Fremstilling og påføring af Cistanche-glycosid ved enzymatisk hydrolysemetode

Abstrakt: Udforskning af fremstillingen af ​​Cistanche-glycosid ved enzymatisk hydrolyse og dets anvendelsesforskning. Ved at bruge ekstraktionshastigheden af ​​Cistanche-glycosid som evalueringsindikator blev den enzymatiske hydrolysemetode brugt til at ekstrahere Cistanche-glycosid, og den blev bestemt ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC). Ved at konstruere en aldrende modelmus blev glycosiderne af Cistanche deserticola fremstillet ved enzymatisk hydrolyse påført de aldrende modelmus, og indlærings- og hukommelsesevnerne hos de aldrende modelmus blev observeret såvel som påvisningen af ​​hjernevævsoxidationsniveauer. Resultaterne viste, at de optimale betingelser for det enzymatiske hydrolyse ortogonale eksperiment var: når forholdet mellem materiale og væske var 1:10, var ekstraktionstiderne 3 gange, ekstraktionstemperaturen var 80 grader, og ekstraktionstiden var 1 minut. ekstraktionshastigheden af ​​Cistanche deserticola-glykosider var den højeste. Sammenlignet med kontrolgruppen forbedrede effekten af ​​Cistanche-glycosid på aldrende modelmus deres indlærings- og hukommelsesevner signifikant (P<0.05); After treatment with cistanche glycoside, the content of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in brain tissue of aging model mice increased significantly (P<0.05), while the content of malondialdehyde (MDA) decreased significantly (P<0.05). In this study, the preparation method of Cistanche glycosides was optimized and the anti-aging ability of Cistanche glycosides was tested. This study laid a theoretical and practical foundation for the further development and clinical application of Cistanche glycosides in the future.  

Phenylethanolglycosid er den vigtigste aktive komponent i Cistanche deserticola

Nøgleord: enzymatisk hydrolysemetode; Cistanche glycosid; Aldrende modelmus; Antioxidant; anvendelsesforskning

1 Eksperimentel del

1.1 Hovedmaterialer, reagenser og instrumenter

Sunde ICR-hanmus, Beijing Huizhi Heyuan Biotechnology Co, Ltd; Cistanche glycosid, Anyang Yishoutang Pharmaceutical Chain Co., Ltd; Cistanche glycosid standard (renhed større end eller lig med 99,0 procent), Wuhan Huashun Biotechnology Co., Ltd; Indre Mongoliet Beiqi, Shanxi Beiqi, Indre Mongoliet Cistanche glykosid specialkvalitet, Indre Mongoliet Cistanche glycosid første klasse, Indre Mongoliet Cistanche glycosid anden klasse, Shanxi Heipi Qi AA kvalitet, Shanxi Heipi Qi A kvalitet, Gansu Cistanche glycosid, alle købt fra lokale apoteker; Methanol, ethanol, analytisk alkohol, Nanjing Datang Chemical Co, Ltd; SOD-, MDA- og CAT-sæt, Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.

DFY400 Svingende højhastigheds-kværn til traditionel kinesisk medicin, Zhejiang Wenling Dade Traditional Chinese Medicine Machinery Co., Ltd; SHZ-D cirkulerende vand vakuumpumpe, Gongyi Yuhua Instrument Co, Ltd; 101-1Y infrarød tørreovn, Hangzhou Lantian Laboratory Instrument Factory; U2001 Ultraviolet-Visible Spectrophotometer, Hitachi, Japan; Aglient 1100 LC højtydende væskekromatografi, Agilent Technologies, USA; 6511 elektriske blandere, Shanghai prøvemodelfabrik; PHS-3C Acidity Meter, Shanghai Ridao Scientific Instrument Co., Ltd; DF-500 frysetørremaskine, Baokun Vacuum Technology Co., Ltd.

Cistanche ekstrakt pulver

Klik her for at se Cistanche-produkter

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1.2 Eksperimentelle metoder

1. 2. 1. Behandling og ekstraktion af Cistanche-glykosidprøver

Ved at bruge ekstraktionshastigheden af ​​Cistanche-glykosider som evalueringsindekset blev det ortogonale eksperimentelle L9 (34) design brugt til undersøgelse. Det specifikke skemadesign er vist i tabel 1.

Tab. 1 Faktor niveau tabel

Vej nøjagtigt 100,0 g Cistanche-glycosidprøve, tør den i en tørreovn, knus den, passer gennem en 60 mesh sigte, og ekstraher Cistanche-glycosid fra Scutellaria baicalensis selvenzymhydrolysat i henhold til det ortogonale eksperimentelle designskema i tabel 1 [13,14].

