Synergistisk immunitet og beskyttelse i mus ved co-immunisering med DNA-vacciner, der koder for spikeproteinet og andre strukturelle proteiner i SARS-CoV-2

Abstrakt:Fremkomsten af ​​nye varianter af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS CoV-2) har genereret tilbagevendende verdensomspændende infektionsudbrud. Disse stærkt muterede varianter reducerer effektiviteten af ​​nuværende vacciner mod coronavirus sygdom 2019 (COVID-19), som er designet til kun at målrette mod spike-proteinet (S) fra det originale virus. Bortset fra S af SARS-CoV-2 er det immunbeskyttende potentiale af andre strukturelle proteiner (nukleocapsid, N; kappe, E; membran, M) som vaccinemålantigener stadig uklart og værd at undersøge. I denne undersøgelse blev syntetiske DNA-vacciner, der koder for fire SARS-CoV-2-strukturproteiner (pS, pN, pE og pM), udviklet, og mus blev immuniseret med tre doser via intramuskulær injektion og elektroporation. Navnlig inducerede co-immunisering med to DNA-vacciner, der udtrykte S- og N-proteinerne, højere neutraliserende antistoffer og var mere effektiv til at reducere SARS-CoV-virusbelastningen end S-proteinet alene i mus. Derudover inducerede pS co-immunisering med enten pN eller pE + pM en højere S-protein-specifik cellulær immunitet efter tre immuniseringer og forårsagede mildere histopatologiske ændringer end pS alene efter udfordring. Rollen af ​​de bevarede strukturelle proteiner af SARS-CoV-2, herunder N/E/M-proteinerne, bør undersøges nærmere for deres anvendelser i vaccinedesign, såsom mRNA-vacciner.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Nøgleord: COVID-19; SARS-CoV-2}}; co-immunisering; DNA-vaccine; spidsprotein; strukturelt protein

1. Introduktion

Svært akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er årsagen til coronavirus sygdom 2019 (COVID-19), som har forårsaget millioner af infektioner og dødsfald verden over og har sat menneskers sundhed og den globale økonomi i fare . Selvom effektive terapeutiske tilgange stadig ikke er tilgængelige, har de udviklet sig hurtigt, herunder anvendelsen af ​​CAR-T-celleterapi og nanoteknologi [1,2]. Vaccination er en effektiv måde at kontrollere pandemien på, og adskillige vacciner er blevet godkendt til brug af forskellige regulerende sundhedsorganer [3,4]. Coronavirus-genomet koder for fire hovedstrukturelle proteiner, nemlig spike (S), nucleocapsid (N), membran (M) og kappe (E) proteiner, som er ansvarlige for virionsamling og undertrykkelse af værtens immunrespons [5 ]. S-proteinet er sammensat af 1273 aminosyrerester indeholdende to underenheder, nemlig S1 og S2. Det medierer viral indtrængen og er et vigtigt mål for udvikling af coronavirus-vacciner [6-11]. SARS-CoV-2 S-proteinet har dog en høj mutationsfrekvens. Ikke overraskende, i SARS-CoV-2, en RNA-virus, er mutationen kontinuerlig og uundgåelig. Der har været fem SARS-CoV-2 varianter af bekymring (VOC), der er dukket op siden september 2020, herunder B.1.1.7 (UK, Alpha), B.1.351 (Sydafrika, Beta), P.1 (Brasilien, Gamma), B.1.617.2 (Indien, Delta) og B.1.1.529 (Sydafrika, Omicron) (Andreano og Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). De har alle flere mutationer i spidsproteinet [12]. Disse varianter truer effektiviteten af ​​nuværende COVID-19-vacciner, som kun er designet til at målrette mod spidsproteinet.

N-proteinet i SARS-CoV-2 binder til viralt RNA gennem et 140-aminosyre-langt RNA-bindende domæne i deres kerne på en "perle på en snor". Det er meget konserveret blandt coronavirus, og deler en ~90% sekvensidentitet med SARS-CoV, og det er også det eneste strukturelle protein inde i virion [13]. Derudover spiller det en vigtig rolle i pakning af viralt RNA i ribonucleo-capsidkomplekset og er nødvendigt for viral RNA-replikation, virionsamling og frigivelse fra værtsceller [14]. Baseret på den høje sekvenslighed af N-proteinet i coronavirus, kan det foreslås som et krydsbeskyttelsesvaccinemål. Vi har tidligere fundet ud af, at co-immunisering med to DNA-vacciner, der udtrykker E- og M-proteiner, giver delvis beskyttelse mod SARS-CoV-2, og denne metode bør overvejes under vaccineudvikling [15]. Afhængigt af landskabsdokumentet fra WHO er der normalt syv strategier for SARS-CoV-2-vaccinekandidater, som yderligere kan opdeles i tre kategorier: For det første proteinbaserede vacciner, herunder inaktiverede virusvacciner, viruslignende partikler og proteinunderenhedsvacciner; for det andet gen-baserede vacciner, herunder virus-vektorerede vacciner, DNA-vacciner og mRNA-vacciner; for det tredje en kombination af både proteinbaserede og genbaserede tilgange, såsom levende svækkede virusvacciner. DNA-teknologier, som nye genbaserede vaccinestrategier, kan hurtigt sammenligne flere vaccinekandidater og -strategier under prækliniske tests [16,17]. Teoretisk set er næsten alle virale proteiner potentielle immunogener og vaccinemål. Men så vidt vi ved, er syntetiske DNA-vacciners immunogenicitet og beskyttende potentiale i kodning af SARS-CoV-2 S-proteiner og andre strukturelle proteiner endnu ikke blevet systematisk rapporteret. Fire DNA-vacciner, der udtrykker SARS-CoV-2 S-, N-, E- og Ml-proteiner, blev evalueret for deres immunogenicitet og beskyttende effektivitet i mus for at udforske de immunologiske virkninger af S i kombination med andre strukturelle proteiner.

