Immunreaktioner på sekventiel binokulær transplantation af allogene retinale progenitorceller til glaslegemet hos mus

Abstrakt:

Intravitreal transplantation af allogene humane retinale progenitorceller (RPC) lover som en behandling for blændende retinal degeneration. Tidligere arbejde har vist, at neurale progenitorer tolereres godt som allotransplantater efter enkelte injektioner; sekventiel levering af allogene celler øger imidlertid den potentielle risiko for værtsensibilisering med efterfølgende immunafstødning af transplantater. Den nuværende undersøgelse var designet til at vurdere, om et immunrespons ville blive induceret af gentagne intravitreale transplantationer af allogene RPC'er ved anvendelse af musedyremodellen. Vi injicerede murine retinale progenitorceller (gmRPC'er), oprindeligt afledt af donorer med en C57BL/6 genetisk baggrund, i BALB/c-modtagermus for at give sikkerhedsdata om, hvad der kan forventes efter gentagen behandling af patienter med allogent humant celleprodukt . Immunreaktioner på gmRPC'er var milde, bestående af T-celler, B-celler, neutrofiler og naturlige dræberceller, hvor makrofager klart dominerede. Dyr behandlet med gentagne doser af gmRPC'er viste ikke tegn på sensibilisering, og der var heller ikke immunmedieret ødelæggelse af transplantaterne. På trods af fraværet af immunsuppressive behandlinger overlevede allogene gmRPC-transplantater efter gentagen dosering, hvilket gav støtte til den foreløbige observation, at gentagen injektion af allogene RPC'er til glaslegemet tolereres hos patienter med retinitis pigmentosa.

cistanche planteforøgende immunsystem

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Nøgleord: stamceller; immuntolerance; immun privilegium; graft afvisning; intravitreal injektion

1. Introduktion

Retinitis pigmentosa (RP) omfatter en klasse af genetisk stav-kegle-degeneration og resulterer i progressiv synsnedsættelse og eventuel blindhed. For langt de fleste tilfælde er der ingen dokumenterede terapeutiske foranstaltninger til rådighed for at bevare eller genoprette synet; dog er en strategi til at imødekomme dette udækkede medicinske behov stamcelletransplantation. Vores forskningsgruppe har udforsket intravitreal injektion af dyrkede humane retinale stamceller (RPC) som en måde at intervenere i RP med det terapeutiske mål at stabilisere progression eller måske vende sygdomsforløbet. RPG'er kan afledes fra umodne nethinder via vævsdonation eller for nylig fra pluripotente cellelinjer. Undersøgelser i dyremodeller har vist, at disse celler er i stand til at redde fotoreceptorer fra degeneration efter injektion i øjet og er også i stand til at differentiere til stavfotoreceptorer i værtsøjet. Der er nogle beviser fra dyreforsøg på, at injicerede hRPC'er kan blive funktionelle, integrerede fotoreceptorer og derved potentielt stabilisere nethinden ved direkte at erstatte døende celler. Således kan injicerede hRPC'er behandle RP på både en neurotrofisk måde såvel som via en celleudskiftningsmekanisme. Uanset hvad, tilbyder denne cellebaserede tilgang en rationel strategi til behandling af patienter, der er ramt af RP og potentielt andre nethindesygdomme.

En anden gunstig egenskab ved RPC'er, og måske neurale stamceller generelt, er den relative tolerance, der gives disse celler efter transplantation som allotransplantater, især når de leveres til et sted, der udviser immunprivilegier såsom nethinden [1,2]. Når det er sagt, rapporterer nylige gennemgange af kliniske forsøg udført inden for regenerativ medicin fortsat udbredte og betydelige udfordringer relateret til inflammation og immunafstødning [3,4], herunder for interventioner rettet mod øjet såsom retinal genterapi [5], som samt nogle, men ikke alle, celleterapier [6]. Selvom en lokal celletype er retinal pigmentepitel (RPE) celle ikke fritaget for afstødningsproblemer [7-9]; derfor er immunsuppression af modtagere i øjeblikket standardpraksis [10,11]. Humane RPC'er ser på den anden side ud til at være bemærkelsesværdigt veltolererede som allotransplantater [6,12-16], selvom dette ikke strækker sig til deres anvendelse som xenotransplantater, hvor immunundertrykkelse er påkrævet [17]. Grundlaget for vedvarende overlevelse af allogene RPC'er i øjet involverer sandsynligvis en række faktorer relateret til de anvendte celler og modtagerstedet [1,8,18,19]. I tidligere arbejde ved hjælp af flowcytometri har vi vist, at humane neurale stamceller, både hjerne-afledte og retina-afledte, udtrykker klasse I, men ikke klasse II, major histocompatibility (MHC) antigener [20,21]. Den klassiske mekanisme for graftafstødning involverer den uspecifikke genkendelse af fremmede MHC klasse II-molekyler af CD4+ værtslymfocytter [20-25]. På den måde kan et fravær af klasse II-molekyler tillade podede stamceller at undgå immunafstødning medieret via denne mekanisme. Imidlertid er den tilsyneladende "immun privilegeret" status for intravitrealt injicerede hRPC'er ikke nødvendigvis absolut. Mens murine centralnervesystem (CNS) progenitorer ikke udtrykker påviselige klasse I eller klasse II MHC molekyler ved baseline og udviser tilsyneladende immunprivilegier som allotransplantater [1,2,20], kan disse celler undergå immunafstødning under visse omstændigheder. Undersøgelser har vist, at MHC-antigener kan induceres gennem stimulering af CNS-progenitorer med interferon-gamma (IFN) [1,26]. CNS-progenitorer kan afvises efter sensibilisering af en tidligere podet vært. Derfor udtrykker CNS-progenitorceller (inklusive RPC'er) alloantigener, der detekteres af værtens immunsystem. Tilsammen indebærer dette, at den immunprivilegerede status for transplanterede stamceller er foreløbig og underlagt modulering, f.eks. af cytokiner, der er til stede i det lokale mikromiljø, og som kan undergå forandring i løbet af degenerationer, såsom RP. Af alle disse grunde er immunresponset på flere intravitreale RPC-injektioner vanskelig at forudsige og skal undersøges specifikt.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Hvis RPC-behandling viser sig at være klinisk vellykket i RP, vil der være stærke incitamenter til behandling af begge øjne i denne bilaterale blændende sygdom. I det mindste af sikkerhedsmæssige årsager vil kikkertbehandlinger typisk blive udført sekventielt med en betydelig forsinkelsestid mellem de to injektioner. Det skal bemærkes, at denne sekventielle levering af allogene celler kan resultere i værtsensibilisering som reaktion på den første injektion, hvilket potentielt kan udløse immunafstødning som reaktion på den anden injektion. Dette kan resultere i tab af transplantater i begge øjne. Tidligere rapporter, der undersøgte enkelt subretinal dosering med hRPC'er i RP [27] eller gendosering med humane neurale progenitorer i dyr [28,29] inkorporerede immunsuppression. Derfor blev den følgende undersøgelse designet som en translationel undersøgelse af murine RPC'er som sekventielle allotransplantater i en immunkompetent musestamme med en forskellig genetisk baggrund. Selvom det ikke inkluderede humane RPC-produkter, blev dette arbejde udført som en del af IND-aktiverende undersøgelser for at give dyredata, der omhandler sikkerhed, dvs. hvorvidt immunsuppression ville være nødvendig for patienter, der modtager gentagne RPC-allotransplantatbehandlinger i FDA-registrerede forsøg.

