Præparativ isolering og oprensning af fire forbindelser fra cistanches Deserticola YC Ma ved højhastigheds modstrømskromatografi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt:

Efter et komponentberigelsestrin på en silicagelsøjle, firephenylethanoid glycosiderblev isoleret fraCistanches deserticolaog renset ved præparativ højhastighedsmodstrømskromatografi (HSCCC) med et tofaset opløsningsmiddelsystem bestående af ethylacetat-n-butanol-ethanol-vand (40:6:6:50, v/v /v/v). I alt 30,9 mg acteosid, 13,0 mg isoacteosid, 12,5 mg syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid og 7,2 mg 2'-acetylacteosid med en renhed på mere end 95 procent, som bestemt ved HPLC-ELSD, blev opnået i et-trins adskillelse fra 297 mg afCistanche deserticola ekstrakt, henholdsvis. Deres strukturer blev identificeret ved HR-MS, 1H-NMR og 13C-NMR.

Nøgleord: højhastigheds modstrømskromatografi;Cistanches deserticola YC Ma;phenylethanoid glycosider; akteosid; isoacteosid; syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid; 2'-acetylacteosid.

Introduktion

Cistanches deserticolaYC Ma, en art afCistancherder tilhører Orobanchacea-familien, er en velkendt traditionel kinesisk medicin til behandling af nyremangel, kvindelig infertilitet, sygelig leukorré, neurapraksi og senil obstipation [1]. Det er en parasitisk plante, der er vidt udbredt i det nordvestlige Kina. Indtil videre er adskillige forbindelser, herunder phenylethanoidglycosider (PhGs), iridoider og lignaner blevet isoleret fra denne art [2]. Nogle af phG'erne er blevet rapporteret at have antioxidative, hepatobeskyttende og neurobeskyttende aktiviteter [3-6]. Imidlertid er isolerings- og oprensningsproceduren for PhG'er vanskelig og tidskrævende. Desuden bruger de klassiske multiple kromatografiske metoder ikke kun et stort antal organiske opløsningsmidler, men giver også en lavere prøvegenvinding. Højhastigheds modstrømskromatografi (HSCCC), en støttefri væske-væske-partitionskromatografisk teknik, tilbyder fremragende prøvegenvinding sammenlignet med nogle konventionelle metoder og er blevet brugt i vid udstrækning til adskillelse og oprensning af forskellige naturlige produkter [7-9] . Selvom flere phG'er er blevet renset fraCistancherslægt og andre af HSCCC [10-14], intet papir har rapporteret oprensningen af ​​acteosid, isoacteosid, syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid og 2'-acetylacteosid i ét bifasisk system.

I dette papir rapporterer vi en simpel metode til adskillelse og oprensning af fire PhG'er fra C. deserticola. Endelig blev der opnået 30,9 mg acteosid, 13,0 mg isoacteosid, 12,5 mg syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid og 7,2 mg 2'-acetylacteosid i et enkelt trin. adskillelse fra 297 mg fraktion med en renhed på henholdsvis 99 procent, 95 procent, 99 procent og 98 procent. Deres strukturer blev karakteriseret baseret på 1H- og 13C-NMR-spektraldata og HR-MS-spektre. Strukturerne af de fire phG'er identificeret i denne undersøgelse er vist i figur 1.

Resultater og diskussion

HPLC-analyse af råekstrakten

Den bestanddel berigede fraktion af n-butanekstrakt fra C. deserticola blev analyseret ved HPLC-UV. Den anvendte søjle var en Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, by, statsforkortelse, USA), den mobile fase var methanol-vand (30:70, v/v). Strømningshastigheden var 1 ml/min. Detektorbølgelængden blev indstillet til 254 nm. HPLC-kromatogrammet er vist i figur 2. Toppe 1 til 4 svarer til acteosid (1), isoacteosid (2), syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid (3) og 2'-acetylacteosid (4), henholdsvis.

