikation betydeligt, og miR-26a kan hæmme replikationen af ​​type 1- og type 2-PRRSV-stammer i alveolære makrofager fra svin (PAM'er) ved at regulere type I-interferonet (IFN) pathway, som er mere effektiv end miR-26b [25,26]. miR-30c og miR-125b er identificeret til at modulere værtens medfødte immunrespons ved at målrette henholdsvis type I IFN-vejen og NF-KB-vejen [27-29]. MiR-23, miR-378 og miR-505 er antivirale værtsfaktorer rettet mod PRRSV og har konservative målsteder i type 2 PRRSV-stammer [30]. På samme tid er vært miR-506 blevet identificeret til at hæmme PRRSV-replikation ved direkte at målrette PRRSV-receptor CD151 i MARC-145-celler [31]. miR-181 kan også indirekte hæmme PRRSV-replikation ved at nedregulere PRRSV-receptor CD163 i blodmonocytter og PAM'er [32]. Derudover kan miRNA'er fremme PRRSV-replikation ved at interferere med grundlæggende cellefysiologi. MiR-24-3p og miR-22 er direkte målrettet mod 30 UTR af HO-1 under PRRSV-infektion for at undslippe hæmningen af ​​hæmoxygenase-1 (HO-1), en varmechokprotein (også kendt som HSP32) på PRRSV [33,34]. Grise er kendt for at være mere modtagelige for PRRSV og mindre i stand til at forsvare sig mod indtrængen af ​​dette patogen i organismen [35]. I den foreliggende undersøgelse blev den medfødte immunitet og erhvervede immunitet hos grise inficeret med denne virus undersøgt på molekylært niveau under anvendelse af en stamme, der er fremherskende i marken. Et serum exosom isolation kit, transmission elektronmikroskopi (TEM), nanopartikel sporingsanalyse (NTA) og Western blot (WB) blev brugt til at isolere og identificere serum exosomer før og efter infektion med PRRSV, efterfulgt af lille RNA sekventeringsanalyse, identifikation, og analyse af differentielle ekspressionsresultater ved hjælp af bioinformatiske metoder for at opnå flere PRRSV-associerede serum exosom miRNA'er, efterfulgt af identifikation af dataresultater ved hjælp af kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR).

2. Materialer og metoder

2.1. Dyreforsøg

Seks PRRSV-antigen og antistof dobbelt-negative sunde 42-daggamle store hvide grise blev anbragt i svinens rene fodersystem til isolering, sundhedspleje og miljøtilpasning. Alle grise var frie til at spise og drikke uden begrænsninger. Da de var bekendt med forholdene i isolatoren, blev grisene inokuleret nasalt med 2 mL 105 TCID50/mL PRRSV NADC 30-som CHsx1401, som blev nævnt af forgængere [36,37]. Blodet fra grisene før (kontrolgruppe, n=6) og 7 dage efter (behandlingsgruppe, n=6) viruspodning blev opsamlet fra den forreste vena cava til serumisolering. Det cellulære affald i serumet blev fjernet ved centrifugering ved 3000 g i 15 min. Alle dyreforsøg i vores undersøgelse blev godkendt af Animal Ethics Committee under Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS) (Beijing, Kina), IAS2022-130.

2.2. Isolering og oprensning af serumeksosomer

Eksosomisolering og oprensning blev udført ved anvendelse af exoEasy Maxi-kittet (QIAGEN, Hilden, Tyskland, kat.nr. 76064) i henhold til producentens protokol.

2.3. Transmissionselektronmikroskopi (TEM)

Ekstraherede exosomsuspensioner blev plettet på det formvar-carbocoatede kobbernet, og exosomerne blev skyllet med PBS og udsat for standard uranylacetat-farvning i 3 minutter ved stuetemperatur. Efter tørring i flere minutter ved stuetemperatur blev gitteret visualiseret og fotograferet ved 100 kV ved transmissionselektronmikroskop (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tokyo, Japan).

2.4. Nanopartikelsporingsanalyse (NTA)

Ekstraherede exosomer blev fortyndet med 1 x PBS ved at ændre volumenet fra 10 til 30 µL. Efter at prøven var testet, blev koncentrationen og størrelsen af ​​serum exosomer analyseret med en N30E flow nano-analysator efter producentens instruktioner (NanoFCM, Xiamen, Kina).

2.5. Western Blot

De ekstraherede exosomprøver blev tilsat til RIPA-lysat blandet med proteaseinhibitor (Invitrogen, Waltham, MA, USA) og phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) for at ekstrahere exosomproteinet, som blev lyseret på is i 30 min. Derefter kvantificerede vi i henhold til instruktionerne fra Bradford-sættet koncentrationen af ​​serum exosomprotein. Exosomproteiner gennemgik termisk denaturering. Den samme mængde protein blev separeret på 12% SDS-PAGE gel og derefter overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Millipore, Burlington, MA, USA). Det blev gennemblødt i TBST indeholdende 5 % skummetmælkspulver og forseglet i 1 time ved stuetemperatur. Vi gennemblødte membranen i det fortyndede primære antistof (anti-CD9-antistof, Abcam, Boston, MA, USA, #ab92726; anti-CD81-antistof, Abcam, Boston, MA, USA, #ab109201) natten over ved 4 ◦C og restituerede det primære antistof. Vi gennemblødte membranen i det fortyndede sekundære antistof, inkuberede det ved stuetemperatur i 1 time og genvandt det sekundære antistof. Vi lagde den vaskede film af PBST på den friskholdende film, tilsatte lige volumen blandet ECL a/b kromogene opløsning og anbragte den i kemiluminescens-imageren.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. Eksosomal lille RNA-sekventering og dataanalyser