2. Resultater

For at studere de immunologiske konsekvenser af bilateral RPC-injektion i allogene mus, blev gmRPC'er (C57BL/6 genetisk baggrund) injiceret intravitrealt i det ene øje af BALB/c-modtagere, og en anden dosis RPC'er blev injiceret i det andet øje 2 uger senere. 2-ugens tidsinterval blev valgt til at være tilstrækkeligt til at tillade det første transplantat at inducere både medfødte og adaptive immunresponser. Ingen af ​​forsøgsdyrene modtog nogen immunsuppressive lægemiddelbehandlinger, således at de naturlige fysiologiske immunresponser kunne observeres.

2.1.Klinisk observation og oftalmisk undersøgelse afslørede ingen abnormiteter

Vægten af ​​forsøgsdyr blev målt på tidspunktet for hver gmRPC-injektion. Alle forsøgsdyr viste vægtøgning mellem første og anden injektion, hvilket var i overensstemmelse med et generelt godt helbred. Dyr, der blev afsluttet på dag 14 og dag 28 ± 1 efter den anden gmRPC-injektion, blev undersøgt gennem det kirurgiske mikroskop. Både de anteriore og posteriore segmenter af størstedelen af ​​de undersøgte øjne blev vurderet til at være "inden for normale grænser" (WNL). Der var ingen tegn på inflammation eller andre synlige abnormiteter i ubehandlede, sham-behandlede og gmRPC-behandlede grupper, hvilket indikerer, at gmRPC intravitreal injektion ikke ulovlige inflammatoriske reaktioner eller fysisk vævsskade, der kunne påvises via denne metode. Celleklynger omfattende transplantatet var synlige i glaslegemet på både dag 14 og dag 28 ± 1 efter den anden gmRPC-injektion (figur 1). Gentagen injektion af gmRPC'er inducerede ikke mærkbare ændringer i størrelsen af ​​celleklyngerne, i overensstemmelse med vedvarende donorcelleoverlevelse. Grov patologi blev også evalueret ved det terminale endepunkt, og ingen forstørrede øjeæbler (indikerende for tumordannelse) eller andre abnormiteter blev noteret.

Figur 1. Transplanterede gmRPC'er visualiseret in vivo via fundusfotografering gennem et kirurgisk mikroskop (alle=venstre øje, OS). (A, B), sham-behandlede dyr (sham/sham, S/S); (C, D), kontroldyr med sham-behandlet højre øje efterfulgt af gmRPCs-behandlet venstre øje (sham/celle, S/C), og dyr med begge øjne behandlet sekventielt med gmRPC'er (celle/celle, C/C) blev observeret og afbildet gennem det kirurgiske mikroskop. Det øverste panel (A, C, E) viser billeder af OS taget på dag 14 efter anden injektion; det nederste panel (B, D, F) viser billeder af OS taget på dag 28 efter anden injektion. Allotransplantater blev set som blegfarvede celleklumper (pile) synlige i glaslegemet af celleinjicerede venstre øjne (S/C, C/C) på begge tidspunkter (dag 14: (C, D); og dag 28: ( E, F)). Bortset fra transplantater var der ingen tydelig inflammation eller yderligere abnormitet set i de forreste og bageste segmenter, set aksialt på denne måde.

2.2. Immunfluorescerende mærkning viste immunceller i glaslegemet

Immunfluorescerende mærkning for fem store immuncelletyper (makrofager, neutrofiler, naturlige dræberceller, T-celler og B-celler) blev udført på de okulære kryosektioner og afslørede positiv immuncelleinfiltration i øjet efter gmRPC-injektion (figur 2A-F). T-celle (CD3), B-celle (CD45R), neutrofil (Ly-6G) og naturlige dræberceller (CD49b) udviste en begrænset tilstedeværelse i øjne injiceret med gmRPC'er, hvorimod aktiverede makrofager (Iba-1 ) var de vigtigste immunceller, der reagerede på de intravitreale transplantater. Sammenlignelig væv fra ubehandlede og sham-behandlede dyr viste ikke immunceller i okulære kryosektioner, hvilket tyder på, at den set immuncelleinfiltration var en reaktion på gmRPC-transplantaterne. I overensstemmelse med denne observation var immuncellerne lokaliseret i området omkring gmRPC-transplantaterne eller i selve gmRPC-klyngerne.

