Optimering og søvnforbedrende effekter af en Congrong-Zaoren-Wumei-drikekstrakt i mus
Jan 30, 2026
2 Resultater og analyse
2.1 Optimering af forberedelsesprocessen for Congrong-Zaoren-Wumei-drikkeekstrakten
Fra figur 1 opnåede den etablerede HPLC-metode effektiv adskillelse mellem de kromatografiske toppe af de fire referenceforbindelser - citronsyre, echinacosid, verbascosid og spinosin - og tilstødende toppe. Retentionstiderne var henholdsvis tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min og tR4=25.9 min. Lineære regressioner af topareal versus analytkoncentration gav lineære intervaller på 12.12-2016, 0.14-110, 0.18-112.50 og 2.44-18.30 µg·mL-1, med R2-værdier på 0.9918, 1, indicitet, 1, dic. Under disse betingelser var detektionsgrænser (LOD) for citronsyre, echinacosid, verbascosid og spinosin 3,636, 0,045144, 0,058 og 0,7564 µg·mL-1, og grænserne for kvantificering (LOQ) var 12,14, 0,14, 0,14, 0. µg·mL-1, henholdsvis. Præcisionstests viste RSD'er på 0,10%, 0,07%, 0,06% og 0,33% for de fire analytter, hvilket indikerer god instrumentpræcision. Stabiliteten over 0-12 timer var god med RSD'er på 0,78 %, 0,16 %, 0,20 % og 1,46 %. Repeterbarhedstests producerede RSD'er på 0,51 %, 0,42 %, 0,37 % og 0,38 % for analytterne, hvilket viser god repeterbarhed. Spike-recovery-tests viste gennemsnitlige restitutioner på 97,42%, 103,32%, 98,90% og 99,71%, med RSD'er på henholdsvis 0,70%, 0,52%, 1,05% og 0,63%. Derfor er HPLC-metoden, der er etableret til samtidig bestemmelse af disse fire hovedkomponenter, nøjagtig og pålidelig, velegnet til efterfølgende procesoptimeringsassays.
Fig. 1 HPLC-kromatogrammer af referencen og opløsningerne ved 210 nm bølgelængde (A) og 330 nm bølgelængde (B og C)
I den metodiske evaluering af rå polysaccharider var LOD 0,098 µg·mL-1. OD-værdierne for opløsningsmiddelblindprøve og blindprøvekontrol ved 485 nm viste ingen tydelige ændringer, hvilket indikerer god specificitet. Den lineære regression af OD versus koncentration gav R2=0.9997, hvilket indikerer fremragende linearitet. RSD for seks på hinanden følgende målinger var 0,47%, hvilket viser god præcision. RSD for polysaccharidindhold inden for 12 timer var 0,44 %, hvilket indikerer god stabilitet. RSD på tværs af seks uafhængigt forberedte prøver var 2,51 %, hvilket indikerer god repeterbarhed. Derfor er metoden velegnet til at kvantificere rå polysaccharider under procesoptimering.
Cistanche Roucongrong fordele i Ancient Book
Supportive Service Of Wecistanche-For flere detaljer om samarbejde
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
2.1.2 Resultater af enkeltfaktorundersøgelser
Ved at bruge den etablerede HPLC-metode kombineret med polysaccharid-assayet og ved at tage indholdet af citronsyre, echinacosid, verbascosid, spinosin og polysaccharider i ekstraktet som evalueringsindekser, blev enkeltfaktorundersøgelser udført på ekstraktionstemperatur, faststof-væske-forhold og ekstraktionstid for at understøtte det ortogonale design.
Ved ekstraktionstemperaturer på 60, 80 og 100 grader steg indholdet af citronsyre, echinacosid, verbascosid, spinosin og rå polysaccharider i ekstrakterne med temperaturen.