2. Materialer og metoder

2.1. Celler

Huh7.5-celler og humane embryonale 293T-celler blev dyrket ved 37 ◦C i en befugtet atmosfære ved 5 % CO2 gennem hele undersøgelsen. Cellerne blev dyrket i DMEM-medium (HyClone, Logan, UT, USA), suppleret med 10% FBS (GEMINI Co., Shanghai, Kina) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco, New York, NY, USA). Alle cellelinjer blev bekræftet negative for mycoplasma-kontamination.

2.2. Konstruktion af DNA-vacciner, der koder for SARS-CoV-2 S/N/E/M

Det SARS-CoV-2 S/N-proteinkodende gen, indeholdende en N-terminal Kozak-sekvens (GCCACC) efterfulgt af et initieringskodon (ATG), blev syntetiseret ved hjælp af et pattedyr-optimeret kodon (GenScript Co., Nanjing) , Kina). Det blev derefter klonet ind i ekspressionsvektoren pcDNA3.1 (+) via EcoRI- og Xbal-fordøjelse og benævnt pS/pN (DNA-vacciner) (figur 1A). pE/PM-proteinet blev konstrueret og identificeret som beskrevet tidligere [15]. Vacciner blev fremstillet under anvendelse af endotoksinfri Maxiprep-sæt (Qiagen, Beijing, Kina), og sekvenser blev bekræftet ved hjælp af Sanger DNA-sekventering. Ekspressionen af ​​S/N-proteinet blev bekræftet under anvendelse af western blotting og anti-S (Sino Biological, Beijing, Kina)/anti-N-antistoffer fortyndet ved 1:1000. Disse eksperimenter blev udført som beskrevet tidligere [15,18].

Figur 1. Design og ekspression af rekombinant DNA-baserede SARS-CoV-2 S/N-proteinvaccinekonstruktioner. (A) Skematisk diagram af de rekombinante DNA-baserede vacciner, der koder for SARS-CoV-2 spike (PS), nukleocapsid (pN), kappe (pE) og/eller membran (PM) proteiner. (B) Målproteinekspressionen i DNA-vacciner blev valideret via western blot-analyse af 293T-celler transficeret med pS/pN/pE/pM-plasmiderne.

2.3. Immunisering og udfordring

BALB/c-hunmus (Charles River Laboratories, Frankrig) i en alder af 6 uger blev anbragt på National Institute of Occupational Health and Poison Control i et 21 ◦C og fugtighedskontrolleret miljø med 12 timers lys/mørke cyklusser. I mellemtiden blev mad og vand leveret ad libitum, og alle dyreforsøg blev godkendt af Komitéen for Etik af Dyreforsøg fra det kinesiske center for sygdomskontrol og -forebyggelse (Kina CDC). Forskningen var i overensstemmelse med de relevante etiske regler.

Mus blev opdelt tilfældigt i fem grupper og immuniseret med pS/pN alene eller co-immuniseret med pS + pN eller pS + pE + PM på dagene 0, 21 og 42 via intramuskulær injektion plus elektroporation (35 mg/50) ml) (figur 2) [19,20]. Kort fortalt blev DNA-vacciner injiceret i tibialis anterior (TA) muskel og øjeblikkeligt pulseret med elektricitet under anvendelse af en 5 mm fra hinanden to-nåle array-elektrode (ECM830; BTX) med nåle. Sera fra musene blev opsamlet til humoral immunresponsanalyse, og musemilt blev behandlet for at måle det cellulære immunrespons (figur 2).

Figur 2. Skematisk over immuniseringen og SARS-CoV-2-udfordringen. Tidsforløb for vaccination, udfordring og blod-/vævsprøvetagning. BALB/C-mus blev opdelt tilfældigt i grupper.