Figur 2. Immunmærkning af infiltrerede immunceller efter behandlingsgruppe. Immunfluorescerende billeder af (A) kontrolsnit (sekundært antistof alene), (B) anti-Iba-1 (aktiveret makrofag og mikroglia-markør), (C) anti-Ly-6G (neutrofil markør), (D) anti-CD49b (naturlig dræbercellemarkør), (E) antistoffer anti-CD3 (T-cellemarkør) og (F) anti-CD45R (B-cellemarkør) vises i figuren. De tilstedeværende begrænsede røde signaler indikerer positiv antistofmærkning for leukocytmarkører, grønne signaler indikerer gmRPC-transplantaterne og blå signaler indikerer DAPI-kernemærkning. Gul er et uspecifikt overlap af signaler, mest tydeligt i de ydre fotoreceptorsegmenter, som udviser autofluorescens. Behandlingsgrupper: ubehandlet (UT), begge øjne ubehandlede; S/S, begge øjne sham-behandlet (sekventielt) med vehikel; S/C, højre øje injiceret med vehikel efterfulgt af venstre øje med 50,000 gmRPC'er og; C/C, begge øjne injiceret med 50,000 gmRPC'er (sekventielt) pr. skema i afsnit 4

Topantallet af hver immuncelle i øjet varierede efter celletype (figur 3A-E). I modsætning hertil afslørede tovejs ANOVA ingen forskelle i immuncelleinfiltration ved sammenligning af dyr, der modtog enkelte gmRPC-injektioner (sham/celler) med dem, der modtog bilaterale injektioner (celler/celler). Dette var tilfældet for infiltration af makrofager (anti-Iba-1-farvning) (figur 3A), neutrofiler (anti-Ly-6G-farvning) (figur 3B), naturlige dræberceller (CD49b-farvning) ( Figur 3C), T-celler (CD3-farvning) (Figur 3D) og B-celler (CD45R-farvning) (Figur 3E).

2.3. ELISPOT viste ikke antigengenkaldelsessvar

ELISPOT er en måde at analysere antigenspecifik IFN-producerende T-celleaktivering. Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA)-behandling var en positiv kontrol, der efterlignede den anden budbringer, DAG, for at aktivere T-cellereceptorvejen og på sin side forårsage T-celleaktivering. I figur 4A-D viste PMA-behandlede grupper meget højere IFN-pletantal sammenlignet med kontrolgrupper med responderceller alene (dvs. lymfocytter fra CLN'er, splenocytter fra milte). Når respondercellerne blev dyrket sammen med C57BL/6 splenocytter (B6 SPL), var prøverne på dag 14 sammenlignelige med respondercellerne alene med kun lidt højere IFN-pletantal, hvilket indikerer mangel på T-celleaktivering (Figur 4A, B).

Figur 3. Kvantificering af immuncelleinfiltration efter gmRPC-transplantation. Infiltrerede immunceller blev visualiseret som røde fluorescerende signaler inden for billeddannelsesfeltet efter gmRPC-injektion for hver eksperimentel tilstand, talt ved hjælp af ImageJ og plottet i søjlediagrammer. Data fra Iba-1 (aktiveret makrofag og mikroglia-markør) (A), anti-Ly-6G (neutrofilmarkør) (B), anti-CD49b (markør for naturlige dræberceller) (C), antistoffer anti-CD3 (T-cellemarkør) (D) og anti CD45R (B-cellemarkør) (E) blev vist i figuren. Tovejs ANOVA-tests blev brugt til at teste signifikans mellem sham/celle- og celle/cellegrupperne; p-værdier var: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 og (E) p < 0,7201 (ingen var signifikant).

Ved afprøvning af allogene donorceller ved hjælp af dette assay, havde respondercellerne fra dyrene intraperitonealt injiceret med gmRPC'er (IP-gruppe) ikke antigen-genkaldelsesresponser, da prøverne ikke viste mere T-celleaktivering ved IFN-plettælling sammenlignet med de falske dyr, der aldrig blev eksponeret til gmRPC'er (sham/sham). Heller ikke dyrene, der blev injiceret intravitrealt med gmRPC'erne, hverken én gang (sham/celle) eller gentagne gange (celle/celle), viste antigen-genkaldelsesresponser. I et tilfælde virkede svar på gentagen gmRPC-dosering mere dæmpede (figur 4B). Tilsammen indikerede disse resultater, at gmRPC'er udviser meget lav antigenicitet. Bemærk, at C57BL/6 splenocytter blev matchet med gmRPC'ernes genetiske baggrund. Uventet øgede de alternative stimulatorceller, gmRPC'er, IFN-punktantallet i alle de eksperimentelle grupper sammenlignet med de negative kontrolgrupper (figur 4A-D). En potentiel forklaring kan være de gmRPC'er, der forårsager en høj baggrund i denne analyse. Det er vigtigt, at der ikke var nogen forskel mellem de ubehandlede, sham-behandlede, enkelt gmRPC-injektion og gentagne gmRPC-injektionsgrupper, hvilket igen indikerede et fravær af antigen-genkaldelsesresponser.

Figur 4. ELISPOT-kvantificering efter gmRPC-transplantation. ELISPOT-assays blev indstillet som følgende grupper: kontrol, responderceller alene (lymfocytter eller splenocytter indeholdende T-celler isoleret fra cervikale lymfeknuder (CLN'er) eller milte (SPL) fra forsøgsdyrene; PMA, responderceller behandlet med phorbol {{1} }myristat 13-acetat (PMA) og Ca-ionophor; B6 SPL, responderceller blandet med splenocytter isoleret fra C57BL/6-dyr; gmRPC'er, de samme responderceller blandet med gmRPC'er. (A), respondercellerne var splenocytterne fra forsøgsdyrene, der blev aflivet på dag 14 efter den anden gmRPCs-injektion. (B) Respondercellerne var lymfocytterne fra CLN'erne fra forsøgsdyrene, som blev aflivet på dag 14 efter den anden gmRPCs-injektion. (C) Respondercellerne var splenocytterne fra forsøgsdyrene, der blev aflivet på dag 29 efter den anden gmRPCs-injektion (D) Respondercellerne var lymfocytterne fra CLN'erne fra forsøgsdyrene, som blev aflivet på dag 29 efter den anden gmRPCs-injektion. Tovejs ANOVA-test blev brugt til at teste signifikans (*) mellem sham/celle og celle/celle-grupperne; p-værdier var: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (signifikant), (C) p < 0,0207 ( signifikant), og (D) p < 0,3355.