Valg af tofaset opløsningsmiddelsystem

Succesfuld adskillelse med HSCCC afhænger i vid udstrækning af valget af et passende tofaset opløsningsmiddelsystem, det tofasede opløsningsmiddelsystem blev udvalgt i henhold til fordelingskoefficientværdierne (K) for hver målkomponent, og et optimalt område af K bør være fra {{ 2}}.5 til 2.

I eksperimentet er K-værdierne for målkomponenter i flere tofasede opløsningsmiddelsystemer vist i tabel 1 (selvom en smule højere for top 4 viste resultaterne sig at være acceptable). Blandt dem gav ethylacetat-n-butanol-ethanol-vand (40:6:6:50, v/v/v/v) passende fordelingskoefficienter for målforbindelserne. Til sidst blev opløsningsmiddelsystemet bestående af ethylacetat-n-butanol-ethanol-vand (40:6:6:50, v/v/v/v) brugt til at isolere og oprense fire forbindelser af C. deserticola, som vist i Figur 3. Som vist i figur 2 viste HPLC-analysen af ​​hver HSCCC-fraktion, at fire rene PhG'er (acteosid, 99 procent; isoacteosid, 95 procent; syringalid A 3′- -L-rhamnopyranosid 99 procent og 2′- acetylacteosid 98 procent) kunne opnås fra den rå fraktion.

Eksperimentel

Apparat

HSCCC-udstyret, der blev brugt i denne undersøgelse, var et TBE-300B højhastigheds modstrømskromatografisystem (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, Kina) med tre præparative flerlags spoleadskillelsessøjler forbundet i serie (diameter af røret)=2,6 mm, samlet volumen=300 mL) og en 20 mL prøveløkke. Omdrejningsradius eller afstanden mellem holderaksen og midtencentrifugens akse (centrifugens akse (R) var 5 cm, og værdien varierede fra 0.5 ved den interne terminal til 0.8 ved den eksterne terminal (= r/R, hvor r er afstanden fra spolen til holderakslen). Et HX 105 cirkulationsredskab med konstant temperatur (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Beijing, Kina) blev brugt til at kontrollere temperaturen i eksperimentet. HSCCC-systemet var udstyret med en model TBP-5002 konstantstrømspumpe med mellemtryk, en model TBP-2000 UV-detektor, der fungerede ved 254 nm, og en model V4.0-arbejdsstation (Jinda Biochemistry Instrument Company, Shanghai, Kina).

Det anvendte high-performance væskekromatografi (HPLC) udstyr var et Agilent 1200 system, som består af en G1312A binær pumpe, en G1329A autosampler, en G1314A variabel bølgelængde detektor (VWD), et G1316A termostateret søjle rum, en G137 degaser, LCB degasent, LCB degasser, arbejdsstation. En Alltech 3300 ELSD blev brugt til påvisning af renhederne. Agilent 6520 Q-TOF og Bruker AVANCE III 500-NMR-spektrometre blev brugt til forbindelsernes strukturelle identifikation. 1H- og 13C-NMR-spektre (ved henholdsvis 500 og 125 MHz) blev målt ved stuetemperatur (22 grader/295,1 K).

Reagenser og materialer

Ethylacetat, n-butanol og ethanol var analytiske kvaliteter, og methanol var HPLC-kvalitet. Alle opløsningsmidlerne blev købt fra Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Kina). Milli-Q-vand (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) blev brugt til alle opløsninger og fortyndinger. Rhizomet af C. deserticola blev indsamlet fra Indre Mongoliet-provinsen, Folkerepublikken Kina, i juni 2009. Planten blev identificeret af Prof. Lijuan Zhang, og en kuponprøve (nr. 20091001) blev deponeret i vores laboratorium.