Total RNA fra exosomerne blev ekstraheret med Trizol ifølge producentens instruktioner. Vi detekterede derefter RNA-koncentrationen og optisk densitet (OD) værdi og detekterede nedbrydningen og renheden af ​​RNA med 1% agarosegelelektroforese. I mellemtiden blev Agilent Bioanalyzer 2100 brugt til at påvise integriteten af ​​RNA. Vi brugte det totale RNA af exosomer efter kvalitetsinspektion. I henhold til producentens instruktioner brugte vi NEB NEXT multiplex lille RNA-biblioteksforberedelsessæt til Illumina® (Illumina, San Diego, CA, USA). Sættet forberedte et lille RNA-cDNA-bibliotek og sekventerede det til at producere 50 nt single-end reads af Illumina Novaseq 6000 platformen. Alle procedurerne til fremstilling af et lille RNA-bibliotek blev udført af Novogene (Beijing, Kina). Dataene efter kvalitetskontrol blev justeret til det porcine referencegenom (Sus scrofa 11.1) ved brug af sløjfe. Kendte miRNA'er blev identificeret af miRbase (v22.0) databasen [38] (https://www.mirbase.org, tilgået den 14. januar 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39] og miRevo (v1.1) ) [40] og blev brugt til at forudsige nye miRNA'er. Samtidig blev den differentielle ekspressionsanalyse for miRNA'er udført af DESeq (v1.24.0) [41], hvilket kræver |fold ændring| > 1,6 og p < 0,05. Justering blev udført ved hjælp af MEGA (V11) [42] efterfulgt af enkelt basescoring ved hjælp af PHAST (v1.6.9) [43] og evaluering af de mest konserverede regioner af 10 virusgener, inklusive WUH3 (GenBank accessionsnr. HM853973), VR2332 ( GenBank accessionsnr. U87392), JXA1 (GenBank accessionsnr. EF112445), CH-1a (GenBank accessionsnr. AY032626), NADC30 (GenBank accessionsnr. HN654459), HUN4 (GenBank accessionsnr. EF63500D6), HLJZ0D6 22-1812 (GenBank-adgangsnr. MN648450), SC/DJY (GenBank-adgangsnr. MT075480) og Lelystad (GenBank-adgangsnr. M96262.2). RNAhybrid (V2.0) [44] blev brugt til at forudsige bindingen af ​​den identificerede miRNA-sekvens til 3 0 UTR af CHsx1401-virusgenomet. Miranda (v3.3a) og RNAhybrid blev brugt til at målrette genforudsigelse. Klyngeprofilen [45] R-pakken blev brugt til GO (Gene Ontology) funktionel berigelsesanalyse af målgener og KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway-berigelsesanalyse.

2.7. Validering af miRNA-ekspression ved RT-qPCR

Totalt RNA blev isoleret fra serum exosomer under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Shanghai, Kina) ifølge producentens protokol. Det isolerede RNA blev verificeret ved RT-qPCR på prøver (n=6 pr. gruppe). cDNA blev syntetiseret i henhold til instruktionerne fra miRNA 1. streng cDNA syntese (ved stam-loop) kit (Vazyme, Nanjing, Kina), og fluorescens kvantificering blev udført ved hjælp af ABI 7500 i henhold til instruktioner af miRNA universal SYBR qPCR master mix (Vazyme, Nanjing, Kina). De anvendte termiske cyklusparametre var som følger: det første trin: 95 ◦C i 30 s; Trin 2: 95 ◦C i 5 s, 60 ◦C i 34 s og 40 cyklusser; Trin 3: 95 ◦C i 15 s, 60 ◦C i 1 min og 95 ◦C i 15 s. Primersekvenser af miRNA'er, U6-genet, blev brugt som reference [46] og opført i supplerende tabel S1. Alle qRT-PCR-verifikationer blev udført ved brug af tre biologiske replikater og med tre replikater for hver prøve. Den relative mængde af transskriptioner blev beregnet ved 2-Ct-metoden, og SPSS (v22.0) og GraphPad Prism (v8.0) blev brugt til henholdsvis dataanalyse og kortlægning. p < 0,05 betyder, at forskellen er statistisk signifikant.

3. Resultater

3.1. Relativ værdi af antigen og antistof efter viruspodning

Resultaterne af PRRSV-antigen- og antistoftest før (dag 0) og efter (dag 7) udfordringen er vist i tabel 1. Den serologiske påvisning af PRRSV-antigenet og antistoffet før udfordringen var negativ, og antigenet var positiv efter udfordringen, hvilket indikerer, at grisene var succesfuldt inficeret med CHsx1401.

3.2. Isolering og identifikation af serumeksosomer

Vesiklerne isoleret fra serum blev opdaget af TEM. De fleste vesikler kan se de konkave tallerken- eller skiveformede exosomer i midten. Membrankanten af ​​exosomer er synlig, og morfologien er relativt komplet (figur 1A, B). Nanopartikelsporingsanalysen viste, at 95,73% af exosomer havde en diameter på 30-150 nm, hovedsageligt omkring 72,25 nm, med en gennemsnitlig diameter på 76,22 nm, hvilket var i overensstemmelse med størrelseskarakteristika af exosomer (Figur 1C). Dette størrelsesområde svarede til det, der blev påvist af TEM og bekræftede yderligere identiteten af ​​disse vesikler som exosomer. Western blot-analyse viste, at vesiklerne isoleret fra serumprøverne var positive for CD9- og CD81-proteiner (figur 1D). Ovenstående karakteristika er i overensstemmelse med exosom-identifikationsstandarderne formuleret af International Society for Extrace Vesicles (ISEV) i MISEV2018 [47].

Tabel 1. Antigen og antistof fra (dag 0) og (dag 7) med udfordringsvirus.

Figur 1. Hovedkarakteristika for serum-eksosomer. (A, B) viser de morfologiske karakteristika af vesikler ved TEM. Skala søjler er henholdsvis 500 nm og 100 nm. (C) NTA viser diameteren og koncentrationen af ​​de fleste vesikler. (D) Western blot viste tilstedeværelsen af ​​exosom markører CD81 og CD9 i serum exosomer. Bemærk: Blanding i WB-resultater er prøveblandet suspension isoleret af exoEasy Maxi-sættet

3.3. Lille RNA-sekventering af serumeksosomer

For hver prøve nåede de rene data op på 0,5 Gb, og Q30-baseprocenten var over 96,20 %. De rene aflæsninger af hver prøve blev justeret med svinereferencegenomet. Blandt de 12 prøver opnåede kontrolgruppen henholdsvis 10.920.887, 10.248.696, 10.109.117, 10.655.494, 9.217.285 og 9.782.523 læsninger. Behandlingsgruppen opnåede henholdsvis 11.889.518, 10.593.504, 10.593.504, 12.846.080, 10.105.325, 11.729.451 og 9.789.542 læs. I gennemsnit omfattede 77,96% af de samlede rene aflæsninger 19-22 nukleotider (nt) i længden (figur 2A). Aflæsningerne efter kvalitetskontrol udgjorde mere end 92,59 % af de samlede aflæsninger. De behandlede rene aflæsninger blev justeret til det porcine referencegenom, og den kortlagte hastighed af 12 biblioteker på genomet var mere end 92,30%, og den kortlagte hastighed var 94,98% (figur 2B). Det indikerede, at det konstruerede serum exosomal miRNA-bibliotek var af høj kvalitet og egnet til yderligere analyse. Detaljer er angivet i den supplerende tabel S2.