SARS-CoV-2 udfordringseksperimenter blev udført som beskrevet tidligere [15,21]. Kort fortalt blev musene bedøvet og derefter transduceret intranasalt med 2,5 × 108 PFU af Ad5-hACE2 i et samlet volumen på 45 µL. Fem dage efter transduktion blev musene bedøvet og derefter udfordret intranasalt med 1 × 105 TCID50 af SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) i et samlet volumen på 50 µL saltvand buffer. Alt arbejdet med levende SARS-CoV-2 i musemodeller blev udført i Animal Biosafety Level 3 (ABSL-3) laboratorier.

2.4. Enzym-Linked Immunosorbent Assay

Enzym-linked immunosorbent assays (ELISA) blev udført som beskrevet tidligere [15]. Kort fortalt blev S (købt fra Sino Biological)/N-proteiner (en gave fra Song) fortyndet i carbonatbuffer (0,1 M, pH 9,6) coatet på 96-brønd EIA/RIA plader (Thermo) Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) natten over ved 4 ◦C. Pladerne blev blokeret med 200 µL 10% gedeserum i PBS ved 37 ◦C i 2 timer, efterfulgt af vask fem gange med PBST. Derefter blev serumprøver seriefortyndet i 2 % gedeserum i PBS tilsat og inkuberet i 2 timer ved 37 ◦C, efterfulgt af fem vask med PBST. HRP-konjugeret gede-anti-muse IgG Ab (1:5000) blev tilsat ved 37 ◦C i 1 time. I alt 100 µL TMB-substrat blev tilsat til hver brønd og standset med 50 µL 2M H2SO4. Absorbansen blev aflæst ved en bølgelængde på 450 nm under anvendelse af SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, Kina).

cistanche planteforøgende immunsystem

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Pseudovirusinfektion og -neutraliseringseksperimenter

Pseudovirusneutraliseringsassayet blev udført som beskrevet tidligere [21,22]. Et plasmid, der udtrykker det forfædres virus S-protein, blev tidligere konstrueret [22]. Omicron-varianten SARS-CoV-2 spike-proteingen (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) blev syntetiseret (en gave fra Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kina) under anvendelse af et pattedyr-optimeret kodon og klonet ind i pcDNA3.1-vektoren som beskrevet tidligere [22]. Kort fortalt blev plasmider, der udtrykker en luciferase-reporter, og plasmider, der udtrykker S-proteinet, co-transficeret ind i HEK 293T-celler under anvendelse af X-treme GENE HP DNA-transfektionsreagenset. Cellekulturen blev genopfrisket 6 timer efter transfektion, og den pseudovirus-holdige supernatant blev høstet efter 48 timer og opbevaret ved -70 ◦C. I pseudovirusneutraliseringsassayet blev en ensartet serum-virus-blanding derefter inkuberet ved 37 volumener af den pseudovirus-holdige supernatant og blev derefter tilsat til det fortyndede serum. ◦C i 1 time. Huh7.5-cellekulturmediet blev derefter erstattet med 100 µL af serum-virusblandingen og blev inkuberet ved 37 ◦C i 12 timer. Celler dyrket med kun SARS-CoV-2 pseudovirus blev kørt parallelt. Medierne blev derefter erstattet med DMEM (2% FBS), og inkubationen blev inkuberet ved 37 ◦C i 48 timer. Derefter blev luciferasesignalet målt under anvendelse af Bright-Glo firefly luciferase kit (Promega).

2.6. SARS-CoV-2 neutraliseringsanalyse

SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019) blev brugt i dette eksperiment. Kort fortalt blev seraene fortyndet to gange fra en startfortynding på 1:10, blandet med et lige så stort volumen (10-15 pfu/brønd) levende SARS-CoV-2 og inkuberet i 1 time ved 37 ◦C, hvorefter de blev tilføjet til de podede Vero-celler. Efter inkubation ved 37 ◦C i 48 timer blev der observeret en cytopatisk effekt (CPE), og 100 µL af kultursupernatanten blev høstet til nukleinsyreekstraktion og real-time fluorescens revers transkription PCR (RT-PCR). Den mediane neutralisationsdosis (ND50) blev beregnet ved hjælp af Reed-Munch-metoden [15].

2.7. IFN-ELISpot-assay

Peptidpuljerne, der spænder over hele S/N/E/M-proteinet som på hinanden følgende 15-merer over lapning med 10 aminosyrer, blev syntetiseret af Scilight Biotechnology, LLC. Ca. 2,5 mg af hvert oprenset peptid i peptidpuljen var til stede pr. hætteglas. Forsøget blev udført som beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt blev 96-brøndsplader (BD ELISPOT Set, USA) coatet med anti-IFN-capture Ab og inkuberet natten over ved 4 ◦C. Pladerne blev blokeret med det komplette dyrkningsmedium efter vask tre gange. Splenocytter blev høstet, efter at musene var blevet aflivet på dag 35 og 120. Friske enkeltcellesuspensioner fra hver gruppe blev udpladet med 5 x 106 pr. brønd, og peptider blev tilsat. Pladerne blev derefter inkuberet ved 37 ◦C i 5% CO2 i 22 timer og detekteret ved hjælp af en ELISpot-pladelæser (Biosys, So. Pasadena, CA, USA). En pletdannende enhed (SFU) repræsenterer en T-celle-udskillende IFN-.