3. Diskussion 

Der har været betydelig interesse for stamcelleteknologi som et middel til behandling af retinale degenerative sygdomme, og vores gruppe har udforsket brugen af ​​allogene hRPC'er i RP. For at indsamle data, der adresserer potentielle immunkonsekvenser, når mere end én dosis af allogent humant RPC-produkt administreres via intravitreal injektion, udførte vi det nuværende dyreforsøg med gmRPC'er fra en C57BL/6-baggrund som transplantater og BALB/c-mus som værter. Disse forskellige genetiske baggrunde blev brugt til at modellere sekventiel behandling med allogene hRPC'er og give foreløbige sikkerhedsdata før test på mennesker.

For fuldt ud at evaluere responser modtog værtsdyr ingen immunsuppressiv behandling. Vi sammenlignede immunresponserne genereret af en enkelt gmRPC-injektion med sekventiel bilateral dosering i henhold til den beskrevne injektionsplan. Oftalmiske undersøgelser afslørede ikke betændelse eller andre bemærkelsesværdige forskelle mellem grupperne af dyr, der modtog 1 dosis gmRPC'er eller 2 doser gmRPC'er, hvilket tyder på, at enten modtagerne ikke blev sensibiliseret af de indledende gmRPC-behandlinger, eller sensibiliseringen var subtil. Resultater af immunmærkning afslørede, at alle fem undersøgte immuncelletyper, nemlig T-celler (CD3), B-celler (CD45R), makrofager (Iba-1), neutrofiler (Ly-6G) og naturlige dræberceller ( CD49b), var infiltreret i øjet og målrettet RPC-transplantaterne efter transplantationen. Ikke desto mindre var denne infiltration relativt moderat, og selvom andre celletyper var påviselige, var den overvejende sammensat af Iba-1 positive makrofager. Et meget begrænset antal T-celler, B-celler, neutrofiler og naturlige dræberceller var til stede. Interessant nok var overlevelsen demonstreret af enkelt- og gentagne RPC-transplantater ækvivalent, uden tab af transplantater i begge tilfælde, på trods af tilstedeværelsen af ​​makrofager. Samlet set tyder dette på, at både medfødte og adaptive immunresponser på genetisk forskellige RPC'er var moderate, selvom immunundertrykkelse ikke blev anvendt. Ydermere viste ELISPOT-assayresultater ingen antigen-genkaldelsesresponser i gmRPC-behandlede grupper, hvilket stemmer overens med påstanden om, at T-celler ikke spiller en vigtig rolle i afvisningen af ​​gmRPC-transplantater fra C57BL/6-mus. Igen blev makrofaginfiltration af gmRPC-transplantater observeret, selvom dette ikke var forbundet med signifikant transplantatdestruktion af den type, der er forbundet med klassisk immunafstødning [22-24].

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Tilsammen afslører disse observationer en situation, der klart adskiller sig fra de bredt anerkendte T- og B-cellemedierede allogene transplantatafstødningsmekanismer, der ses i andre væv. Flere faktorer kan bidrage til denne situation. På den ene side er der forestillingen om øjet som et "immun privilegeret" sted, selvom det omfang, i hvilket glaslegemet deler sådanne egenskaber med hornhinden og nethinden, er mindre undersøgt og måske mere omstridt. På den anden side ser RPC'erne selv ud til at udvise nedsat immunogenicitet som allotransplantater sammenlignet med hyppigere undersøgte celletyper. Som vi tidligere har vist, mangler murine RPC'er basislinjeekspression af MHC klasse I og klasse II antigener, selvom disse er inducerbare via cytokinstimulering. Dette fravær af MHC-ekspression kan bidrage til overlevelsen af ​​disse celler efter transplantation. Ikke desto mindre understøtter tilstedeværelsen af ​​immunceller i transplantatet konceptet om, at transplantattolerance i denne indstilling ikke er passiv og skyldes et aktivt immunregulerende fænomen. Her skal det understreges, at den samme slags immuncelleinfiltration allerede var til stede efter enkeltinjektioner og ikke blev forværret ved gentagen dosering, hvilket understreger vores konklusion, at immuncelleinfiltration af transplantaterne, især af makrofager, ikke var resultatet af tidligere værtsensibilisering. Inden for parametrene for dette eksperiment så gentagen dosering ikke ud til at formindske den samlede transplantatlevedygtighed, hvilket var i overensstemmelse med muligheden for vedvarende effekt i terapeutiske sammenhænge. Alternative parametre, såsom forskellige inter-injektionsintervaller, kan enten øge eller mindske immuncelleaktiviteten i et omfang, der ville være relevant for klinisk anvendelse. Hvorvidt de cellulære bestanddele af infiltrater, herunder makrofagovervægt, også vil gælde for mennesker, er uklart. Ydermere er overlevelsen af ​​disse allografter muligvis ikke afhængig af en normal nethinde med en sund blod-nethindebarriere. BALB/c-recipienterne, der bruges her, er albinoer og modtagelige for lysskader [30]. Desuden er vedvarende overlevelse blevet set gentagne gange i tidligere arbejde med forskellige nethindegenerationsmodeller (f.eks. [31]).