Figur 2. Oversigt over de små RNA-transkriptomdata. (A) Længdefordeling af aflæste tællinger af serumeksosomprøver (nt=nukleotider); (B) hastighed af 12 prøver kortlagt til referencegenomet

3.4. Differentiel ekspressionsanalyse af miRNA'er

Efter kvantitativ analyse af den identificerede miRNA-ekspression blev miRNA'er screenet ved de tærskler, der er beskrevet tidligere i afsnit 2.6. I alt 305 miRNA'er blev opnået før og efter inokulering af CHsx1401-stammen (kontrol, n=6; behandling, n=6). I alt 33 differentielt udtrykte (DE) miRNA'er blev identificeret mellem de to grupper, 13 DE miRNA'er blev opreguleret, og 20 DE miRNA'er blev nedreguleret i behandlingsgruppen (figur 3 og supplerende tabel S3).

3.5. Funktionel berigelsesanalyse af miRNA-målgener

I alt 7283 målgener blev forudsagt af 33 DE miRNA'er, og funktionerne af målgener var hovedsageligt koncentreret i den positive regulering af MAPK-kaskaden, lipidmetabolismeprocessen, regulering af intracellulær signaltransduktion, ERK1- og ERK2-kaskaden osv. (Figur 4A ). Med hensyn til molekylære funktioner fokuserer de differentielt udtrykte miRNA-målgener hovedsageligt på GTP-enzym regulatorisk aktivitet, kinaseaktivitet, nukleosid triphosphatase regulatorisk aktivitet og andre funktioner relateret til signaltransduktion og energimetabolisme (Figur 4B). Derudover deltager målgenerne blandt cellekomponenterne hovedsageligt i de biologiske funktioner af supramolekylære polymerer, Golgi, autophagosomer, celleoverflade, tidlige endosomer osv. (Figur 4C). Funktionerne af disse komponenter er tæt forbundet med dannelsen af ​​exosomer, hvilket også forklarer nøjagtigheden af ​​sekventeringen. KEGG pathway berigelsesanalyse viste, at målgenerne var signifikant beriget i endocytose, MAPK-signalvejen, Rap1-signalvejen, sphingolipid-signalvejen og PI3K Akt-signalvejen (p < 0.05) (Figur 5A) ). Samtidig blev de berigede veje klassificeret og analyseret. Resultaterne viste, at KEGG-vejen for målgenet hovedsageligt var beriget i miljøinformationsbehandling, menneskelige sygdomme og biologiske systemer (figur 5B).

Figur 3. Differentiel ekspression af miRNA'er i exosomer. (A) Vulkanplot af miRNA'er mellem kontrol- og behandlingsgrupper; (B) hierarkisk clustering heatmap af DE miRNA'er mellem kontrol- og behandlingsgrupper.

Figur 4. GO-funktionberigelsesanalyse af DE miRNAs målgener. (A) Biologisk proces af DE miRNAs målgener; (B) molekylære funktioner af DE miRNAs målgener; (C) cellulære komponenter af DE miRNAs målgener

Figur 5. KEGG pathway berigelsesanalyse af målgener. (A) Signifikant beriget KEGG-vej med målgener fra DE miRNA'er; (B) klassificering af signifikant berigede KEGG-veje.

3.6. Målrettede forudsigelse af serum exosomal miRNA og PRRSV CHsx1401 genom

Ifølge phastCons-scoren for en enkelt base efter justering med PHAST blev i alt otte mest konserverede segmenter (sorte bånd over topkortet) opnået blandt de virale genomer (figur 6). I alt 31 DE miRNA'er blev fundet at binde til det konserverede segment ved at forudsige de miRNA'er, der var bundet til det konserverede segment. Blandt dem, i den konserverede region (14.644-15.020 nt) tættest på 30 UTR (14.870-15.020) af CHsx1401-genomet, forudsiges 16 DE miRNA'er at binde til det, inklusive 5 miRNA'er (ssc-miR}{{15} c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 og ssc-miR-6529), der kan binde til 30 UTR af CHsx1401. Blandt disse miRNA'er var kun ssc-miR-223 opreguleret efter infektion, og andre miRNA'er blev nedreguleret efter infektion. Se supplerende tabel S4 for detaljer.

Figur 6. Konserverede segmenter i genomet af CHsx1401-stammen forudsagt af PHAST

3.7. Screening af DE miRNA'er relateret til exosomfunktion og PRRSV

En række forskellige differentielt udtrykte miRNA'er relateret til funktionen af ​​exosomer og PRRSV blev fundet ved funktionel berigelsesanalyse af målgener. Blandt dem er 11 DE miRNA'er såsom ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 og ssc-miR-320 involveret i exosomoptagelse, og deres målgener er hovedsageligt koncentreret i Ras-genfamilien, annexinfamilien og ADP-ribosyleringsgenfamilien. Atten DE miRNA'er, inklusive sscmiR-10b, ssc-miR-124a og ssc-miR-128, deltager i immunrelaterede veje, og deres målgener er hovedsageligt koncentreret i MAPK'en genfamilie, PIK3-genfamilie og proteinphosphatase-genfamilie. Mens 11 DE miRNA'er er involveret i virusinvasion, er de relaterede målgener hovedsageligt koncentreret i MAPK-genfamilien og proteinphosphatase-genfamilien. Desuden multiple differentielt udtrykte miRNA'er, såsom nye_102. Seks DE miRNA'er, inklusive ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p,ssc-miR-7137-3p og ssc-miR{{ 25}}, er co-udtrykt i exosomfunktion, PRRSV-virusinvasion og immunrelaterede veje, som vist i figur 7. Detaljer er vist i supplerende tabel S5.

Figur 7. DE miRNA'er relateret til exosomoptagelse, PRRSV-invasion og immunitet

3.8. QRT-PCR-assay af DE miRNA'er mellem de to grupper

Fem DE miRNA'er blev tilfældigt udvalgt til verifikation. Ifølge qRT-PCR-resultaterne steg ekspressionen af ​​ssc-miR-19a og ssc-miR-32 i behandlingsgruppen, mens ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} og ssc-miR-34c viste højere udtryk i kontrolgruppen, i overensstemmelse med sekventeringsdataene (figur 8).