2.8. Evaluering af beskyttelse i mus efter SARS-CoV-2-udfordring

Forsøgene blev udført som beskrevet tidligere [15,21]. Kort fortalt blev lungerne høstet efter at musene var blevet aflivet. Halvdelen af ​​vævene blev brugt til nukleinsyreekstraktion, real-time fluorescens RT-PCR og TCID50. Den anden halvdel blev sendt til College of Veterinary Medicine, China Agricultural University til patologisk evaluering.

2.9. Statistisk analyse

Ikke-parrede t-tests, to-vejs ANOVA-tests og Dunnetts multiple sammenligningstest blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). p-værdier < 0.05 blev betragtet som statistisk signifikante (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Resultater

3.1. Karakterisering af DNA-vacciner

E- og M-proteinniveauer blev påvist under anvendelse af western blotting. Vi målte ekspressionen af ​​de kodede S/N/E/M-proteiner af SARS-CoV-2 i HEK-293T-celler transficeret med pS/pN/pE/pM-plasmider via western blot-analyse under anvendelse af anti -S/anti-N antistoffer og et anti-6 x His antistof, i cellelysaterne. Båndene tilnærmede sig den forudsagte molekylvægt af S (140-142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) og M (22-25 kDa) proteiner (figur 1B).

3.2. Robust og vedvarende anti-S og/eller anti-N IgG produktion induceret af pS og/eller pN DNA

Vaccineserum blev opsamlet fra BALB/c-mus efter 35, 56, 96 og 120 dage (figur 2). Anti-S/anti-N IgG-niveauer blev påvist ved anvendelse af ELISA. Størrelsen af ​​det S- eller N-specifikke IgG-respons induceret af pS eller pN blev øget i serumet efter det første og andet boost. Anti-S og anti-N IgG titerne var højere i pS + pN gruppen end de var i de andre grupper; dog var forskellen ikke statistisk signifikant (figur 3A, B). Der blev ikke påvist robuste E/M-proteinspecifikke antistofresponser, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af en tidligere undersøgelse (data ikke vist) [15].

Figur 3. B-celle-responser på SARS-CoV-2 i BALB/c-mus. (A) Serum IgG-bindingsendepunktstitre for SARS-CoV-2 S (A) og N-proteinerne (B). (C) Neutraliseringstitre blev bestemt baseret på et SARS-CoV-2 pseudotype-virussystem. (D) Anti-SARS-CoV-2 neutraliseringstitre blev bestemt ved hjælp af en SARS-CoV-2-virus. (E) Neutraliseringsassay baseret på et SARS-CoV-2 Omicron pseudotype-virussystem. Hæmningsforholdet for seraene fra mock (blå), pS (rød), pS + pN (grøn), pS + pE + pM (pink) og pN (orange) grupper er vist. Fejlbjælker repræsenterer SEM, og p-værdier blev beregnet ved hjælp af en tovejs ANOVA og Sidaks post hoc analyse, hvor * p < 0.05

3.3. Høje niveauer af neutraliserende antistof induceret af co-immunisering med pS- og pN-vacciner

De neutraliserende titere af serielt fortyndede serumprøver blev bestemt ved anvendelse af det pseudotypede SARS-CoV-2-virus. De højeste niveauer af neutraliserende antistoffer (nAbs) blev observeret i pS + pN-gruppen, hvor de gensidige EC50 geometriske middeltitere nåede 2988 (på dag 35) og 3578 (på dag 56) (figur 3C). Lignende resultater blev observeret ved brug af levende virus mikroneutralisering (MN) assay, hvor niveauerne af nAbs i pS + pN gruppen var højere end dem i S gruppen på dag 56 og 96 (p < 0.05; figur 3D). Desuden var niveauerne af nAbs i pS + pN-gruppen på dag 56 (andet boost) signifikant højere end dem på dag 35 (p < 0,05; figur 3D).

Den neutraliserende aktivitet af hvert vaccineregime mod SARS-CoV-2 Omicron-varianten blev yderligere bestemt ved hjælp af den pseudotypede platform og serumprøver. Neutraliseringsprofilen mod Omicron-virussen på dag 35 og 56 svarede til profilen mod den forfædres virus (figur 3E), hvilket tyder på, at PS + pN-behandlingen havde krydsneutraliserende styrke.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

3.4. T-celleresponser induceret af DNA-vaccination

Som tidligere beskrevet blev T-celleresponserne mod SARS-CoV-2 S/N/E/M-antigener estimeret ved hjælp af IFN-ELISpot, som tidligere beskrevet [15]. Som forventet inducerede både PS + pN og pS + pE + pM regimerne signifikant højere niveauer af IFN + T-celler, der er specifikke for S-proteinet på dag 120 end på dag 35 (p < 0. 05; figur 4A). Desuden var antallet af IFN+T-celler, der var specifikke for N-proteinet på dag 120 (andet boost) signifikant højere end på dag 35 i pS+pN-gruppen (p < 0,05; figur 4B). Endelig var antallet af IFN + T-celler, der var specifikke for M-proteinet på dag 120 (andet boost) signifikant højere end på dag 35 i begge grupper (p < 0,05; figur 4D).