Sammenlignet med transplantatoverlevelse udgør levedygtigheden af ​​celler i transplantatet en mere kompleks situation. Der er et kendt tab af CNS progenitorceller, som opstår hurtigt efter transplantation, sandsynligvis på grund af flere faktorer potentielt inklusive pludselig tilbagetrækning af vækstfaktorer. Når først de har sat sig i øjet, smelter de dissocierede celler sammen til kuglelignende aggregater, hvis centre ser ud til at give et suboptimalt mikromiljø for vækst, måske på grund af manglen på vaskularisering og udfordringer med næringsstofdiffusion. Den tilsyneladende tropisme af makrofager for RPC-transplantaterne kunne være et uspecifikt respons på tilstedeværelsen af ​​disse ikke-levedygtige celler i det indre af transplantaterne, hvor makrofagerne fungerer i deres rolle som scavengers af cellulære debris. Alternativt kan fuldt levedygtige RPC'er aktivt tiltrække makrofagerne, f.eks. via ekspression af kemo-attraktive cytokiner, hvorefter værtscellerne sekundært ville støde på resterne fra ikke-levedygtige donorceller. Det er vigtigt, at graden af ​​makrofaginfiltration set i disse særlige indstillinger ikke ser ud til at have negative konsekvenser for transplantatet eller værtens nethinde, i modsætning til responser på cellulære allotransplantater på ikke-immune privilegerede steder [4]. Endelig er det værd at nævne, at resultaterne rapporteret her, selvom de er begrænset til en murin model, kan have konsekvenser for arbejde hos mennesker. I modsætning til musen ved vi, at dyrkede humane RPC'er udtrykker robuste niveauer af MHC klasse I antigener ved baseline; derfor er sammenligningen ganske vist foreløbig. Ikke desto mindre er det interessant at bemærke, at klinisk afprøvning af subretinale hRPC-transplantater af en gruppe i Kina [13], såvel som intravitreal hRPC-transplantation af vores gruppe, efterfølgende har vist vedvarende overlevelse af allotransplantaterne hos ikke-immunsupprimerede patienter med RP (JC). -01, [32], upublicerede data). Dette var også tilfældet efter den sekventielle indsprøjtning af begge øjne (JC-01 Extension, upublicerede data), analogt med det arbejde, der præsenteres her. Desuden blev transplantatoverlevelse set i et opfølgende studie på JC-02 [33], hvor sekventielle gentagne doser blev administreret til det samme øje [34]. Tilsammen indikerer disse resultater, at immunundertrykkelse ikke altid er nødvendig i forbindelse med neural progenitor-transplantation, især for øjet, selvom grænserne for dette fænomen og de underliggende reguleringsmekanismer mangler at blive belyst.

4. Materialer og metoder

4.1. Cellekultur

Tidligere karakteriserede gmRPC'er [31] blev valgt som donorceller til denne allogene undersøgelse. Oprindeligt blev gmRPC'er isoleret fra GFP-transgene C57BL/6-mus, der var genetisk modificeret til at udtrykke et forstærket grønt fluorescerende protein (GFP). Ekspressionen af ​​GFP-protein i gmRPC'erne var af interesse, fordi den tillader visualisering af transplantater efter injektion uden behov for yderligere mærkning. Til den aktuelle undersøgelse blev gmRPC'er dyrket i Advanced DMEM/F12 suppleret med N-2 Supplement (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, USA), Glutamax-1 (1:100, Life Technology) , Carlsbad, CA, USA) og EGF (20 ng/ml, rekombinant, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og inkuberet ved 37 ◦C og 5 % CO2. Cellerne blev holdt i blandet suspension/løst fæstnede kolonier i ikke-coatede vævskulturkolber. Cellerne blev passeret via trypsinisering med TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) fortyndet 1:5 i PBS i et minut og neutraliseret med 10 gange det tilsatte volumen trypsin. Celle-trypsinblandingen blev centrifugeret ved 140 g i 2 minutter ved stuetemperatur, supernatanten blev fjernet, og cellepelleten blev resuspenderet i friske medier før podning til vævskulturkolber ved den ønskede koncentration. Cellekoncentration og levedygtighed blev bestemt via trypanblåt farvning; tællinger blev udført af grevinde (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og hæmocytometer.

Til intravitreale injektioner blev cellepelleten resuspenderet ved 50K celler/µL i BSS PLUS®. Cellekoncentration og levedygtighed blev evalueret før og efter injektioner. Den injicerede dosis var 50,000 celler pr. øje pr. injektion. Dosis og vehikel blev udvalgt baseret på vores tidligere undersøgelser.

4.2. Forsøgsdyr

Formålet med den aktuelle undersøgelse var at undersøge de potentielle allogene immunresponser induceret via gentagen intravitreal injektion af allogene RPC'er. Modtagerdyrene var BALB/c-mus, som adskiller sig genetisk fra de C57BL/6-mus, som gmRPC'erne blev isoleret fra. Brugen af ​​mindst tre dyr pr. behandlet forsøgsgruppe for hvert tidspunkt blev anset for at være nødvendig for at give mulighed for evaluering af statistisk signifikans mellem grupper med hensyn til udfaldsvariable og potentielle dyretab i løbet af forsøgsperioden. I betragtning af de mange yderligere faktorer, der potentielt påvirker det eksperimentelle resultat, såsom mislykket celleinjektionsprocedure eller potentiel nedslidning som følge af dyrekampe, blev der desuden udført injektionsprocedurer på fem dyr pr. gruppe for yderligere at sikre opfyldelse af de minimumsantal, der kræves til statistisk analyse.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Tabel 1 viser de fire grupper af dyr, der er forberedt til hvert af de fire tidspunkter (4, 7, 14 og 28 dage), hvor evalueringer af histopatologi, herunder immunfluorescens, ville blive udført. To yderligere grupper af dyr injiceret med 10ˆ6 gmRPC'er intraperitonealt blev fremstillet som positive kontroller for hvert af de to ELISPOT-evalueringstidspunkter (14 og 28 dage). Tabel 2 opsummerer de evalueringer, der er planlagt for hver gruppe.

