Undersøgelse af salt- og alkalitolerancen af ​​en endofytisk bakterie fra Cistanche Deserticola (Pseudalkalibacillus Sp. A8)

 

Abstrakt

Objektiv:At isolere endofytiske bakterier fraCistanche deserticolaog undersøge de potentielle mekanismer, der ligger til grund for salt-alkali-tolerancen afPseudalkalibacillussp. A8.
Metoder:Endofytiske bakterier blev isoleret under anvendelse af fortyndingspletteringsmetoden. Klassificeringen af ​​stamme A8 blev bestemt ved morfologiske træk og 16S rRNA-gensekventering. Helgenomsekventering og metabolomiske analyser blev derefter udført.
Resultater:Halvtreds endofytiske bakteriestammer blev isoleret fra friskeCistanche deserticolaprøver, der dækker 4 phyla, 8 klasser og 35 slægter. Blandt dem er stamme A8 den førstePseudalkalibacillusarter isoleret fra planter, som udviser exceptionel salt-alkali-tolerance. Det var i stand til at vokse i pH-områder fra 6,0 til 13,0 og NaCl-koncentrationer på op til 17%. Genom annotering afslørede 10 gener forbundet med salt-alkali-resistens. Metabolomisk analyse under betingelser med høj saltholdighed og høj pH identificerede 186 differentielle metabolitter beriget i syv funktionelle veje relateret til salt-alkali-stresstilpasning.
Konklusion:Denne undersøgelse giver værdifulde mikrobielle ressourcer til at øge afgrødesalt-alkali-tolerance og tilbyder teoretisk støtte til saltvand-alkali-jordforbedring gennem mikrobielle midler. Det lægger også grunden til at forstå de molekylære mekanismer af salt-alkali-tolerante bakterier.

Nøgleord: Cistanche deserticola; endofytiske bakterier; salt-alkali-tolerance; sekventering af hele genom; UPLC–MS/MS

 

 

 

Cistanche deserticol blomst

Indledning

Jordens saltning og alkalisering er store globale udfordringer, der bidrager væsentligt til jordforringelse og ørkendannelse. Det anslås, at cirka 20 % af verdens agerjord er påvirket af saltholdighed i varierende grad, og Kina alene besidder 9,9×10⁷ hektar saltvand-alkali-jord - den største i verden. Sådanne jordarter udviser typisk dårlig permeabilitet, lav frugtbarhed og hård tekstur, hvilket i alvorlig grad forringer afgrødevækst og -udbytte. Derfor er udvikling af effektive strategier til at udnytte og forbedre saltholdige-alkalijorde fortsat et kritisk spørgsmål.

Nylige undersøgelser tyder på, at mikrobielle podemidler, især salt-alkali-tolerante stammer, kan øge afgrødetolerance og forbedre jordens egenskaber på en omkostningseffektiv og miljøvenlig måde. Endofytiske bakterier - dem, der bor i plantevæv uden at forårsage sygdom, deler økologiske og fysiologiske egenskaber med deres værtsplanter.Cistanche deserticola, en ørkenboende parasitplante kendt for sin ekstreme salt-alkali-resistens, er en lovende kilde til isolering af stresstolerante endofytter.

Denne undersøgelse har til formål at:

Isoler endofytiske bakterier fraCistanche deserticola;

Screen for salt-alkali-tolerante stammer;

Udforsk stress-modstandsmekanismerne for den valgte stammePseudalkalibacillussp. A8 gennem hel-genom og metabolomiske analyser.

Cistanche deserticol blomst

Materialer og metoder

1.1 Materialer

Planteprøve: Cistanche deserticolaindsamlet i marts 2023 fra Xiquan Town, Jingtaixian, Baiyin, Gansu-provinsen, Kina. Identificeret af prof. Guo Yehong, Gansu Agricultural University.

Medier:TSB flydende medium; størknet under anvendelse af 20 g/l agar.

Reagenser og instrumenter:Analytisk kvalitet NaClO, KH2PO4, K2HPO4, TAE buffer; Agilent QTOF 1290–6542 massespektrometer, R-1001V rotationsfordamper, Neofuge 15R centrifuge, SureCycler 8800 gradient PCR.

1.2 Isolering af endofytiske bakterier

FriskCistanchevæv blev overfladesteriliseret og homogeniseret. Seriefortyndinger blev udpladet på R2A, TSB, ISP-2 og 2216E medier. Kolonier blev isoleret og oprenset gennem tre subkulturer og derefter opbevaret i 20% glycerol ved -80 grader.

1.3 16S rRNA-genidentifikation

Genomisk DNA blev ekstraheret og amplificeret under anvendelse af universelle primere 27F/1492R. PCR-produkter blev sekventeret og analyseret ved hjælp af EzBioCloud-databasen.

 

Cistanche base

Supportive Service Of Wecistanche-For flere detaljer om samarbejde
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

1.4 Fænotypisk og fysiologisk karakterisering

SEM:Cellemorfologi observeret efter guldbelægning.

NaCl-tolerance:Vækst vurderet til 0-20% NaCl.

pH-tolerance:Vækst målt ved pH 4–13.

Temperaturområde:Vækst testet ved 4-50 grader.

1.5 Helgenomsekventering

Stamme A8 blev sekventeret ved anvendelse af PacBio-teknologi. Genomsamling og annotering blev udført mod seks store databaser (NR, Swiss-Prot, Pfam, EggNOG, GO, KEGG). Gener relateret til salt-alkali-tolerance blev screenet.