Figur 4. T-celleresponser på SARS-CoV-2 individuelle strukturelle proteiner i BALB/c-mus. (A) T-celleresponser blev målt ved hjælp af IFN-ELISpot i splenocytter stimuleret i 20 timer med overlappende peptidpuljer, der spænder over SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, og (D) M-proteiner. Søjler repræsenterer middelværdien ± SD. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en tovejs ANOVA og Sidaks post hoc test, hvor * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 og ****p < 0,0001.

3.5. Synergistisk beskyttelse induceret af co-immunisering med pS/pN eller pS/pE/pM

Vi evaluerede derefter den beskyttende effektivitet af DNA-vacciner ved hjælp af hACE2-mus immuniseret post-challenge med det forfædrede SARS-CoV-2-virus. Efter udfordringen udviste musene i den falske gruppe gradvist vægttab. I modsætning hertil viste musene immuniseret med enten pS eller pS+ mildt vægttab umiddelbart efter infektion, efterfulgt af restitution (figur 5A). Der blev ikke påvist noget levende virus i musene vaccineret med pS, pS + pN eller pS + pE + pM. Desuden reducerede pS + pN-vaccinationen signifikant antallet af virale RNA-kopi sammenlignet med dem, der blev opnået med pS-vaccination alene (p=0.0228; figur 5B). Desuden viste lungehistopatologi, at mus i både mock- og pN-grupperne viste fokale pletter af inflammation, pleural invagination, alveolær kollaps, høje niveauer af inflammatorisk celleinfiltration og hæmoragiske områder. Til sammenligning udviste mus behandlet med enten pS + pN eller pS + pE + pM mildere histopatologiske ændringer og lavere INHAND-score efter udfordring end den anden gruppe (figur 5C).

Figur 5. Beskyttende virkning af immunisering efter udfordringen med levende SARS-CoV-2-virus. (A) Mus blev vejet dagligt (gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM), n=4) i tre dage efter udfordring. (B) Infektiøs SARS-CoV-2-titer i lungehomogenater på dag tre efter udfordring, som bestemt via TCID5{{10}}-analysen og RNA-kopinummeret. Statistisk signifikante forskelle mellem grupper blev bestemt ved hjælp af en envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningskorrektion (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 og ****p < 0,0001). (C) Lungehistopatologisk analyse ved brug af H&E-farvning.

4. Diskussion

I denne undersøgelse inducerede co-immunisering med to DNA-vacciner, der udtrykker S- og N-proteinerne, høje niveauer af nAbs og var yderst effektiv til at reducere SARS-CoV-2-virusbelastningen i mus. DNA-vacciner, der udtrykker S-proteinet, inducerede øgede S-protein-specifikke cellulære immunitetsniveauer efter tre immuniseringer, når mus blev co-immuniseret med N/E- og M-proteiner og lindrede de histopatologiske ændringer efter udfordring. Så vidt vi ved, er dette den første rapport, der afslører den synergistiske forbedring af immunitet og beskyttelse hos mus, der bruger en DNA-vaccine, der koder for S-proteinet, når de co-immuniseres med DNA-vacciner, der koder for andre strukturelle proteiner af SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Immundominante B-celleepitoper i N antigenregioner er blevet observeret i adskillige undersøgelser. N-baserede vacciner kan normalt ikke inducere nAbs, sandsynligvis fordi N-proteinet ikke vises på den virale overflade. Det er bemærkelsesværdigt, at co-immunisering med S- og N-proteinerne inducerede højere niveauer af nAbs mod forfædres og Omicron SARS-CoV-2-virus end de andre grupper. Forøgede nAb-responser er forbundet med bedre viral clearance og beskyttende effektivitet. Vores resultater viste, at pS + pN-behandlingen var mere effektiv end pS-behandlingen alene til at reducere SARS-CoV-2 viral belastning efter udfordring. En tidligere undersøgelse rapporterede, at hamstere immuniseret med en vaccine, der co-udtrykker M- og N-proteinerne, var beskyttet mod alvorligt vægttab og lungepatologi og havde signifikant reducerede virale titere i oropharynx og lunger efter SARS-CoV-2-udfordring, hvilket er i overensstemmelse med vores resultater [23]. Desværre kan reduktionen i virustitre ikke specifikt tilskrives M- eller N-proteinet, og nAb-niveauer blev ikke evalueret i denne undersøgelse. Et SARS-CoV-2 mRNA-vaccinestudie rapporterede, at S + N co-immunisering inducerede en forstærket S-specifik CD8+ T-celle-respons og neutraliserende antistofaktivitet, hvilket gav bedre beskyttelse i lungerne mod Delta variant sammenlignet med S alene, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af denne undersøgelse [24]. En anden undersøgelse rapporterede, at N-proteinet fra overførbar gastroenteritis coronavirus fremmede syntesen af ​​neutraliserende antistoffer, når TGEV-IMMUNE-celler fra svin blev stimuleret med en kombination af S- og N-proteiner in vitro, og denne effekt kan forklares af hjælper-T-lymfocyt-reaktionen på N-proteinet [25].