Tabel 1. Forsøgsgrupper.

Tabel 2. Evalueringstidspunkter.

4.3. Intravitreal injektion

gmRPC'erne blev administreret via intravitreal injektion. Efter bedøvelse blev Mydriacyl (1% Tropicamid oftalmisk opløsning) og Phenylephrin (2,5% oftalmisk opløsning) påført begge øjne af det dyr, der skulle injiceres. Når tilstrækkelig mydriasis var blevet opnået, blev dyret fastholdt manuelt, og dyrets hoved roteret for at justere den okulære akse af øjet, der skulle injiceres, med optikken i det kirurgiske mikroskop for at visualisere det okulære posteriore segment (dvs. glaslegemet og nethinden) . Øjet blev forsigtigt foreslået manuelt via tryk på øjenlågene, og en 31G nål på en insulinsprøjte blev brugt til forsigtigt at gennembore scleraen ved siden af ​​limbus i den nedre nasale kvadrant. En poleret glasmikropipettespids indeholdende donorceller (eller vehikelkontrol) blev fremført gennem snittet ind i glaslegemet under direkte visualisering. Der blev taget hensyn til ikke at forstyrre integriteten af ​​linsen eller bagerste segmentstrukturer. Cellerne eller vehiklerne alene blev injiceret i et volumen på 1 mikroliter. Efter flere øjeblikke med pause for at tillade ækvilibrering af intraokulært tryk, blev pipettespidsen gradvist fjernet fra øjet, alt under direkte visualisering. Enhver intraokulær blødning blev noteret sammen med placering. Efter injektion blev dyret anbragt i et rent bur foret med en frisk engangspude orienteret med den absorberende side opad/plastiksiden nedad for at komme sig. Restitution blev lettet ved at bruge en varmepude og blev verificeret ved dyrets evne til at bevæge sig. Efter opvågning blev dyret overført til det postoperative bur med ad libitum adgang til vand. Dyrene blev visuelt overvåget på daglig basis postoperativt. Der blev observeret minimale eller ingen tegn relateret til intraokulær injektion.

Efter proceduren blev dyrene observeret for gnidning af det opererede øje, pjusket pels eller vedvarende sløvhed, hvilket alle var grund til øjeblikkelig aflivning. Der blev afsluttet to dyr som følge af sår pådraget i kampe. Alle andre dyr blev afsluttet ved de planlagte endepunkter. Eutanasi blev udført via CO2-inhalation.

4.4. Oftalmisk undersøgelse

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) og respons på lysstimulering. Som kompensation for tabet af blink blev en hypromellose (Gonak) opløsning påført topisk efter behov på begge øjne for at forhindre udtørring af hornhinden. Til billeddannelsesproceduren blev bedøvede dyr anbragt på en varmepude og placeret i brystbenet. Ved afslutningen af ​​proceduren blev der opnået delvis reversering af anæstesien med administration af Atipamezol (0,1-1 mg/kg) ved intraperitoneal injektion.

4.5. Histopatologi

Immunresponser hos dyr, der modtog to sekventielle transplantater (én i hvert øje), blev evalueret via histopatologi af begge øjne på dag 4, dag 7, dag 14 og dag 28 ± 1 efter injektion af det andet øje. Musene, der blev behandlet i overensstemmelse med tabel 1, blev afsluttet baseret på det angivne skema i tabel 2. Dyrene blev aflivet under anvendelse af kuldioxid-inhalation. Hjerteperfusioner blev udført på forsøgsdyrene med 2% paraformaldehyd (PFA) i phosphatpufret saltvand (PBS). Derefter blev alle øjeæblerne opsamlet og fik lov til at trække i 2% PFA/PBS i 48 timer ved 4 ◦C. De fikserede øjeæbler blev behandlet gennem en saccharosegradient (10% saccharose i PBS i 1 time ved stuetemperatur, 20% saccharose i PBS i 1 time ved stuetemperatur og 30% saccharose i PBS ved 4 ◦C natten over), før de blev indlejret i OCT medier til kryosektion. Kryosektioner (10 µm) af øjnene blev farvet med Harrison-hæmatoxylin og eosin (H&E) for at visualisere nethindens mikroanatomi og lokalisere de injicerede donorceller.

For de gmRPC-behandlede grupper blev kryosektioner evalueret under anvendelse af immunfluorescens for GFP+ (donor) celler. Identifikation af de specifikke immuncelletyper til stede i øjnene blev udført ved mærkning med specifikke primære antistoffer for følgende: CD3 (T-lymfocytmarkør) [35], CD45R (B-lymfocytmarkør) [36], Iba-1 (aktiveret makrofag og mikrogliamarkør) [37], Ly-6G (neutrofil markør) [38] og CD49b (naturlig dræbercellemarkør) [39]. Kryosektioner blev vasket i PBS tre gange ved stuetemperatur og blokeret med 0.03% Triton X-100 og 10% normalt gedeserum i PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) for 1 time ved stuetemperatur. Rotte anti-mus CD3 (1:100 fortynding, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), rotte anti-mus CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), kanin anti-mus Iba{{ 26}} (1:400 fortynding, Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), rotte anti-mus Ly-6G (1:100 fortynding, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og rotte anti -mus CD49b (1:100 fortynding, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) blev påført prøver og inkuberet natten over ved 4 grader. Prøver blev vasket igen i PBS 3 gange ved stuetemperatur. Alexa-Fluor-konjugerede sekundære antistoffer (gede-anti-rotte Alexa-Flour-568 og gede-anti-kanin Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) blev påført prøver i 1 time ved stuetemperatur. Alle prøver blev derefter vasket i PBS yderligere tre gange ved stuetemperatur. Dækglas blev monteret under anvendelse af DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA), og objektglassene fik lov til at tørre natten over ved stuetemperatur.