Ved forhold mellem faststof og væske på 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 og 1:12 (g·mL-1) steg indholdet af citronsyre, spinosin og rå polysaccharider med højere forhold; echinacoside og verbascoside toppede ved 1:10 (g·mL–1) og faldt ved 1:12 (g·mL–1). Imidlertid steg det samlede indhold af alle markørkomponenter med forholdet mellem faststof og væske.
Ved ekstraktionstider på 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 og 3,0 timer varierede indholdet af individuelle analytter forskelligt, men det samlede indhold af markørkomponenter steg med tiden.
Detaljerede data findes i det supplerende materiale. I betragtning af industriel praktisk (undgåelse af alt for lang ekstraktion), blev faktorer og niveauer for det ortogonale design sat som i tabel 2, og det ortogonale skema er vist i tabel 3.
Tabel 2. Faktorniveauer af ortogonalt eksperimentelt design for ekstraktionsmetoden for Congrong-Zaoren-Wumei-drik
Faktorer:
A: Ekstraktionstemperatur (grad)
B: Faststof-væske forhold (g ml-1)
C: Ekstraktionstid (h)
| Niveau | A: Temperatur (grad) | B: Forhold (g mL–1) | C: Tid (h) |
|---|---|---|---|
| 1 | 60 | 1:7 | 1.0 |
| 2 | 80 | 1:10 | 1.5 |
| 3 | 100 | 1:12 | 2.0 |
2.1.3 Ortogonale designresultater
Ekstraktion blev udført pr. det ortogonale array. Indholdet af citronsyre, echinacosid, verbascosid, spinosin og rå polysaccharider er vist i tabel 3. Baseret på interval (R) analyse var rækkefølgen af faktorpåvirkning på det totale markørindhold A > B > C, dvs. ekstraktionstemperatur > faststof-væske forhold > ekstraktionstid. Sammenligning af k-værdier foreslog den optimale kombination A3B3C3: ekstraktionstemperatur 100 grader, forhold mellem faststof og væske 1:12 (g·mL–1) og ekstraktionstid 2 timer. ANOVA (tabel 4) indikerede, at ekstraktionstemperaturen havde en signifikant effekt på det samlede markørindhold, mens virkningerne af faststof-væske-forholdet og tiden ikke var signifikante.
Tabel 3. Ortogonalt eksperimentelt design og målt komponentindhold i Congrong-Zaoren-Wumei-drik (mg g-1)
Faktorer: A (temperatur), B (forhold mellem faststof og væske), C (tid)
| Retssag nr. | A | B | C | Samlede markører | Citronsyre | Spinosin | Echinacoside | Verbascoside | Rå polysaccharider |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 | 3 | 1 | 116.71 | 75.55 | 4.08 | 1.62 | 0.48 | 34.98 |
| 2 | 1 | 2 | 3 | 70.98 | 59.01 | 2.60 | 0.80 | 0.36 | 8.22 |
| 3 | 3 | 1 | 3 | 117.86 | 73.87 | 3.53 | 1.21 | 0.45 | 38.80 |
| 4 | 1 | 3 | 2 | 72.55 | 59.73 | 2.37 | 0.94 | 0.41 | 9.99 |
| 5 | 2 | 3 | 3 | 83.64 | 63.20 | 2.15 | 1.08 | 0.44 | 16.77 |
| 6 | 2 | 1 | 2 | 117.76 | 74.09 | 2.58 | 1.37 | 0.48 | 39.24 |
| 7 | 2 | 2 | 1 | 110.74 | 70.96 | 2.36 | 1.07 | 0.43 | 35.92 |
| 8 | 2 | 1 | 1 | 69.63 | 58.37 | 1.74 | 0.54 | 0.34 | 8.65 |
| 9 | 1 | 1 | 3 | 69.66 | 58.14 | 2.48 | 0.86 | 0.36 | 7.83 |
K-statistikker (sum af totaler pr. faktorniveau)
K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49
K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65
K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83
Område R: A=46.38, B=5.25, C=4.19
2.1.4 Validering og opskalering
Procesvalidering under de optimale forhold gav et gennemsnitligt totalt indhold af markørkomponenter på 119,74 mg·g-1 med RSD 0,57%, hvilket indikerer stabilitet og pålidelighed. Opskaleringsforsøget under de samme betingelser gav et gennemsnitligt totalt markørindhold på 120,89 mg·g-1 med RSD 0,95%, i overensstemmelse med præ-skalaresultaterne, hvilket yderligere bekræfter robustheden. Prøver fra de tre opskaleringsbatcher blev brugt til efterfølgende søvnrelaterede undersøgelser; deres gennemsnitlige indhold var: citronsyre 77,73 mg·g–1, echinacosid 2,69 mg·g–1, verbascosid 1,03 mg·g–1, spinosin 0,50 mg·g–1 og polysaccharider 38,93 mg·g–1.