Forberedelse af råprøve

Pulverformede lufttørrede kødfulde stængler af C. deserticola (1 kg) blev tilbagesvalet to gange med vandig ethanol (8 L, 60 % v/v) i 2 timer hver gang. Ekstrakten blev inddampet under reduceret tryk og ved en temperatur på 60 grader indtil total fordampning af ethanolen. Remanensen blev suspenderet i vand og ekstraheret successivt tre gange med chloroform, ethylacetat og n-butanol, hvilket gav 5,16 g n-butansyreekstrakt efter inddampning til tørhed under reduceret tryk. N-butanekstrakten blev derefter separeret på en silicagelsøjle (200-300 mesh) under anvendelse af progressiv gradienteluering (CHCl3-MeOH, 10:1→1:1) for at give otte fraktioner. Fraktion 6 (297 mg) blev anvendt til yderligere HSCCC-isolering og separation.

Valg af tofasede opløsningsmiddelsystemer

De tofasede opløsningsmiddelsystemer blev udvalgt i henhold til fordelingskoefficienten (K) af målkomponenterne i fraktionen af ​​C. deserticola. K-værdierne blev bestemt ved LC-analyse som følger: En passende mængde råekstraktpulver (fraktion 6) blev opløst i den nedre fase af opløsningsmiddelsystemet og analyseret ved HPLC. Områderne af toppene blev registreret som A1. Derefter blev et lige så stort volumen af ​​den øvre fase tilsat til opløsningen og blandet grundigt for at nå fordelingsligevægt. Den nedre fase blev derefter analyseret ved HPLC igen. Sidstnævnte topområder blev registreret som A2. K-værdierne blev beregnet efter følgende ligning: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

Klargøring af tofaset opløsningsmiddelsystem og prøveopløsning

I denne undersøgelse blev det tofasede opløsningsmiddelsystem bestående af ethylacetat-n-butanol-ethanol-vand (40:6:6:50, v/v/v/v) brugt til HSCCC-separation. Hvert opløsningsmiddel blev tilsat til en skilletragt og ækvilibreret grundigt ved stuetemperatur. Den øvre fase og den nedre fase blev adskilt og afgasset ved sonikering i 30 minutter kort før brug. Prøveopløsningen blev fremstillet ved at opløse 297 mg af fraktion 6 i 15 ml af den nedre fase af ethylacetat-n-butanol-ethanol-vand (40:6:6:50, v/v/v/v).

HSCCC-separationsprocedure

HSCCC blev udført som følger. Den flerlags oprullede søjle blev først fyldt med den øvre organiske stationære fase. Den nedre vandige mobile fase blev derefter pumpet ind i hovedenden af ​​søjlen med en strømningshastighed på 1,5 ml/min, og samtidig blev HSCCC-apparatet kørt ved en omdrejningshastighed på 900 rpm. Efter at hydrodynamisk ligevægt var etableret, som angivet ved en klar mobil fase, der eluerede ved haleudløbet (ca. to timer senere), blev en 15 ml prøveopløsning indeholdende 297 mg af det rå ekstrakt (fraktion 6) injiceret gennem injektionsventilen. Søjlens effluent blev kontinuerligt overvåget under 254 nm. Fire topfraktioner blev opsamlet ifølge kromatogrammet og derefter inddampet under reduceret tryk. Apparatets temperatur blev indstillet til 25 grader.

HPLC-analyse og identifikation af HSCCC-spidsfraktioner

Topfraktionerne fra HSCCC blev analyseret ved HPLC-ELSD. Den anvendte søjle var en Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm), den mobile fase var methanol-vand (30:70, v/v). Strømningshastigheden var 1 ml/min. ELSD blev drevet under følgende betingelser: Temp 45 grader, gas 1,6 l/min. Strukturel identifikation af de fire HSCCC-topfraktioner blev udført ved HR-ESI-MS, 1H og 13C-NMR-spektroskopi.

