Del 1: Acteosid undertrykt Microglia M1-polarisering gennem hæmmet NF-KB-signalvej og AMPK-medieret mitokondrierfunktionsgendannelse

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Venligst klik her til del 2

Abstrakt:

Baggrund:Alzheimers sygdom (AD)er den hyppigste form for demens. Mensacteosid fra cistanche-urt(ACT), en forbindelse isoleret fra Cistanchetubulosa, besidder neurobeskyttende egenskaber. Imidlertid forbliver den underliggende mekanisme til regulering af mikroglia-polarisering dårligt defineret.Metoder:Heri blev den AlCl3-inducerede AD-model i zebra¦sh-larver anvendt for at afdække den terapeutiske effekt af ACT. BV-2-celler blev brugt til at demonstrere ACTs rolle på mikroglia-polarisering. RNA-sekvens, HPLC-Q-TOF-MS, western blot og molekylær docking blev kombineret for at bekræfte dens mekanisme.Resultater:ACT forbedrede markant den eksperimentelle dyskinesi og nervesystemlidelser hos zebra. Efterfølgende undertrykte det M1-polarisering og promoverede til M2-fænotypen i LPS-inducerede BV-2-celler. Vi demonstrerede først, at ACT udøvede dyb transkriptomisk påvirkning, som involverede regulering af vigtige signalveje i in§amation, argininbiosyntese samt pantothenat- og CoA-biosyntese, der korrelerede med mitokondrierfunktion. HANDLING(acteosid fra cistanche-urt) behandling reducerede mikroglia M1-polarisering ved at hæmme NF-KB-signalvejen. Og de metaboliske veje blev yderligere bekræftet af HPLC-Q-TOF-MS. Derudover korrigerede ACT overdreven ROS for at genoprette mitokondriefunktionen gennem AMPK-medieret PGC-1 og UCP-2 opregulering, i overensstemmelse med metaboliske ændringer. Spændende nok kan ACT binde direkte til både NF-KB og AMPK, som det fremgår af molekylær docking.Konklusioner:Forskningen gav en infusiv mekanisme for ACT og illustrerede et nyt perspektiv baseret på mitokondriel dysfunktion for at afsløre forbindelsen mellem metabolisme og mikroglia-polarisering.

Baggrund:

Alzheimer's sygdom(AD) er en almindelig neurodegenerativ sygdom ledsaget af kognitiv svækkelse og dyskinesi[1]. Det er kendetegnet ved alvorligt neuronalt tab, senile plaques og neuro|brillære sammenfiltringer[2]. Patogenesen af ​​AD er multidimensionel og forbundet med neuroin§amation. Neuroin§amation er drevet af aktivering af gliaceller, tæt forbundet med udviklingen af ​​AD[3, 4]. Under progressionen og forværringen af ​​neuroin§amation betragtes mikroglia som nøglefaktoren. Microglia er de primære immunceller i centralnervesystemet. Det er tæt forbundet med en kaskade af processer, der indeholder hjerneudvikling, opretholdelse af et neutralt miljø, samt reagere på skader og reparation[1]. Desuden kan mikroglia stimuleres til en M1-fænotype, og ekspressionen af ​​pro-in§ammatoriske cytokiner øges, når neuroin§amationsrelaterede sygdomme som AD opstod[5]. Undersøgelser viser også, at polariseringen til M1-fænotypen ofte er ledsaget af metaboliske forstyrrelser[6], hvilket forårsager ubalance i energimetabolismen og mitokondriel dysfunktion[7]. Disse negative ændringer er afledt af neurodegeneration, selv AD.

acteosid fra cistanche-urt(ACT), et phenylethanoid glycosid, er primært afledt af Cistanchetubulosa. Stigende beviser har antydet, at ACT havde adskillige farmakologiske aktiviteter, herunder neurobeskyttende[8], anti-in§ammatoriske[9] og antioxidant[10] virkninger. Det er især blevet rapporteret, at ACT forbedrer indlærings- og hukommelsessvækkelse samt opregulerer energimetabolismen hos streptozotocin-inducerede rotter[11]. Det er også blevet foreslået at hæmme neuronal apoptotisk celledød og mitokondriel skade i de eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis-mus [12]. Men færre undersøgelser har været fokuseret på effekten af ​​ACT på mikroglia M1/M2 polarisering. Især forskellige mekanismer, såsom reparation af mitokondrierfunktion og regulering af cellemetabolisme, er ikke blevet udført. Derudover er mekanismen for ACT, der bidrog til mikroglia M1/M2-polarisering, forblevet uudforsket.

Denne rapport havde til formål at undersøge den terapeutiske effekt af ACT såvel som den underliggende molekylære mekanisme af ACT i AD. Heri viste ACT en signifikant neurobeskyttelseseffekt i AlCl-3-inducerede AD-zebrash-larver. Derudover hæmmede ACT effektivt M1-polarisering og fremmede M2-fænotypen i LPS-inducerede BV-2-celler. RNA-Sequencing (RNA-Seq) integreret med metabolomics-metoden for bedre at forstå den underliggende mekanisme af ACT til at regulere mikroglia-polarisering. Krydstalen mellem metabolisme og mikroglia-polarisering med hensyn til mitokondriel funktion blev undersøgt. Denne undersøgelse vil give ny respekt for den videre undersøgelse af ACT som et potentielt terapeutisk middel til behandling af AD.