Immundominante CD4+/CD8+ T-celleepitoper i N-antigenregioner er tidligere blevet identificeret. Adskillige undersøgelser har rapporteret, at vacciner baseret på SARS-CoV-2 N-proteinet effektivt inducerer cellulære immunresponser. S+N-gruppen viste øgede S-proteinspecifikke cellulære immunitetsniveauer efter tre immuniseringer. Et SARS-CoV-2 mRNA-vaccinestudie rapporterede, at kombinatorisk S + N inducerede en forstærket S-specifik CD8+ T-celle-respons sammenlignet med S alene, hvilket er i overensstemmelse med vores resultater [24]. En anden undersøgelse rapporterede, at T-celle-responser på S- og N-antigener efter dobbelt-antigen hAd5 S + N-primevaccination alene var ækvivalente med dem fra tidligere SARS-CoV-2--inficerede patienter og i silico-forudsigelsesmodeller af T-celle epitop HLA-binding antydede, at T-celleresponser på hAd5 S+N-vaccinen vil bevare deres effektivitet mod B.1.351-varianten. Desuden viste plasma fra tidligere SARS-CoV-2-inficerede patienter en højere bindingsaffinitet til celler, der udtrykker det dobbelte antigen S-Fusion + N-ETSD-konstruktion end til hAd5 S-Fusion alene, hvilket yderligere tyder på, at immunogeniciteten af S+N-dobbeltantigenvaccinen er bedre end den for S-enkeltantigenvaccinen [26].

Den levende virus blev ikke påvist i lungerne, og vægttab efter udfordring blev mildnet i grupperne pS, pS + pN og pS + pE + pM, mens pN-behandlingen ikke effektivt reducerede virustiteren. Disse resultater understreger S-proteinets uundværlighed og effektivitet som et vaccinemål. Navnlig havde co-immunisering med pS og pN bedre virkninger end enten pS eller pN på viral clearance. pS + pE + pM-gruppen indikerede færre histopatologiske ændringer i lungerne, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af vores tidligere undersøgelse [15]. S+N-gruppen havde lave virale RNA-kopier i lungen, reduceret vægttab og en hurtig restitutionstid post-SARS-CoV-2-udfordring sammenlignet med gruppen immuniseret med S/N alene, hvilket var i overensstemmelse med resultaterne af denne undersøgelse. Ingen af ​​grupperne påviste imidlertid de neutraliserende antistoftitre, hvilket kan forklares ved forskelle i vaccinevarianter og forsøgsdyr [26]. Et SARS-CoV-2-adenovirusvektorvaccinestudie rapporterede, at S-vaccinen kun gav akut hjernebeskyttelse, når den blev co-immuniseret med en N-vaccine [27]. En anden undersøgelse udviklede Tri: ChAd, Bi: ChAd og Mono: ChAd vacciner, der udtrykker henholdsvis S1/N/RdRp, N/RdRp og S1 proteinerne, og testede dem i en B.1.351 dyremodel. Omfattende grov patologi blev observeret i Mono: ChAdlungs, hvorimod Bi: ChAd og Tri: ChAd lunger forekom næsten fri for denne patologi [28].

Ydermere havde uvaccinerede dyr høje lungevirusmængder, hvorimod Tri:ChAd-behandlingen reducerede virusmængden signifikant med 3,5 log. Til sammenligning reducerede både Bi: ChAd- og Mono: ChAd-vacciner kun moderat virusmængden. Disse resultater tyder på, at den beskyttende effekt af S/N-dobbeltantigenvaccinen mod varianter kan være bedre end den af ​​S-enkeltantigenvaccinen, hvilket er i overensstemmelse med vores resultater [28]. Nogle få undersøgelser har rapporteret, at N-proteinimmuniserede mus udvikler alvorlig lungebetændelse efter SARS-CoV-infektion [29-31]. Tidligere undersøgelser har også rapporteret, at immunisering med en adenovirusvektorvaccine, der udtrykker musehepatitisvirus N-proteinet, beskytter mus mod dødelig infektion, hvilket viser, at N-proteinet kunne generere en beskyttende effekt [32]. Desuden havde gruppen immuniseret med CRT/N DNA-vaccinen en signifikant reduceret viral titer efter udfordring, med et vacciniavirus, der udtrykker SARS-CoV N-proteinet [33].