Figur 8. Fem DE miRNA'er valideret ved qRT-PCR

4. Diskussion

PRRSV er stadig et genstridigt patogen i den globale svineindustri, der forårsager enorme økonomiske tab i verden. På nuværende tidspunkt bruges vaccination hovedsageligt til at forebygge og kontrollere PRRSV, blandt hvilke den modificerede levende (MLV) virusvaccine er den mest udbredte [48]. Selvom denne vaccine var effektiv til at reducere PRRS-udbrud og forekomst, øgede den også i høj grad den genetiske variation og diversiteten af ​​virussen og førte til viral rekombination mellem vilde og levende vaccinevirus i marken [49,50]. I de senere år har spredningen og forekomsten af ​​den rekombinante virus NADC30-lignende PRRSV-stamme forårsaget flere udbrud af porcint reproduktivt og respiratorisk syndrom i Kina. Ligheden mellem CHsx1401 og NADC30 brugt i denne undersøgelse forblev på 92,2-99,1%. Siden da er det blevet en epidemisk stamme i Kina. Eksosomer, som mediatorer af cellekommunikation, findes i vid udstrækning i forskellige kropsvæsker og har unikke fordele ved sygdomsdiagnostik og -behandling [51,52]. Ifølge tidligere rapporter spiller exosomer en vigtig kommunikationsrolle i antigenpræsentation [53], immunrespons [53,54], virusreplikation [54], cancer [55], neurodegenerative sygdomme [56], angiogenese [57], tumorcelle migration [58] og invasion [59], og har høj forskningsværdi.

I denne undersøgelse blev high-throughput sekventeringsteknologi brugt til at konstruere miRNA-ekspressionsprofilen af ​​serum-exosomer, og 33 DE miRNA'er blev identificeret. Som vi alle ved, kan det værtskodede miRNA binde til det virale genom og derefter regulere replikationen, syntesen og frigivelsen af ​​virussen for at begrænse infektion og påvirke den patologiske proces [15]. Undersøgelser af miRNA'er rettet mod det virale genom er også blevet rapporteret gentagne gange hos dyr. gga-miR-454 og gga-miR-130b i smitsomme bursalsygdom hos kyllinger kan målrette virusgenomet for at hæmme viral replikation, mens gga-miR-21 direkte er rettet mod det virale protein VP1 for at inhibere viral proteintranslation [60,61]. I PRRSV-undersøgelser binder ssc-miR-181 sig specifikt til en meget konserveret region nedstrøms for det virale genom ORF4 og hæmmer kraftigt PRRSV-replikation [62]. I denne undersøgelse nåede ekspressionsforskellen af ​​ssc-miR-181 mellem de to grupper ikke et signifikant niveau. I vores undersøgelse blev genomerne af ni forskellige PRRSV-vira sammenlignet med CHsx1401-stammen, og de otte mest konserverede segmenter blev identificeret. Det blev forudsagt, at 31 DE miRNA'er kunne binde til de 8 mest konserverede segmenter af CHsx1401, og 16 DE miRNA'er kunne binde til de konserverede sekvenser tæt på 30 UTR af CHsx1401. Blandt dem 5 DE miRNA'er (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 og ssc-miR{{ 36}}) kan samtidigt binde til CHsx1401 30 UTR. Derudover blev den opregulerede ekspression af ssc-miR-223 forudsagt at binde til 30 UTR-målet af PRRSV-genomet. Resultaterne viste, at de konserverede sekvenser af virusgenomet kan spille en nøglerolle i dets patogenicitet, og de miRNA'er, der kan binde til de konserverede sekvenser mellem genomerne af forskellige PRRSV-stammer, kan have vigtig betydning for at kontrollere virusets patogenicitet. Nogle differentielt udtrykte miRNA'er har vist sig at være relateret til PRRSV af tidligere undersøgelser og endda direkte involveret i reguleringen af ​​PRRSV, herunder ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], lad-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] og ssc-miR{{57 }}a [67].

PRRSV kan undgå værtsforsvar ved at forstyrre medfødt immunrespons. Denne proces er reguleret af mange signalveje, herunder MAPK-signalvejen, PI3K Akt-signalvejen, autofagi, kemokin og TNF-signalvejen. På nuværende tidspunkt omfatter MAPK-signalvejen tre hovedveje: ERK1/2, JNK og p38-vejen. Aktivering af MAPK-kaskaden kan fremme værtscelleapoptose, hjælpe virussen med at undslippe værtens immunforsvarsrespons og fremme PRRSV-replikation [68]. Desuden kan aktiveringen af ​​c-Jun N-terminale kinaser (JNK'er) og p38 også fremme frigivelsen af ​​den inflammatoriske faktor IL -10 [68-70] og øge den inflammatoriske effekt. Ud over at inducere apoptose kan PRRSV også inducere autofagi, som kan fremme PRRSV-replikation. Aktiveringen af ​​PI3K/Akt er nødvendig for virusindtrængning og fremme af virusreplikation, og PRRSV-aktiveret Akt hæmmer værtscelleapoptose ved negativt at regulere JNK-vejen [71]. TNF Det kan spille en vigtig rolle i induktion og regulering af inflammatorisk respons sammen med andre inflammatoriske faktorer, men TNF-ekspression er påvirket af den negative regulering af PRRSV-replikation [72]. I denne undersøgelse er miRNA'er (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p osv.), der er beriget i disse veje, er involveret i PRRSV-induceret apoptose, autofagi og inflammation og er tæt forbundet med viral immunrespons, immununddragelse og replikation.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Celleplasmamembranen er rig på en række forskellige lipidflåder, og sphingolipid- og kolesterolrige sphingolipider (sphingomyelin og glycosphingolipider) er nøglemolekyler i lipidflåder. Genkendelsen af ​​lipider af nogle proteiner af virussen kan være en nødvendig betingelse for virusets indtræden [73]. Envelope-virus indsætter virale kappe-glycoproteiner i lipid-flåder på det stadie, hvor virus trænger ind, interagerer med receptorer, der er placeret i lipid-flotter, eller skifter fra deres naturlige tilstand til aktiveret form for at initiere eller fremme viral internalisering/fusion, såsom HSV, SARS coronavirus og pattegriseepidemi diarrévirus [73,74]. Tidligere undersøgelser viste, at fjernelse af kolesterol fra overfladen af ​​MARC-145-celler reducerede PRRSV-infektion signifikant, hvilket viser, at inhibering af PRRSV-infektion specifikt blev medieret af fjernelse af cellulært kolesterol. Depletering af cellemembrankolesterol hæmmede signifikant virusindtrængen, især virusvedhæftning og frigivelse [75]. Sphingolipidmetabolisme kan regulere membranstruktur og adhæsion, hvilket er af stor betydning ved PRRSV-virusinvasion. Endocytose var den mest signifikante berigelse i denne undersøgelse. Endocytose er en vigtig mekanisme for exosomoptagelse af målceller. Tidligere undersøgelser har vist, at exosomoptagelse er en energikrævende og cytoskeletafhængig proces, som fremhæver endocytoses potentielle rolle i denne proces [76]. Det er blevet bevist, at flere veje kan mediere denne proces, herunder fagocytose, makropinocytose, clathrin, etc. [77,78], hvilket førte til forskellige klassificeringer og roller af endocytoserede stoffer. Berigelsen af ​​differentielt udtrykte exosomale miRNA'er i denne vej indikerer, at exosomer spiller en vigtig rolle i PRRSV-infektion, og reguleringen af ​​indholdstransport og optagelse i exosomer kan føre til patofysiologiske ændringer i målceller og -organer.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