4.6. ELISPOT og MLR assays

RPC-specifikke hukommelses-T-celler blev overvåget 2 og 4 uger efter den første graftplacering via en enzym-linked immunosorbent spot (ELISPOT) assay. Forsøgsgrupperne blev sat op som vist i tabel 1 og 2 for hvert tidspunkt. ELISPOT-assay fanger udskilte proteiner på en specifik antistof-coated mikroplade og kan bruges til at bestemme hukommelses-T-celleaktivering ved at detektere T-celle-IFN-sekretion. Den eksperimentelle udlæsning er antallet af IFN-pletterne på mikropladen. Antallet af tilstedeværende IFN-pletter er indikativt for antallet af T-celler, der aktiveres. Hyppigheden af ​​alloreaktive T-celler blev vurderet ved at udføre en 48 timers blandet leukocytreaktion (MLR) på 96-brønd Multiscreen-IP plader (Millipore, Burlington, MA, USA). Responderceller var lymfocytter/splenocytter indeholdende T-celler oprenset fra cervikale lymfeknuder (CLN'er) og milte fra forsøgsdyrene, og stimulatorceller var gmRPC'erne oprindeligt afledt af C57BL/6-mus. ELISPOT-assayene blev udført baseret på standardprotokol. 96-brønd Multiscreen-IP plader blev forvædet med 15 µL 35 % ethanol pr. brønd under sterile forhold. Pladerne blev vasket med steril PBS tre gange, før 100 µL af IFN-indfangningsantistoffet (klon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, USA) fortyndet i PBS (2 µg/ml) blev påført pladerne. Pladerne blev inkuberet natten over ved 4 grader, før MLR-assayene blev båret på pladerne. De indfangningsantistofbelagte plader blev vasket tre gange med PBS og derefter blokeret med RPMI1640 i 2 timer ved 37 ◦C.

Hver af assaypladerne inkluderede følgende kontroller: brønde, der ikke indeholdt celler, brønde, der indeholdt cellerne uden stimulering, og brønde, der indeholdt cellerne med behandlinger af phorbol {{0}}myristat 13-acetat (PMA) og Ca-ionofor som positive kontroller. PMA-behandling tjener som en positiv kontrol ved at efterligne den anden budbringer, DAG, for at aktivere T-cellereceptorvejen og igen forårsage T-celleaktivering, hvor Ca-ionofor letter indtrængen af ​​calciumioner i celler. Pladerne blev inkuberet i 36 timer ved 37 ◦C før farvereaktionen. Pladerne blev vasket med PBS indeholdende {{10}}.01 % Tween 20 seks gange og derefter 100 µL detektionsantistof (klon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, USA), fortyndet i PBS (0,5 µg/ml) blev påført hver brønd. Pladerne blev inkuberet ved 37 ◦C i yderligere 2 timer. Pladerne blev igen vasket med 0,01% Tween 20 i PBS. 100 µL Streptavidin-AP (1:1000 fortynding, Invitrogen) pr. brønd blev påført, og pladerne blev inkuberet i 45 minutter ved stuetemperatur. Alle plader blev vasket tre gange igen med 0,01 % Tween 20 i PBS og PBS alene i yderligere tre gange. Til sidst blev 100 µL BCIP/NBT (Sigma Aldrich, München, Tyskland) tilsat til hver brønd til farvning. Alle plader blev vasket grundigt med postevand og tørret før dataanalyse.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

5. Konklusioner

Denne undersøgelse viser, at sekventielle binokulære transplantater af allogene RPC'er til glaslegemet ikke fremkalder klassisk immunafstødning hos musen. Selvom det erkendes, at disse allogene histologiske undersøgelser ikke kunne udføres med humant RPC klinisk produkt, ser dataene ud til at være i overensstemmelse med resultaterne af en klinisk sikkerhedsundersøgelse (jCyte, JC-01E, upublicerede data), hvor patienter med retinitis pigmentosa modtog ikke-samtidige bilaterale injektioner uden immunsuppressive behandlinger. Selvom det er svært at sammenligne de to undersøgelser direkte, er det bemærkelsesværdigt, at de overordnede resultater af begge viste lighed med hensyn til allotransplantatoverlevelse.

Referencer

1. Hori, J.; Ng, TF; Shatos, M.; Klassen, H.; Strelein, JW; Unge MJ neurale progenitorceller mangler immunogenicitet og modstår ødelæggelse som allotransplantater. Stamceller 2003, 21, 405-416. [CrossRef] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Young, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Neurale prækursorer isoleret fra den udviklende kattehjerne viser retinal integration efter transplantation til nethinden hos den dystrofiske kat. Dyrlæge. Oftalmol. 2007, 10, 245-253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Er den immunologiske respons en flaskehals for celleterapi ved neurodegenerative sygdomme? Foran. Cell Neurosci. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Immunologiske overvejelser og udfordringer for regenerative cellulære terapier. Commun. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Immunreaktioner på retinal genterapi ved brug af ingen associerede virale vektorer - Implikationer for behandlingssucces og sikkerhed. Prog. Retin. Øjen Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Singh, MS; Park, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Retinal stamcelletransplantation: Balancering af sikkerhed og potentiale. Prog. Retin. Øjen Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Karakterisering af humane inducerede pluripotente stamcelle-afledte retinale pigmentepitelceller med henblik på klinisk anvendelse. Stamcelle rep. 2014, 2, 205-218. [CrossRef]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. Inhibering af T-celleaktivering af retinale pigmentepitelceller afledt af inducerede pluripotente stamceller. Undersøg. Oftalmol. Vis. Sci. 2015, 56, 1051-1062. [CrossRef]