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

En undersøgelse af S-proteinet viste, at den kombinerede DNA/protein-vaccine inducerede både humoral og cellulær immunitet bedre end DNA/protein-vaccinen alene [8]. Vacciner, der kun er rettet mod S-proteinet, har vist reduceret effektivitet til at beskytte mod mild til moderat COVID-19 forårsaget af nye varianter. Rollerne af konserverede SARS-CoV-2 strukturelle proteiner, herunder N/E/M-proteinerne, er værd at være opmærksom på i vaccinedesign og -applikationer, da vaccine-inducerede T-celle-responser mod konserverede epitoper generelt er upåvirkede af mutationer . En undersøgelse rapporterede, at SARS-restituerede patienter (n=23) stadig havde langvarige hukommelses-T-celler, der var reaktive over for SARS-CoV N-proteinet 17 år efter udbruddet i 2003, som viste robust krydsreaktivitet med SARS CoV{ {15}} N-protein, hvilket yderligere validerer brugen af ​​N-proteinet som et krydsbeskyttende vaccinemål [34]. Denne undersøgelse viste, at pS/pN co-immuniseringen var forbundet med højere nAb-responser, bedre viral clearance og forbedrede cellulære immunresponser og kan give bedre beskyttelse efter SARS-CoV-2-udfordringen sammenlignet med pS alene. Desuden har SARS-CoV-2-varianter vist sig at inficere mange dyrearter, og menneske-til-dyr-transmission er blevet observeret hos nogle vilde dyr og kæledyr [7]. Så den veterinære SARS-CoV-2-vaccine har brug for mere opmærksomhed. Derudover kan nanoteknologi være et kraftfuldt værktøj til at optimere vacciner og fortjener mere opmærksomhed [2].

Denne undersøgelse har flere begrænsninger. For det første observerede vi kun DNA-vaccinestrategien i BALB/c-mus, og fremtidige undersøgelser bør vurdere de immunogene virkninger af disse vaccineregimer i andre dyremodeller. For det andet er der behov for yderligere forskning for fuldt ud at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for de forøgede nAb- og S-specifikke CD8 T-celle-responser induceret af co-immunisering ved hjælp af S- og N-proteinerne og for at udnytte denne viden til at optimere COVID-19 vaccine design. Endelig fortjener funktionen af ​​N-proteinspecifikke antistoffer yderligere undersøgelse.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Som konklusion evaluerede denne undersøgelse det immunbeskyttende potentiale ved co-immunisering med SARS-CoV-2 S-, N-, E- og M-proteinerne. Adskillige vacciner, der kun er målrettet mod S-proteinet, har en reduceret beskyttende effekt på de nye variantstammer. Vores resultater vil lægge et grundlag for udvikling af en krydsreaktiv COVID-19-vaccine til at kontrollere nuværende og nye SARS-CoV-2-varianter og forhindre potentielle -coronavirus-pandemier.

Referencer

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, I.; Petukhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. Anvendelse af CAR-T-celleterapi ud over onkologi: autoimmune sygdomme og virale infektioner. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et al. Nanoteknologi mod det nye coronavirus (svært akut respiratorisk syndrom coronavirus 2): Diagnose, behandling, terapi og fremtidsperspektiver. Nanomedicine 2021, 16, 497-516. [CrossRef]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, S. COVID-19 flokimmunitet: Hvor er vi? Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 583-584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Miller, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Immunologiske overvejelser for COVID-19-vaccinestrategier. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 615-632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG Strukturel analyse af SARS-CoV-2-genom og forudsigelser af det humane interaktom. Nucleic Acids Res. 2020, 48, 11270-11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mekanismer for SARS-CoV-2 indtræden i celler. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3-20. [CrossRef]