5. Konklusioner

Gennem identifikation og bioinformatikanalyse af serum exosomal miRNA'er fra PRRSV-inficerede grise, blev en række PRRSV-relaterede veje og differentielt udtrykte miRNA'er opnået i denne undersøgelse, såsom ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 osv., som spiller potentielle funktionelle roller i PRRSV -induceret immunrespons, invasion og exosomoptagelse. Derudover, fordi et enkelt miRNA kan målrette mod flere gener, og et enkelt gen også reguleres af flere miRNA'er, udfører flere miRNA'er flere funktioner i ovennævnte veje. Nogle miRNA'er er blevet verificeret til at regulere PRRSV-infektion ved at virke på nøglereceptorer eller direkte målrette virusgenomet, såsom ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, lad-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a osv. I mellemtiden forudsagde denne undersøgelse også en række miRNA'er, der kan binde til det mest konserverede fragment af de 30 UTR af CHX1401-virusgenomet, inklusive ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } og ssc-miR-6529, hvilket kan være vigtigt for regulering af viral patogenicitet.

Referencer

1. Snijder, EJ; Kikkert, M.; Fang, Y. Arterivirus molekylærbiologi og patogenese. J. Gen. Virol. 2013, 94 Pt 10, 2141-2163. [CrossRef] [PubMed]

2. Lu, Y.; Zhang, Y.; Xiang, X.; Sharma, M.; Liu, K.; Wei, J.; Shao, D.; Li, B.; Tong, G.; Olszewski, MA; et al. Notch-signalering bidrager til ekspressionen af ​​inflammatoriske cytokiner induceret af højpatogen porcin reproduktions- og respiratorisk syndromvirus (HP-PRRSV) infektion i alveolære makrofager hos svin. Dev. Comp. Immunol. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. Dea, S.; Sawyer, N.; Alain, R.; Athanassius, R. Ultrastrukturelle karakteristika og morfogenese af porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus, der formeres i den meget permissive MARC-145-celleklon. Adv. Exp. Med. Biol. 1995, 380, 95-98. [PubMed]

4. Dokland, T. Den strukturelle biologi af PRRSV. Virus Res. 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]

5. Johnson, CR; Griggs, TF; Gnanandarajah, J.; Murtaugh, MP Nyt strukturelt protein i porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus kodet af en alternativ ORF5 til stede i alle arterivira. J. Gen. Virol. 2011, 92 Pt 5, 1107-1116. [CrossRef] [PubMed]

6. Lee, SC; Lee, S.; Yoo, GW; Choi, HW; Nej, YH; Park, CE; Shin, JH; Yoon, IJ; Kang, SY; Lee, C. Fænotypiske og genotypiske analyser af en svækket porcin reproduktions- og respiratorisk syndrom-virusstamme efter serielle passager i dyrkede alveolære makrofager fra svin. J. Vet. Sci. 2018, 19, 358-367. [CrossRef] [PubMed]

7. Zebrowska, A.; Skowronek, A.; Wojakowska, A.; Widlak, P.; Pietrowska, M. Metabolom af exosomer: Fokus på vesikler frigivet af kræftceller og til stede i menneskelige kropsvæsker. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3461. [CrossRef]

8. Bebelman, MP; Smit, MJ; Pegtel, DM; Baglio, SR Biogenese og funktion af ekstracellulære vesikler i cancer. Pharmacol. Ther. 2018, 188, 1-11. [CrossRef]

9. Zaborowski, MP; Balaj, L.; Breakefield, XO; Lai, CP Ekstracellulære vesikler: Sammensætning, biologisk relevans og undersøgelsesmetoder. Bioscience 2015, 65, 783-797. [CrossRef]

10. Almughlliq, FB; Koh, YQ; Peiris, HN; Vaswani, K.; Holland, O.; Meier, S.; Roche, JR; Burke, CR; Crookenden, MA; Arachchige, BJ; et al. Cirkulerende exosomer kan identificere biomarkører for køer med risiko for metabolisk dysfunktion. Sci. Rep. 2019, 9, 13879. [CrossRef]

11. Zhang, RC; Du, WQ; Zhang, JY; Yu, SX; Lu, FZ; Ding, HM; Cheng, YB; Ren, C.; Geng, DQ Mesenkymal stamcellebehandling for perifer nerveskade: En narrativ gennemgang. Neural Regen. Res. 2021, 16, 2170-2176. [PubMed]

12. Bryzgunova, OE; Zaripov, MM; Skvortsova, TE; Lekchnov, EA; Grigor'eva, AE; Zaporozhchenko, IA; Morozkin, ES; Ryabchikova, EI; Yurchenko, YB; Voitsitskiy, VE; et al. Sammenlignende undersøgelse af ekstracellulære vesikler fra urinen hos raske personer og prostatacancerpatienter. PLoS ONE 2016, 11, e0157566. [CrossRef] [PubMed]

13. Camussi, G.; Deregibus, MC; Bruno, S.; Grange, C.; Fonsato, V.; Tetta, C. Exosom/mikrovesikel-medieret epigenetisk omprogrammering af celler. Er. J. Cancer Res. 2011, 1, 98-110. [PubMed]