9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, I.; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. Allogen iPSC-afledt RPE-celletransplantationsfejl efter transplantation i det subretinale rum i ikke-menneskelige primater. Undersøg. Oftalmol. Vis. Sci. 2018, 59, 1374-1383. [CrossRef]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. Immunologiske aspekter af RPE-celletransplantation. Prog. Retin. Øjen Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Nair, DSR; Thomas, BB Stamcellebaserede behandlingsstrategier for degenerative sygdomme i nethinden. Curr. Stamcelle Res. Ther. 2022, 17, 214-225. [CrossRef] [PubMed]

12. Martinez Velazquez, LA; Ballios, BG Den næste generation af molekylær og cellulær terapi for arvelig nethindesygdom. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Langsigtet sikkerhed ved human retinal progenitorcelletransplantation hos retinitis pigmentosa-patienter. Stamcelle Res. Ther. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Stam/stamcelle-baseret transplantation for retinal degeneration: En gennemgang af kliniske forsøg. Celledød Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. tysk, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Retina stamceller, håb og forhindringer. World J. Stamceller 2021, 13, 1446-1479. [CrossRef]

16. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Potentielle terapeutiske strategier for fotoreceptordegeneration: Vejen til at genoprette synet. J. Transl. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Young, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Effektivitet og sikkerhed af humane retinale progenitorceller. Overs. Vis. Sci. Teknol. 2016, 5, 6. [CrossRef]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Immunologisk homeostase af øjet. Prog. Retin. Øjen Res. 2013, 33, 10-27. [CrossRef]

19. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; et al. Lav immunogenicitet og immunsuppressive egenskaber af humane ESC- og iPSC-afledte nethinder. Stamcelle rep. 2021, 16, 851–867. [CrossRef]

20. Klassen, H.; Schwartz, MR; Bailey, AH; Unge MJ overflademarkører udtrykt af multipotente humane og muse neurale progenitorceller inkluderer tetraspaniner og ikke-proteinepitoper. Neurosci. Lett. 2001, 312, 180-182. [CrossRef]

21. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II; Young, MJ; Schwartz, PH Isolering af retinale progenitorceller fra post-mortem humant væv og sammenligning med autologe hjerneprogenitorer. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334-343. [CrossRef]

22. Ingulli, E. Mekanisme af cellulær afstødning ved transplantation. Pediatr. Nephrol. 2010, 25, 61-74. [CrossRef]

23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ T-cellers rolle i transplantatafstødning og transplantationstolerance. Ekspert Rev. Clin. Immunol. 2010, 6, 155-169. [CrossRef] [PubMed]

24. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Fremskridt inden for diagnostik til transplantationsafstødning. Sagkyndig pastor Mol. Diagn. 2016, 16, 1121-1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Young, MJ; Gage, FH; Berman, MA De immunologiske egenskaber af voksne hippocampale progenitorceller. Vis. Res. 2003, 43, 947-956. [CrossRef] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; Plaisteret, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; Lane, TE MHC mismatch resulterer i neurale progenitorcelleafstødning efter rygmarvstransplantation i en model af viral-induceret demyelinisering. Stamceller 2012, 30, 2584-2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. First-in-Human fase I/IIa, åbent, prospektivt studie af sikkerheden og tolerabiliteten af ​​subretinalt transplanterede humane retinale stamceller (hRPC) hos patienter med Retinitis Pigmentosa (RP). Klinisk forsøg # NCT02464436. Tilgængelig online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (tilgået den 27. februar 2023).

28. Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Girman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. En efterfølgende human neural progenitor-transplantation i den degenererede nethinde kompromitterer ikke initial graftoverlevelse eller terapeutisk effektivitet. Overs. Vis. Sci. Teknol. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29. Jones, MK; Lu, B.; Girman, S.; Wang, S. Cellebaserede terapeutiske strategier til udskiftning og konservering i retinale degenerative sygdomme. Prog. Retin. Øjen Res. 2017, 58, 1-27. [CrossRef] [PubMed]

30. Bell, BA; Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Shadrach, K.; Hollyfield, JG BALB/c-musen: Effekt af standard vivarium-belysning på retinal patologi under aldring. Exp. Øjen Res. 2015, 135, 192-205. [CrossRef]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, I.; Shatos, M.; Coffey, P.; Unge, MJ Multipotente retinale progenitorer udtrykker udviklingsmarkører, differentierer til retinale neuroner og bevarer lysmedieret adfærd. Undersøg. Oftalmol. Vis. Sci. 2004, 45, 4167-4173. [CrossRef]

32. jCyte, Inc. Sikkerhed ved en enkelt, intravitreal injektion af humane retinale stamceller (jCell) i Retinitis Pigmentosa. Klinisk forsøg # NCT02320812. Tilgængelig online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (tilgået den 24. februar 2023).

33. jCyte, Inc. Sikkerhed og effektivitet af intravitreal injektion af humane retinale stamceller hos voksne med Retinitis Pigmentosa. Klinisk forsøg # NCT03073733. Tilgængelig online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (tilgået den 24. februar 2023).

34. jCyte, Inc. Sikkerhed ved gentagen intravitreal injektion af humane retinale stamceller (celle) hos voksne forsøgspersoner med Retinitis Pigmentosa. Klinisk forsøg # NCT04604899. Tilgængelig online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (tilgået den 24. februar 2023).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. Immunhistokemisk klassificering af T-celle- og NK-celle-neoplasmer. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

36. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gammon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Omprogrammering af det lokale lymfeknudemikromiljø fremmer tolerance, der er systemisk og antigenspecifik. Cell Rep. 2016, 16, 2940-2952. [CrossRef] [PubMed]

37. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Oversigt over generelle og diskriminerende markører for differentielle mikroglia-fænotyper. Foran. Cell Neurosci. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Neutrofile ekstracellulære fælder deltager i udviklingen af ​​cancerassocieret trombose hos patienter med mavekræft. World J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132-3149. [CrossRef]

39. Kee, BL Udvikling af naturlige dræberceller og ILC1. Encycl. Immunbiol. 2016, 1, 140-148.