Metoder:

Dyr og modelgruppering:

Vildtype zebra¦sh (AB-stamme, 4 måneder gammel) blev valgt i denne undersøgelse (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). De blev holdt under en 14/10 timers lys/mørke-cyklus ved 28 grader, efter den tidligere metode[13]. Naturlig gødning og normalt udviklede embryoner blev genereret og dyrket til 3 dage efter befrugtning (dpf) i en belysningsinkubator. Alle zebra¦sh-eksperimenter blev udført under tilsyn af Animal Ethics Committee of China Pharmaceutical University.

Zebra¦sh-larver blev opdelt i seks grupper og behandlet fra 3 dpf til 7 dpf: kontrolgruppe, modelgruppe, model plus donepezil hydrochlorid (DPZ) gruppe, model plus ACT grupper. Kontrolgruppen blev holdt i mediet med 0,2 procent DMSO, og modelgruppen blev behandlet med 150 μM AlCl3 (pH 5,8). Modellen plus DPZ-gruppen blev co-behandlet med AlCl3 og 8 μM DPZ. Modellen plus ACT-grupper blev samtidig behandlet med AlCl3 og forskellige koncentrationer af ACT (200, 100, 50 μM). HANDLING(acteosid fra cistanche urt)(HPLC-renhed større end eller lig med 98 procent) blev opnået fra Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kina). AlCl3·6H2O og DPZ blev købt fra Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, Kina).

Adfærdsanalyse

Zebra¦sh-larvernes bevægelser blev registreret med en ViewPoint adfærdsanalysator (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) ved 28 grader. Kort sagt, adfærdsparametrene og resultatbehandlingen var i overensstemmelse med den metode, vi etablerede tidligere[13]. Her blev gennemsnitlig hastighed (AS), hastighedsændring (ΔS), dyskinesi recovery rate (DRR) og respons e¨ciency (RE, procent) udvalgt til at evaluere dyskinesi recovery i zebra¦sh.

Efter behandling fra 3 dpf til 7 dpf blev zebra¦sh-larver opsamlet for at måle AChE- og ChAT-aktivitet. Baseret på producentens protokol blev aktiviteten detekteret ved hjælp af enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kina). Og proteinkoncentrationerne af forskellige prøver blev bestemt ved BCA-metoden.

BV-2-celler blev podet i en 6-brøndskål separat (n=6/gruppe). Efter behandling blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket tre gange med kold PBS. Derefter straks udsat for flydende nitrogen for at undertrykke cellernes stofskifte. Cellerne blev høstet med kold 80% methanol (1 ml/brønd), og suspensionen blev overført til et 2 ml Eppendorf-rør. For at lette proteinudfældning, vortexes kraftigt i 1 minut og centrifugeres ved 13,000 rpm i 15 minutter ved 4 grader. Cellesuspensionen blev overført til et nyt 2 mL Eppendorf-rør og tørret under en strøm af nitrogen og opbevaret ved -80 grad indtil analyse. Den tørrede rest blev rekonstitueret i 150 μL forafkølet 25 procent acetonitril. For at sikre stabiliteten og nøjagtigheden af ​​sekvensanalysen blev lige store volumener (10 μL) af hver celleprøve kombineret som kvalitetskontrol (QC) prøver. Under metabolitdetektion blev disse prøver injiceret efter hver sjette celleprøve for at bekræfte deres stabilitet. En 1 μL aliquot blev injiceret til HPLC-Q-TOF-MS.

HPLC-Q-TOF-MS-analyse blev udført på Agilent 1290 HPLC-system forbundet med Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) massespektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Adskillelsen blev udført på en ACQUITY UPLC BEH C18 kolonne (2,1×100 mm, 1,7 μm). Den mobile fase var sammensat af 0,1 procent myresyre-vand (v/v; A) og acetonitril (B).

§ow-hastigheden blev sat til {{0}},4 ml/min med følgende optimale gradientelueringsbetingelser: 0 til 2 min, 5 procent B; 2 til 20 minutter, 5 procent til 95 procent B (positiv ion-tilstand); 0 til 2 minutter, 5 procent B; 2 til 20 minutter, 5 procent til 95 procent B (negativ ion-tilstand). Driftsparametrene for massespektrometeret blev indstillet som følger: gastemperatur, 320 grader; tørregas, 10 l/min; forstøver, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V.

De rå data blev betjent under MassHunter Workstation Software version B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). De rå data blev forbehandlet af XCMS-platformen. Principalkomponentanalyse (PCA) og partiel mindste kvadraters diskriminantanalyse (PLS-DA) af de normaliserede data blev udført med MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). Kombineret med litteratur er de differentielle metabolitter (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">