Tabel 4. Variansanalyse fra ortogonale forsøg
| Faktor | Summen af kvadrater | df | Gennemsnitlig firkant | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| Ekstraktionstemperatur | 4010.50 | 2 | 2005.25 | 116.26 | 0.01 |
| Faststof-væske forhold | 49.79 | 2 | 24.90 | 1.44 | 0.41 |
| Udvindingstid | 47.37 | 2 | 23.68 | 1.37 | 0.42 |
Liu et al. [16] optimeret vandig ekstraktion af phenylethanoidglycosider fra Cistanche tubulosa og identificerede 1:15 (g·mL-1), 80 grader og 2 timer som optimale; phenylethanoid glycosid indhold faldt over 90 grader. I denne undersøgelse toppede indholdet af echinacoside og verbascoside ved et 1:10 (g·mL–1) forhold og faldt ved 1:12 (g·mL–1), men steg dog med temperaturer på 60, 80 og 100 grader. Denne uoverensstemmelse kan relateres til brugen af Cistanche deserticola (ørken Cistanche) i vores drik og matrixeffekter fra sameksisterende Suanzaoren og Wumei, som kan påvirke opløsningen af phenylethanoid glycosid.
Tabel 5. Effekt af Congrong-Zaoren-Wumei-drikekstrakt på direkte søvn hos mus (n=12)
| Gruppe | Totalt antal dyr | Sovende dyr | Søvnhastighed (%) |
|---|---|---|---|
| Tom | 12 | 0 | 0 |
| Estazolam | 12 | 0 | 0 |
| Lav-dosis ekstrakt | 12 | 0 | 0 |
| Mellemdosis ekstrakt | 12 | 0 | 0 |
| Højdosis ekstrakt | 12 | 0 | 0 |
Sammenfattende optimerede vi ved hjælp af HPLC og phenol-svovlsyre-metoden ekstraktionsprocessen baseret på indholdet af citronsyre, echinacosid, verbascoside, spinosin og polysaccharider. Enkeltfaktor- og ortogonale eksperimenter efterfulgt af validering etablerede de optimale betingelser: 100 grader, 1:12 (g·mL-1) forhold mellem faststof og væske og 2 timers ekstraktionstid, hvilket giver en reference for fremtidig industriel udvikling.
Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85.000 acres), frisk-cistanche-lagringskapacitet (~15.000 tons) og GMP-certificerede fremstillingsværksteder (100.000-klasse renrum) udstyret med avanceret ultrafiltrering og nanofiltrering til oprensning og koncentration, plus et 10.000-klasses mikrobiologisk laboratorium. Certificeringer omfatter China SC, HACCP og økologiske programmer (f.eks. NOP). Denne infrastruktur understøtter direkte oversættelse af den optimerede vandige ekstraktion og markørstandardiseringsprotokol til storskala, eksportkompatibel produktion af funktionelle drikkevarer og ekstrakter.