7. Conforti, A.; Sanchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; et al. En lineær DNA-vaccinekandidat, der koder for SARS-CoV-2-receptorbindingsdomænet, fremkalder potent immunrespons og neutraliserende antistoffer hos huskatte. Mol. Ther. Metoder Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Borgoyakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Shcherbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et al. Immunogenicitet af den kombinerede DNA/proteinvaccine mod COVID-19. Tyr. Exp. Biol. Med. 2023, 1-4. [CrossRef]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tang, H.; Zhang, X.; Tian, ​​F.; et al. Cirkulære RNA-vacciner mod SARS-CoV-2 og nye varianter. Celle 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. SARS-CoV-2 mRNA-vaccinedesign muliggjort af prototype-patogenberedskab. Nature 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R.; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; et al. SARS-CoV-2 spike glycoprotein vaccinekandidat NVX-CoV2373 immunogenicitet hos bavianer og beskyttelse hos mus. Nat. Commun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abbiento, V.; Benincasa, L.; et al. Hybrid immunitet forbedrer B-celler og antistoffer mod SARS-CoV-2-varianter. Nature 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammad, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Indsigt i SARS-CoV-2-genom, struktur, evolution, patogenese og terapier: Strukturel genomisk tilgang. Biochim. Biofys. Acta Mol. Basis. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. Indiens nye COVID-19 DNA-vaccine til unge og voksne er den første. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Y.; Huang, B.; Han, D.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; et al. DNA-vacciner, der udtrykker kappe- og membranproteiner, giver delvis beskyttelse mod SARS-CoV-2 hos mus. Foran. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebas, P.; Kraynyak, KA; Patel, A.; Maslow, JN; Morrow, MP; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; et al. Intradermal SynCon® Ebola GP DNA-vaccine er temperaturstabil og demonstrerer sikkert cellulær og humoral immunogenicitetsfordele hos raske frivillige. J. Infect. Dis. 2019, 220, 400-410. [CrossRef]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, EN; Walker, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; et al. Immunogenicitet af en DNA-vaccinekandidat mod COVID-19. Nat. Commun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Z.; Deng, Y.; Niu, P.; Sang, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huang, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; et al. Co-immunisering med CHIKV VLP og DNA-vacciner fremkalder en lovende humoral respons hos mus. Front Immunol. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guan, J.; Deng, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. Priming med to DNA-vacciner, der udtrykker hepatitis C-virus NS3-protein målrettet mod dendritiske celler, fremkalder overlegen heterologt beskyttelsespotentiale i mus. Arch. Virol. 2015, 160, 2517-2524. [CrossRef]

20. Chen, H.; Wen, B.; Deng, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. Forbedret effekt af DNA-immunisering plus in vivo elektroporation med en kombination af hepatitis B-viruskerne-PreS1- og S-PreS1-plasmider. Clin. Vaccine Immunol. 2011, 18, 1789-1795. [CrossRef]

21. Yang, R.; Deng, Y.; Huang, B.; Huang, L.; Lin, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Zhan, Z.; et al. En kerne-skal struktureret COVID-19 mRNA-vaccine med et gunstigt biodistributionsmønster og lovende immunitet. Signaltransdukt. Mål Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. Udvikling og effektivitet af pseudotype SARS-CoV-2-system som bestemt ved neutraliserende effektivitet og indgangshæmningstest in vitro. Biosaf. Sundhed 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Replikerende bakterievektorvaccine, der udtrykker SARS-CoV-2-membran- og nukleocapsidproteiner, beskytter mod alvorlig COVID-19-lignende sygdom hos hamstere. NPJ Vaccines 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Adam, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; et al. Kombinatorisk mRNA-vaccination forbedrer beskyttelsen mod SARS-CoV-2 delta-varianten. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Anton, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Samarbejde mellem overførbare gastroenteritis coronavirus (TGEV) strukturelle proteiner i in vitro induktion af virus-specifikke antistoffer. Virus Res. 1996, 46, 111-124. [CrossRef]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Skrædder, N.; Frost, K.; Booth, S.; Sajesh, B.; et al. Enkelt immunisering med rekombinante ACAM2000 vacciniavirus, der udtrykker spidsen og nukleocapsidproteinerne, beskytter hamstere mod SARS-CoV-2-forårsaget klinisk sygdom. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Klasse, J.; Pokkers.; Richner, JM En SARS CoV-2-nukleocapsidvaccine beskytter mod distal viral spredning. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Ja, G.; Luo, X.; et al. Respiratorisk slimhindelevering af næste generation af COVID-19-vaccine giver robust beskyttelse mod både forfædres og variantstammer af SARS-CoV-2. Celle 2022, 185, 896-915.e19. [CrossRef]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. Øget ekspression af SARS-CoV-nukleocapsidproteinet i tobak og dets immunogenicitet i mus. Vaccine 2009, 27, 5001-5007. [CrossRef]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et al. Tidligere immunisering med alvorligt akut respiratorisk syndrom (SARS)-associeret coronavirus (SARS-CoV) nukleocapsidprotein forårsager alvorlig lungebetændelse hos mus inficeret med SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337-6348. [CrossRef]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Sims, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Pickles, R.; et al. Vaccineeffektivitet hos ældre mus udfordret med rekombinante SARS-CoV-bærende epidemiske og zoonotiske spidsvarianter. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, PJ Musehepatitisvirusspids- og nukleocapsidproteiner udtrykt af adenovirusvektorer beskytter mus mod en dødelig infektion. J. Gen. Virol. 1993, 74, 2061-2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Hung, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Han, L.; Chen, PJ; et al. Generering og karakterisering af DNA-vacciner rettet mod nukleocapsidproteinet af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus. J. Virol. 2004, 78, 4638-4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tan, N.; Linster, M.; et al. SARS-CoV-2-specifik T-celleimmunitet i tilfælde af COVID-19 og SARS og uinficerede kontroller. Nature 2020, 584, 457–462. [CrossRef]