14. Tamkovich, SN; Tutanov, OS; Laktionov, PP Exosomes: Generation, struktur, transport, biologisk aktivitet og diagnostisk anvendelse. Biochem. Mosc. Suppl. Ser. Et medlem. Cell Biol. 2016, 10, 163-173. [CrossRef]

15. Bartel, DP MikroRNA'er: Genomik, biogenese, mekanisme og funktion. Cell 2004, 116, 281-297. [CrossRef]

16. Gordino, G.; Costa-Pereira, S.; Corredeira, P.; Alves, P.; Costa, L.; Gomes, AQ; Silva-Santos, B.; Ribot, JC MicroRNA-181a begrænser human δ T-celledifferentiering ved at målrette Map3k2 og Notch2. EMBO Rep. 2022, 23, e52234. [CrossRef]

17. Liu, B.; Yan, L.; Chi, Y.; Sun, Y.; Yang, X. Langt ikke-kodende RNA AFAP1-AS1 letter ovariecancerprogression ved at regulere miR-107/PDK4-aksen. J. Ovarian Res. 2021, 14, 60. [CrossRef]

18. Kim, Y.; Lee, DH; Park, SH; Jeon, TI; Jung, CH Samspillet mellem mikroRNA'er og transkriptionsfaktorer i autofagiregulering ved ikke-alkoholisk fedtleversygdom. Exp. Mol. Med. 2021, 53, 548-559. [CrossRef]

19. Kazmierczak, D.; Jopek, K.; Sterzynska, K.; Nowicki, M.; Rucinski, M.; Januchowski, R. Profilen af ​​mikroRNA-ekspression og potentiel rolle i reguleringen af ​​lægemiddelresistente gener i cisplatin- og paclitaxel-resistente ovariecancercellelinjer. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 526. [CrossRef]

20. Gong, Y.; Wei, X.; Sun, W.; Ren, X.; Chen, J.; Aweya, JJ; Ma, H.; Chan, KG; Zhang, Y.; Li, S. Exosomal miR-224 bidrager til hemolymfemikrobiota-homeostase under bakteriel infektion i krebsdyr. PLoS Pathog. 2021, 17, e1009837. [CrossRef]

21. Cheng, Y.; Kou, W.; Zhu, D.; Yu, X.; Zhu, Y. Fremtidige retninger i diagnose, prognose og sygdomsovervågning af binyrebarkcarcinom: Nye ikke-invasive biomarkører. Foran. Endokrinol. 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. Gallo, A.; Tandon, M.; Alevizos, I.; Illei, GG Størstedelen af ​​mikroRNA'er, der kan påvises i serum og spyt, er koncentreret i exosomer. PLoS ONE 2012, 7, e30679. [CrossRef] [PubMed]

23. Fan, B.; Chopp, M.; Zhang, ZG; Liu, XS Nye roller af mikroRNA'er som biomarkører og terapeutiske mål for diabetisk neuropati. Foran. Neurol. 2020, 11, 558758. [CrossRef] [PubMed]

24. Wei, H.; Chen, Q.; Lin, L.; Sha, C.; Li, T.; Liu, Y.; Yin, X.; Xu, Y.; Chen, L.; Gao, W.; et al. Regulering af exosomproduktion og lastsortering. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 163-177. [CrossRef]

25. Jia, X.; Bi, Y.; Li, J.; Xie, Q.; Yang, H.; Liu, W. Cellulært mikroRNA miR-26a undertrykker replikation af porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus ved at aktivere medfødt antiviral immunitet. Sci. Rep. 2015, 5, 10651. [CrossRef]

26. Li, L.; Wei, Z.; Zhou, Y.; Jiang, Y.; Yu, L.; Zheng, H.; Tong, W.; Yang, S.; Zheng, H.; Shan, T.; et al. Host miR-26a undertrykker replikation af porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus ved at opregulere type I-interferoner. Virus Res. 2015, 195, 86–94. [CrossRef]

27. Liu, F.; Wang, H.; Du, L.; Wei, Z.; Zhang, Q.; Feng, WH MicroRNA-30c målretter mod interferon-alfa/beta-receptorens beta-kæde for at fremme type 2 PRRSV-infektion. J. Gen. Virol. 2018, 99, 1671-1680. [CrossRef]

28. Zhang, Q.; Huang, C.; Yang, Q.; Gao, L.; Liu, HC; Tang, J.; Feng, WH MicroRNA-30c modulerer type I IFN-responser for at lette porcin reproduktiv og respiratorisk syndrom-virusinfektion ved at målrette mod JAK1. J. Immunol. 2016, 196, 2272-2282. [CrossRef]

29. Wang, D.; Cao, L.; Xu, Z.; Fang, L.; Zhong, Y.; Chen, Q.; Luo, R.; Chen, H.; Li, K.; Xiao, S. MiR-125b reducerer porcin reproduktions- og respiratorisk syndrom-virusreplikation ved negativt at regulere NF-KB-vejen. PLoS ONE 2013, 8, e55838. [CrossRef]

30. Zhang, Q.; Guo, XK; Gao, L.; Huang, C.; Li, N.; Jia, X.; Liu, W.; Feng, WH MicroRNA-23 hæmmer PRRSV-replikation ved direkte at målrette PRRSV-RNA og muligvis ved at opregulere type I-interferoner. Virology 2014, 450-451, 182-195. [CrossRef]

31. Wu, J.; Peng, X.; Zhou, A.; Qiao, M.; Wu, H.; Xiao, H.; Liu, G.; Zheng, X.; Zhang, S.; Mei, S. MiR-506 hæmmer PRRSV-replikation i MARC-145-celler via CD151. Mol. Celle. Biochem. 2014, 394, 275-281. [CrossRef]

32. Gao, L.; Guo, XK; Wang, L.; Zhang, Q.; Li, N.; Chen, XX; Wang, Y.; Feng, WH MicroRNA 181 undertrykker porcin reproduktiv og respiratorisk syndromvirus (PRRSV) infektion ved at målrette PRRSV-receptor CD163. J. Virol. 2013, 87, 8808-8812. [CrossRef]

33. Xiao, S.; Du, T.; Wang, X.; NIH.; Yan, Y.; Li, N.; Zhang, C.; Zhang, A.; Gao, J.; Liu, H.; et al. MiR-22 fremmer replikation af porcin reproduktiv og respiratorisk syndromvirus ved at målrette mod værtsfaktoren HO-1. Dyrlæge. Microbiol. 2016, 192, 226-230. [CrossRef]