1.6 UPLC-MS/MS-analyse

Prøver blev dyrket under tre betingelser:

A: pH 7,2, NaCl 0,5 %

B: pH 7,2, NaCl 14 %

C: pH 13,0, NaCl 0,5 %

Supernatanter blev tørret, opløst i methanol og analyseret under anvendelse af UPLC-MS/MS (ZORBAX Eclipse Plus C18, positiv ion-tilstand).

Resultater og analyse

2.1 Endofytisolering

50 stammer blev isoleret fraCistanche deserticola, tilhørende 4 phyla og 35 slægter.

2.2 Identifikation af stamme A8

16S rRNA-sekvens viste 99,30% lighed medPseudalkalibacillus salsuginis. Fylogenetisk analyse bekræftede det som medlem afPseudalkalibacillus. Morfologisk var kolonierne glatte, gulbrune, stavformede (1-6 µm) med let fuzz under SEM.

Vækstområde:20-45 grader (optimalt: 30 grader)

pH-område:6-13 (optimalt: 9,0)

Saltområde:0–17 % NaCl (optimalt: 0–5 %)

2.3 Genomanalyse

Genomlængde: 6,022,064 bp

GC-indhold: 40.99%

Proteinkodende gener: 5,825 (82.5%)

tRNA/rRNA:76 tRNA'er, 24 rRNA'er

ANI-værdier:Alle<95%, indicating a potential novel species.

COG-anmærkning:4.683 gener (80,39 %)

Aminosyretransport/metabolisme (556), kulhydratmetabolisme (501), transkription (464), lipidmetabolisme (440), coenzymmetabolisme (298), forsvarsmekanismer (100)

Salt-alkali-tolerancegener identificeret:

Glycin/betain transporter

Natriumsymportør

Antiportører

F0F1 ATP-syntase

2.4 Metabolomisk analyse

Metabolitidentifikation:986 totale metabolitter påvist

OPLS-DA Analyse:Klar adskillelse mellem grupper; R²X > 0,5, R²Y=1, Q² > 0,85,P< 0,005

Differentielle metabolitter:

186 i alt:

Gruppe B: 96 (13 opregulerede, 83 nedregulerede)

Gruppe C: 132 (41 opregulerede, 91 nedregulerede)

49 opreguleret i både B & C

196 unikt udtrykte metabolitter i B & C

246 samlede opregulerede eller unikke metabolitter

Pathway Enrichment (KEGG):

Sesquiterpenoid og triterpenoid biosyntese

Purin metabolisme

Lysinbiosyntese og nedbrydning

Pantothenat og CoA biosyntese

Arginin og prolin metabolisme

Steroid biosyntese

Disse resultater tyder på, at stamme A8 tilpasser sig salt-alkali-stress gennem både genetisk og metabolisk regulering.

---

Konklusion

Denne undersøgelse isolerede og identificerede med succesPseudalkalibacillussp. A8 fraCistanche deserticola, en potentiel ny art, der udviser stærk salt-alkali-resistens. Gennem hele genomet og metabolomiske analyser er flere gener og metaboliske veje blevet identificeret som bidragydere til dets stresstilpasning. Disse resultater giver et teoretisk grundlag for udvikling af mikrobielle midler til at forbedre afgrødetolerance og genvinde saltholdig-alkalijord.

 

Referencer

Wang Y., Wang Y., Zhang Q., et al.Saltvands-alkalisk jordegenskab forbedret af de synergistiske virkninger afPriestia aryabhattaiJL-5,Staphylococcus pseudoxylosusXW-4,Leymus chinensisog jordmikrobiota. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(9): 7737.

Chen Wentao, Guo Lizhuo, Shan Bin, et al.Virkninger af jordændringer på vækst af havre og jordbunds fysiske egenskaber i saltvands-alkaliland. Journal of Gansu Agricultural University, 2024, 59(5): 136–144. (på kinesisk)

Lu Yuxin, Yan Hong, Bai Yani, et al.Isolerings- og salt-alkali-tolerancemekanisme afRhizobiumStamme BFL-3. Journal of Agricultural Biotechnology, 2023, 31(7): 1501–1512. (på kinesisk)

Yu Jiang, Wang Xinzhen, Wang Chun, et al.Anvendelse af en salt-alkali-tolerantCitrobacterStamme i fremme af plantevækst og udvinding af dens salt-alkali-tolerancegener. Mikrobiologi Kina, 2024, 51(3): 864–879. (på kinesisk)

Wani ZA, Ashraf N., Mohiuddin T., et al.Plante-endofyt-symbiose: et økologisk perspektiv. Anvendt mikrobiologi og bioteknologi, 2015, 99(7): 2955–2965.

Venieraki A., Dimou M., Katinakis P.Endofytiske svampe, der opholder sig i lægeplanter, har evnen til at producere de samme eller lignende farmakologisk aktive sekundære metabolitter som deres værter. Hellenic Plant Protection Journal, 2017, 10: 51–66.

Den kinesiske farmakopékommission.Farmakopé af Folkerepublikken Kina, bind I. Beijing: China Medical Science Press, 2020: 79–80.(på kinesisk)

Fu Kejian, Cui Yonghe, Huang Zhihua, et al.Screening, identifikation og antagonistisk mekanisme af biokontrolbakterier mod tobakspatogen af ​​sort skaft. Journal of Southern Agriculture, 2023, 54(8): 2245–2256. (på kinesisk)

Hu Chunhui, Xu Qing, Sun Xuan, et al.Fremstillingsmetoder for flere typiske biologiske prøver til scanningselektronmikroskopi. Hubei landbrugsvidenskab, 2016, 55(20): 5389–5392+5402. (på kinesisk)