Tabel 6. Effekt af ekstraktet på den hypnotiske virkning af subtærskelnatriumpentobarbital i mus (x̄ ± s, n=12)
| Gruppe | Totalt antal dyr | Sovende dyr | Søvnhastighed (%) |
|---|---|---|---|
| Tom | 12 | 1 | 8.33 |
| Estazolam | 12 | 10 | 83.33** |
| Lav-dosis ekstrakt | 12 | 4 | 33.33 |
| Mellemdosis ekstrakt | 12 | 5 | 41.67 |
| Højdosis ekstrakt | 12 | 6 | 50.00* |
Bemærk: Sammenlignet med blank gruppe, * P < 0,05; ** P < 0,001.
2.2 Effekter af ekstrakten på museadfærd og søvn
2.2.1 Direkte søvn
Som vist i tabel 5 udviste mus i estazolam-gruppen og i lav-/medium-/højdosisekstraktgrupperne efter 30 dages kontinuerlig administration ikke tydelig søvn inden for 20 minutter efter den endelige dosis uden signifikante forskelle i forhold til den tomme gruppe. Dette indikerer ingen direkte søvnfremkaldende effekt efter 30 dages ekstraktadministration.
2.2.2 Adfærdsmæssige effekter
En åben felttest vurderede beroligende virkninger. Virkningerne på den samlede tilbagelagte distance og centerindgange er vist i figur 2. Sammenlignet med den blanke gruppe øgede estazolam den samlede afstand og centerindtastninger med henholdsvis 14,48 % og 31,07 % uden statistisk signifikans. Lavdosisekstraktet øgede den totale afstand signifikant med 25,10 % (P < 0,05) og øgede ikke-signifikant centerindgange med 50,93 %. Den mellemstore dosis øgede den totale afstands- og centerindgang signifikant med 27,09 % og 72,33 % (P < 0,05). Den høje dosis øgede den samlede afstands- og centerindgang med henholdsvis 15,60 % og 40,78 % uden betydning. I forhold til estazolam øgede de lave/medium/høje doser den samlede afstand med 1,73, 1,87 og 1,07 gange, og centerindgange med henholdsvis 1,64, 2,33 og 1,31 gange, ingen signifikant. Disse resultater indikerer, at ekstraktet reducerede angstlignende adfærd i det fri efter 30 dage, hvilket tyder på en beroligende effekt.
2.2.3 Undertærskelnatriumpentobarbital-induceret søvn
Som vist i tabel 6, sammenlignet med den tomme gruppe, øgede estazolam og alle tre ekstraktdoser søvnhastigheden under en undertærskeldosis af natriumpentobarbital. Estazolam øgede antallet af sovende dyr med 9 gange i forhold til blank (P < 0,001). Lav-, medium- og højdosisekstraktgrupper øgede sovende dyr med henholdsvis 3-, 4- og 5-fold; kun den høje dosis nåede statistisk signifikans (P < 0,05). Sammenlignet med estazolam viste ingen af ekstraktdoserne en stærkere søvnfremkaldende effekt. Således kan ekstraktet til en vis grad forbedre søvn induceret af subthreshold natriumpentobarbital.
2.2.4 Natriumpentobarbital søvnforsinkelse
Sammenlignet med den tomme gruppe forkortede estazolam og alle tre ekstraktdoser signifikant pentobarbital-induceret søvnlatens (P < 0,001). Estazolam reducerede latensen med 58,44 % (P < 0,001). Lav-, medium- og højdosisekstraktgrupperne reducerede latensen med henholdsvis 29,59 %, 31,42 % og 53,83 % (alle P < 0,001). Der var ingen signifikant forskel mellem lave og mellemstore doser; den høje dosis forkortede latensen signifikant sammenlignet med både lave og mellemdoser med 34,43 % og 32,69 % (P < 0,01), med en effekt svarende til estazolam (tabel 7). Derfor forkortede alle tre doser markant pentobarbital-induceret søvnlatens, hvor den høje dosis fungerede bedst.