34. Xiao, S.; Wang, X.; NIH.; Li, N.; Zhang, A.; Liu, H.; Pu, F.; Xu, L.; Gao, J.; Zhao, Q.; et al. MicroRNA miR-24-3p fremmer replikation af porcin reproduktiv og respiratorisk syndromvirus gennem undertrykkelse af hæmoxygenase-1-ekspression. J. Virol. 2015, 89, 4494-4503. [CrossRef]

35. Butler, JE; Sinkora, M.; Wang, G.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. Perturbation af thymocytudvikling ligger til grund for PRRS-pandemien: En testbar hypotese. Foran. Immunol. 2019, 10, 1077. [CrossRef]

36. Zhou, L.; Wang, Z.; Ding, Y.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. NADC30-lignende stamme af porcin reproduktiv og respiratorisk syndromvirus, Kina. Emerg. Inficere. Dis. 2015, 21, 2256-2257. [CrossRef]

37. Zhou, L.; Yang, B.; Xu, L.; Jin, H.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Effektevaluering af tre modificerede levende virusvacciner mod en stamme af porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus NADC30-lignende. Dyrlæge. Microbiol. 2017, 207, 108-116. [CrossRef]

38. Wong, N.; Wang, X. miRDB: En online ressource til forudsigelse af mikroRNA-mål og funktionelle annoteringer. Nucleic Acids Res. 2015, 43, D146–D152. [CrossRef]

39. Friedländer, MR; Mackowiak, SD; Li, N.; Chen, W.; Rajewsky, N. miRDeep2 identificerer nøjagtigt kendte og hundredvis af nye mikroRNA-gener i syv dyreklader. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 37-52. [CrossRef]

40. Wen, M.; Shen, Y.; Shi, S.; Tang, T. miREvo: En integrerende mikroRNA evolutionær analyseplatform til næste generations sekventeringseksperimenter. BMC Bioinform. 2012, 13, 140. [CrossRef]

41. Anders, S.; Huber, W. Differentiel ekspressionsanalyse for sekvenstællingsdata. Genom Biol. 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]

42. Tamura, K.; Stecher, G.; Kumar, S. MEGA11: Molekylær evolutionær genetik analyse version 11. Mol. Biol. Evol. 2021, 38, 3022-3027. [CrossRef] [PubMed]

43. Hubisz, MJ; Pollard, KS; Siepel, A. PHAST og RPHAST: Fylogenetisk analyse med rum/tid-modeller. Kort. Bioinform. 2011, 12, 41-51. [CrossRef] [PubMed]

44. Krüger, J.; Rehmsmeier, M. RNAhybrid: mikroRNA-målforudsigelse let, hurtig og fleksibel. Nucleic Acids Res. 2006, 34, W451–W454. [CrossRef]

45. Yu, G.; Wang, LG; Han, Y.; He, QY clusterProfiler: En R-pakke til sammenligning af biologiske temaer blandt genklynger. OMICS 2012, 16, 284-287. [CrossRef]

46. ​​Que, R.; Ding, G.; Chen, J.; Cao, L. Analyse af serum exosomal mikroRNA'er og klinikopatologiske træk hos patienter med pancreas adenocarcinom. World J. Surg. Oncol. 2013, 11, 219. [CrossRef]

47. Théry, C.; Witwer, KW; Aikawa, E.; Alcaraz, MJ; Anderson, JD; Andriantsitohaina, R.; Antoniou, A.; Arab, T.; Archer, F.; Atkin-Smith, GK; et al. Minimal information til undersøgelser af ekstracellulære vesikler 2018 (MISEV2018): En holdningserklæring fra International Society for Extracellular Vesicles og en opdatering af MISEV2014-retningslinjerne. J. Extracell. Vesikler 2018, 7, 1535750. [CrossRef]

48. Lyoo, K.-S.; Choi, JY; Hahn, TW; Park, KT; Kim, HK Effekt af vaccination med en modificeret levende porcin reproduktions- og respiratorisk syndromvirusvaccine på vækstpræstation hos slagtesvin under markforhold. J. Vet. Med. Sci. 2016, 78, 1533-1536. [CrossRef]

49. Bian, T.; Sun, Y.; Hao, M.; Zhou, L.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. En rekombinant type 2 porcin reproduktiv og respiratorisk syndromvirus mellem NADC30-lignende og en MLV-lignende: Genetisk karakterisering og patogenicitet for smågrise. Inficere. Genet. Evol. 2017, 54, 279-286. [CrossRef]

50. Li, Y.; Ji, G.; Wang, J.; Tan, F.; Zhuang, J.; Li, X.; Tian, ​​K. Komplet genomsekvens af en NADC30-Som porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus karakteriseret ved rekombination med andre stammer. Genome annoncering. 2016, 4, e00330-16. [CrossRef]

51. Kalluri, R.; Lebleu, VS Exosomers biologi, funktion og biomedicinske anvendelser. Science 2020, 367, eaau6977. [CrossRef] [PubMed]

52. Miao, XY Nylige fremskridt i forståelsen af ​​miRNAs rolle i exosomer og deres terapeutiske potentiale. J. Integr. Agric. 2017, 16, 753-761. [CrossRef]

53. Shenoda, BB; Ajit, SK Modulering af immunresponser af exosomer afledt af antigen-præsenterende celler. Clin. Med. Indsigt Pathol. 2016, 9 (Suppl. S1), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]

54. Li, S.; Li, S.; Wu, S.; Chen, L. Exosomes modulerer den virale replikation og værtsimmunresponser ved HBV-infektion. BioMed Res. Int. 2019, 2019, 2103943. [CrossRef]

55. Grønning, DW; Gopal, SK; Xu, R.; Simpson, RJ; Chen, W. Exosomes og deres roller i immunregulering og cancer. I seminarer i celle- og udviklingsbiologi; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2015; Bind 40, s. 72–81.