Den strukturelle identifikation

Fraktion I: HR-ESI-MS observeret ved m/z 623,2001 (M-H)-, beregnet for C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 af rhamnose), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH 2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 af glucose), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34} } af rhamnose), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar -CH=CH-), 6,5-7,1 (6H, aromatisk H).13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C{{65} }), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf-2), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf{{ 98}}), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 114,8 (Caf-), 148,1 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc{{116} }), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha{{131} }), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha{{146} }). Sammenlignet med dataene givet i litteraturen [17] svarede fraktion I til acteosid.

Fraktion II: HR-ESI-MS observeret ved m/z 623,1987 (M-H)-, beregnet for C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 af rhamnose), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 af glucose), 5,17 (1H, d, J {{ 33}} Hz, H-1 af rhamnose), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,0 (6H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,7 (C-), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89) }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf- ), 115,0 (Caf-), 147,3 (Caf-), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). 1H-NMR- og 13C-NMR-spektraldataene var i overensstemmelse med dem for isoacteosid som rapporteret i litteraturen [18].

Fraktion III: HR-ESI-MS observeret ved m/z 6{{108}}7,2032 (M-H)-, beregnet for C29H35O14, 607,2032. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 af rhamnose), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH 2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 af glucose), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{{ 35}} af rhamnose), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH =CH-), 6,6-7,1 (7H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C-), 36,4 (C-), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88) }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Ifølge litteraturen [18] svarede fraktion III til syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid.

Fraktion IV: HR-ESI-MS observeret ved m/z 665,21 {{20}} (M-H)-, beregnet for C31H37O16, 665,2087. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 af rhamnose), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J { {25}},5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 af glucose), 4,90 (1H, d, J { {37}} Hz, H-1 af rhamnose), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,0 (6H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4(C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C-), 36,4 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93) }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf- ), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). 1H-NMR- og 13C-NMR-spektraldataene var i overensstemmelse med dem for 2'-acetylacteosid [17].

Konklusioner

En HSCCC-metode til præparativ separation og oprensning af acteosid, isoacteosid, syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid og 2'-acetylacteosid fraCistanches deserticola YC Mablev etableret. Nærværende undersøgelse indikerer, at HSCCC er en meget kraftfuld teknik til præparativ separation og oprensning af bioaktive komponenter fra plantematerialer. Forbindelserne kan også isoleres i tilstrækkelig stor skala med høje renheder og kan derefter anvendes som referencestoffer til kromatografi eller bioaktivitetsundersøgelser. Metoden er en gennemførlig, økonomisk og effektiv teknik til hurtig præparativ isolering af komplicerede naturprodukter.

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (PCSIRT), Project of International Cooperation Plan fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina (2008DFB30070) og Scientific Program of Left Banner of Alashan ({{2 }}).

Referencer

1. Kinesisk farmakopékommission. Folkerepublikken Kinas farmakopé; People's Medical Publishing House: Beijing, Kina, 2010; Bind 1, s. 126.

2. Jiang, Y.; Tu, PF Analyse af kemiske bestanddele i Cistanche-arter. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970-1979.

3. Morikawa, T.; Pan, Y.; Ninomiya, K.; Imura, K.; Matsuda, H.; Yoshikawa, M.; Yuan, D.; Muraoka, O. Acylerede phenylethanoid-aminoglykosider med hepatobeskyttende aktivitet fra ørkenplanten Cistanche tubulosa. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 1882-1890.

4. Chen, H.; Jing, FC; Li, CL; Tu, PF; Zhang, QS; Wang, ZH Echinacoside forhindrer de striatale ekstracellulære niveauer af monoamin-neurotransmittere i at falde hos rotter med 6-hydroxydopaminlæsioner. J. Ethnopharmacol. 2007, 114, 285-289.

5. Muraoka, O.; Ninomiya, K.; Morikawa, T.; Wakayama, H.; Matsuda, H.; Yoshikawa, M. Leverbeskyttende bestanddele fra stænglerne af Cistanche tubulosa. Yakugaku Zasshi 2007, 127, 49–51.