Traditionel kinesisk medicin indeholder forskellige bioaktive bestanddele, der virker på flere mål, og tilbyder unikke fordele til behandling af søvnløshed [17]. Med voksende opmærksomhed på søvnproblemer bliver medicinsk-spiselige TCM'er i stigende grad undersøgt for søvnmodulation [18]. For eksempel forkortede en sammensat fast drik, der hovedsageligt består af Suanzaoren og Poria, signifikant pentobarbital-induceret søvnlatens og forlænget søvnvarighed hos mus, potentielt via ændringer i 5-HT, DA og GABA [19]. Her øgede ekstraktet signifikant søvn under subtærskelpentobarbital og forkortede pentobarbital-induceret søvnlatens, hvilket fremmede søvnstart og faldende latens, mens det ikke viste nogen direkte søvninducerende effekt. Det målte indhold af primære komponent var i faldende rækkefølge: citronsyre (77,73 mg·g–1), polysaccharider (38,93 mg·g–1), echinacosid (2,69 mg·g–1), verbascosid (1,03 mg·g–1) og spinosin (0,50 mg·g–1). Spinosin har vist sig at forbedre pentobarbital-induceret søvn; det kan øge ikke-REM-søvn og ændre c-Fos-ekspression i søvn-vågen-regulerende hjerneregioner [20], dæmpe PCPA-induceret søvnløshed, reducere søvnlatens og forlænge søvn [21]. Verbascoside har rapporteret anxiolytiske, hypnotiske og muskelafslappende aktiviteter [22]. I modsætning hertil har hovedbestanddelene - citronsyre, polysaccharider (fra Cistanche, Suanzaoren og Wumei) og echinacosid - færre direkte rapporter om søvnforbedring; nyere forskning i TCM-polysaccharider (f.eks. Acanthopanax senticosus polysaccharides) tyder dog på potentielle søvnfordele via veje såsom SIRT1/PGC-1 [23]. Derfor berettiger rollerne af citronsyre, polysaccharider og echinacosid i søvnmodulation yderligere undersøgelse.
stand 7. Effekt af ekstraktet på søvnlatens induceret af natriumpentobarbital i mus (x̄ ± s, n=12)
| Gruppe | Totalt antal dyr | Søvnforsinkelse (min.) |
|---|---|---|
| Tom | 12 | 32.34 ± 4.27 |
| Estazolam | 12 | 13.44 ± 3.20** |
| Lav-dosis ekstrakt | 12 | 22.77 ± 5.81**# |
| Mellemdosis ekstrakt | 12 | 22.18 ± 6.05**# |
| Højdosis ekstrakt | 12 | 14.93 ± 3.35** |
Bemærkninger:
Sammenlignet med blank gruppe: ** P < 0,0001.
Sammenlignet med højdosisekstraktgruppe: # P < 0,01.
3 Konklusion
Ved at bruge de medicinsk-spiselige TCM'er Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen og Mume Fructus til at formulere en Congrong-Zaoren-Wumei-drik, optimerede vi fremstillingsprocessen for dets ekstrakt ved at bruge indholdet af fire markørkomponenter (echinacosid, verbascoside, spinosin, citronsyreindicerer) og polysaccharider. De optimale ekstraktionsbetingelser blev bestemt som 100 grader, et faststof-væske-forhold på 1:12 (g·mL-1) og 2 timer, hvilket giver teoretisk vejledning til industriel produktion. Yderligere evaluering viste, at 30-dages kontinuerlig administration ikke havde nogen direkte søvn-inducerende effekt i mus, men det reducerede signifikant angstlignende adfærd i open-field-testen (hvilket tyder på en beroligende effekt), forbedret søvn under en subtærskeldosis af natriumpentobarbital og markant forkortet pentobarbital-induceret søvnlatens. Disse resultater indikerer, at ekstraktet fremstillet under den optimerede proces udviser gunstige søvnforbedrende effekter hos mus, hvilket giver et videnskabeligt grundlag for udvikling af Cistanche-baserede søvnforbedrende produktlinjer.
Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85.000 acres; frisk cistanche-opbevaring ~15.000 tons) understøtter råvarekonsistens og international standard QC, hvilket letter kommercialiseringen af funktionelle drikkevarer og kosttilskud, der opfylder USA/EU-forventningerne.