56. Howitt, J.; Hill, AF Exosomer i patologien af ​​neurodegenerative sygdomme. J. Biol. Chem. 2016, 291, 26589-26597. [CrossRef]

57. Ribeiro, MF; Zhu, H.; Millard, RW; Fan, G. Exosomer fungerer i pro- og anti-angiogenese. Curr. Angiogenese 2013, 2, 54-59. [CrossRef]

58. Lan, J.; Sun, L.; Xu, F.; Liu, L.; Hu, F.; Sang, D.; Hou, Z.; Wu, W.; Luo, X.; Wang, J.; et al. M2 makrofag-afledte exosomer fremmer cellemigration og invasion i tyktarmskræft. Cancer Res. 2019, 79, 146-158. [CrossRef]

59. Aga, M.; Bentz, GL; Raffa, S.; Torrisi, MR; Kondo, S.; Wakisaka, N.; Yoshizaki, T.; Pagano, JS; Shackelford, J. Exosomal HIF1 understøtter invasivt potentiale af nasopharyngeal carcinoma-associerede LMP1-positive exosomer. Oncogene 2014, 33, 4613-4622. [CrossRef]

60. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Han, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ gga-miR-454 undertrykker replikation af infektiøs bursal sygdomsvirus (IBDV) via direkte målretning af IBDV genomisk segment B og cellulære suppressorer af cytokinsignalering 6 (SOCS6). Virus Res. 2018, 252, 29-40. [CrossRef]

61. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Han, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ MicroRNA gga-miR-130b undertrykker infektiøs bursal sygdom virusreplikation via målretning af det virale genom og cellulære suppressorer af cytokinsignalering 5. J. Virol. 2018, 92, e01646-17. [CrossRef]

62. Guo, XK; Zhang, Q.; Gao, L.; Li, N.; Chen, XX; Feng, WH Øget ekspression af microRNA 181 hæmmer porcin reproduktiv og respiratorisk syndrom virusreplikation og har implikationer for at kontrollere virusinfektion. J. Virol. 2013, 87, 1159-1171. [CrossRef] [PubMed]

63. Cong, P.; Xiao, S.; Chen, Y.; Wang, L.; Gao, J.; Li, M.; Han, Z.; Guo, Y.; Zhao, G.; Zhang, X.; et al. Integrerede miRNA- og mRNA-transkriptomer af porcine alveolære makrofager (PAM-celler) identificerer stammespecifikke miRNA-molekylære signaturer forbundet med H-PRRSV- og N-PRRSV-infektion. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 5863-5875. [CrossRef] [PubMed]

64. Li, N.; Huang, K.; Chen, Y.; Huang, Z.; Zhang, Y.; Leng, C.; Liu, Y.; Shi, J.; Xiao, S.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a udviser antiviral aktivitet mod porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus via suppression af værtsgener CD163. Dyrlæge. Microbiol. 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. Li, N.; Du, T.; Yan, Y.; Zhang, A.; Gao, J.; Hou, G.; Xiao, S.; Zhou, EM MicroRNA lader-7f-5p hæmme porcin reproduktiv og respiratorisk syndromvirus ved at målrette MYH9. Sci. Rep. 2016, 6, 34332. [CrossRef]

66. Zhen, Y.; Wang, F.; Liang, W.; Liu, J.; Gao, G.; Wang, Y.; Xu, X.; Su, Q.; Zhang, Q.; Liu, B. Identifikation af differentielt udtrykt ikke-kodende RNA i alveolære makrofager fra svin fra Tongcheng og store hvide grise reagerede på PRRSV. Sci. Rep. 2018, 8, 15621. [CrossRef]

67. Zhou, X.; Michal, JJ; Jiang, Z.; Liu, B. MikroRNA-ekspressionsprofilering i alveolære makrofager af indfødte kinesiske Tongcheng-grise inficeret med PRRSV in vivo. J. Appl. Genet. 2017, 58, 539-544. [CrossRef]

68. Lee, YJ; Lee, C. Porcin reproduktions- og respiratorisk syndrom-virusreplikation undertrykkes ved hæmning af den ekstracellulære signalregulerede kinase (ERK) signalvej. Virus Res. 2010, 152, 50-58. [CrossRef]

69. Sang, S.; Bi, J.; Wang, D.; Fang, L.; Zhang, L.; Li, F.; Chen, H.; Xiao, S. Porcin reproduktions- og respiratorisk syndrom-virusinfektion aktiverer IL-10-produktion gennem NF-κB- og p38 MAPK-veje i alveolære makrofager hos svin. Dev. Comp. Immunol. 2013, 39, 265-272. [CrossRef]

70. Yin, S.; Huo, Y.; Dong, Y.; Fan, L.; Yang, H.; Wang, L.; Ning, Y.; Hu, H. Aktivering af c-Jun NH (2)-terminal kinase er påkrævet for porcin reproduktiv og respiratorisk syndrom virus-induceret apoptose, men ikke for virusreplikation. Virus Res. 2012, 166, 103-108. [CrossRef]

71. Fan, L. Signalveje involveret i regulering af apoptoseinduktion i værtsceller efter PRRSV-infektion. Virusgener 2019, 55, 433-439. [CrossRef]

72. Lopez-Fuertes, L.; Campos, E.; Domenech, N.; Ezquerra, A.; Castro, JM; Dominguez, J.; Alonso, F. Porcint reproduktivt og respiratorisk syndrom (PRRS) virus nedmodulerer TNF-produktion i inficerede makrofager. Virus Res. 2000, 69, 41-46. [CrossRef]

73. Teissier, É.; Pécheur, EI Lipider som modulatorer af membranfusion medieret af virale fusionsproteiner. Eur. Biofys. J. 2007, 36, 887-899. [CrossRef]

74. Jeon, JH; Lee, C. Cellulært kolesterol er påkrævet for svine-nidovirusinfektion. Arch. Virol. 2017, 162, 3753-3767. [CrossRef]

75. Sun, Y.; Xiao, S.; Wang, D.; Luo, R.; Li, B.; Chen, H.; Fang, L. Cellulært membrankolesterol er påkrævet for indtrængning og frigivelse af porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus i MARC-145-celler. Sci. Kina Life Sci. 2011, 54, 1011-1018. [CrossRef]

76. Tian, ​​T.; Zhu, YL; Zhou, YY; Liang, GF; Wang, YY; Hu, FH; Xiao, ZD Eksosomoptagelse gennem clathrin-medieret endocytose og makropinocytose og mediering af miR-21-levering. J. Biol. Chem. 2014, 289, 22258-22267. [CrossRef]

77. Mulcahy, LA; Pink, RC; Carter, DRF Ruter og mekanismer for ekstracellulær vesikeloptagelse. J. Extracell. Vesicles 2014, 3, 24641. [CrossRef]

78. Zhang, M.; Zang, X.; Wang, M.; Li, Z.; Qiao, M.; Hu, H.; Chen, D. Exosom-baserede nanobærere som bio-inspirerede og alsidige midler til lægemiddellevering: Nylige fremskridt og udfordringer. J. Mater. Chem. B 2019, 7, 2421-2433. [CrossRef]