6. Koo, KA; Sung, SH; Park, OH; Kim, SH; Lee, KY; Kim, YC In vitro neurobeskyttende aktiviteter af phenylethanoid glycosider fra Callicarpa dichotoma. Planta Med. 2005, 71, 778-780.

7. Li, M.; Liu, RM; Sun, AL; Wu, SJ; Liu, NN Adskillelse og oprensning af rutin og acaciin fra den kinesiske lægeurt Herba Cirsii ved kombination af makroporøs adsorptionsharpiks og højhastigheds modstrømskromatografi. J. Chromatogr. Sci. 2009, 47, 329-332.

8. Yin, H.; Zhang, S.; Luo, XM; Liu, YH Forberedende isolering og oprensning af to benzoxazinoid glucosider fra Acanthus ilicifolius L. ved højhastigheds modstrømskromatografi. J. Chromatogr. 2008, 1205, 177-181.

9. Peng, AH; Li, R.; Hu, J.; Chen, LJ; Zhao, X.; Luo, HD; Ja, HY; Yuan, Y.; Wei, YQ Flowhastighedsgradient højhastigheds modstrømskromatografi adskillelse af fem diterpenoider fra Triperygium wilfordii og opskalering. J. Chromatogr. 2008, 1200, 129-135.

10. Xie, J.; Deng, J.; Tan, F.; Su, J. Separation og oprensning af echinacosid fra Penstemon barbatus (Can.) Roth ved genanvendelse af højhastigheds modstrømskromatografi. J. Chromatogr. B2010, 878, 2665-2668.

11. Li, L.; Tsao, R.; Yang, R.; Liu, C.; Young, JC; Zhu, H. Isolering og oprensning af phenylethanoid glycosider fraCistanche deserticolaved højhastigheds modstrømskromatografi. Food Chem. 2008, 108, 702-710.

12. Li, L.; Tsao, R.; Liu, ZQ; Liu, SY; Yang, R.; Young, JC; Zhu, HH; Deng, ZY; Xie, MY; Fu, ZH Isolering og oprensning af acteosid og isoacteosid fra Plantago psyllium L. ved højhastigheds modstrømskromatografi. J. Chromatogr. 2005, 1063, 161-169. Molecules 2012, 17 8284

13. Lei, L.; Yang, FQ; Zhang, TY; Tu, PF; Wu, LJ; Ito, Y. Præparativ isolering og oprensning af acteosid og 2'-acetylacteosid fra Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck ved højhastigheds modstrømskromatografi. J. Chromatogr. 2001, 912, 181-185.

14. Lei, L.; Yang, FQ; Zhang, TY; Tu, PF; Wu, LJ; Chen, FK; Ito, Y. Forberedende isolering og oprensning af phenylethanoidglycosider fra ekstrakt af afføring fra beaglehunde ved højhastigheds modstrømskromatografi. J. Liq. Chromatogr. Relat. Teknol. 2001, 24, 2187-2195.

15. Gao, SY; Feng, B.; Zhu, RN; Ma, JK; Wang, W. Præparativ isolering af tre anthraquinoner fra Rumex japonicus ved højhastigheds modstrømskromatografi. Molecules 2011, 16, 1201-1210.

16. Han, F.; Bai, YH; Wang, J.; Wei, J.; Yu, CY; Li, S.; Yang, WL; Han, CH Isolering og oprensning af Oridonin fra hele planten af ​​Isodon rubescens ved højhastigheds modstrømskromatografi. Molecules 2011, 16, 7949-7957.

17. Kobayashi, H.; Oguchi, H.; Takizawa, N.; Miyase, T.; Ueno, A.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Nye phenylethanoidglycosider fra cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. I. Chem. Pharm. Tyr. 1987, 35, 3309-3314.

18. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Bestanddelene af cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Isolering og strukturer af et nyt phenylethanoid glycosid og et nyt neolignan glycosid. Chem. Pharm. Tyr. 1990, 38, 1927-1930.