1. 2. 2. Bestemmelse af Cistanche-glykosidindhold

Brug et UV-synligt spektrofotometer til at bestemme indholdet af Cistanche-glykosid. Mål nøjagtigt 0,5 mL Cistanche-glycosidekstrakt og bland det med 4,5 mL ultrarent vand. Tilsæt 0,5 mL 5 procent natriumnitritopløsning, og lad det stå i 5 minutter. Tilsæt derefter 0,5 mL 10 procent aluminiumnitratopløsning. Bland forsigtigt og lad det stå i 6 minutter. Tilsæt derefter 4 mL 1,0 mol/L natriumhydroxidopløsning. Bland forsigtigt og lad det stå i 15 minutter. Mål ved en bølgelængde på 510 nm mellem ultraviolet og synligt lys.

Cistanche deserticola eksperiment

1. 2. 3 HPLC-analyse

Brug af Kromasil C18-søjle (250 mm × 4,6 mm,5 μm) Stuetemperatur, injektionsvolumen 20 μ L. Flowhastighed 1 mL/min, A-fase vand, B-fase acetonitril. Elueringsprocedure: 0-5 minutter, 5 procent fase B, 95 procent fase A; 5-8 minutter, 5 procent -8 procent fase B, 95 procent -92 procent fase A; 8-15 minutter, 20 procent fase B, 80 procent fase A; 15~18 minutter, 20% ~30% fase B, 80% ~70% fase A; 18-35 minutter, 30 procent -45 procent fase B, 70 procent -55 procent fase A; 35~38 minutter, 45% ~80% fase B, 55% ~20% fase A. Detektionsbølgelængden er 254 nm.

1. 2. 4 Dyregruppering og administration

72 raske ICR-hanmus blev udvalgt og tilfældigt opdelt i 4 grupper med 18 mus i hver gruppe: kontrolgruppe (Con-gruppe), modelgruppe (Mod-gruppe), positiv kontrolgruppe (PC-gruppe) og cistanche-glycosidgruppe (HQ-gruppe) ). Kontrolgruppemusene modtog oral administration af dobbeltdestilleret vand og subkutan injektion af isotonisk saltvand; Musene i modelgruppen blev oralt administreret med dobbeltdestilleret vand og hypodermisk injiceret med 400 mg/kg D-neneneba galactose; I den positive kontrolgruppe blev 800 mg/kg piracetam indgivet oralt, og 400 mg/kg D-neneneba galactose blev injiceret subkutant; Mus i cistanche-glycosidgruppen fik 400 mg/kg astragalosid (dosis blev bestemt i det indledende forsøg; Shanxi Beiqi) oralt, og 400 mg/kg D-neneneba-galactose blev injiceret subkutant. Alle forsøgsmus blev administreret oralt og subkutant i 10 på hinanden følgende uger. Vej hver mus hver uge og overvåg nøje den fysiske tilstand af hver gruppe af mus. I den 9. uge, efter oral administration og subkutan injektion i 30 minutter, blev hver gruppe mus udsat for platformspring og mørkeundgåelsestest. I den 10. uge blev Morris-vandlabyrint-testen udført på hver gruppe mus. I den 11. uge blev hjernevævet fra hver gruppe mus taget for at bestemme indholdet af superoxiddismutase (SOD), katalase (CAT) og malondialdehyd (MDA) i hjernevæv.

1. 2. 5 Måling af indlærings- og hukommelsesevne hos aldrende mus

1) Undgåelseseksperiment

Før eksperimentet blev musene anbragt på instrumentet og akklimatiseret i 3 minutter. Efter fuldstændig tilpasning til det mørke instrument og miljø, blev musene placeret tilbage i avlsburet. Dernæst blev musene udsat for et kontinuerligt elektrisk stød, mens de stod på gulvet. Efter chokket opstod, flygtede musene instinktivt fra gulvet til platformen, og hele træningsprocessen varede i 5 minutter. Efter at eksperimentet var afsluttet, blev det samlede antal gange, musene modtog elektriske stød, talt, hvilket er antallet af mørkeundgåelsesfejl.

Ørken levende cistanche

2) Eksperiment med hoppeplatform

Den eksperimentelle hoppeplatform er 45 cm × 35 cm × En 25 cm organisk glaskasse med en skillevæg indeni, og en gummipude med en diameter på 9,5 cm og en højde på 4,5 cm er placeret på venstre side af venstre og højre gitter. Bunden af ​​æsken er dækket af kobbergitre som stimuleringselektroder. Når den udsættes for elektrisk stødstimulering, vil musen flygte til en sikker platform og derefter hoppe af platformen. Når musens fødder kommer i kontakt med el-nettet og får et elektrisk stød, er det en fejlreaktion. Registrer antallet af fejl og latenstid for musen inden for 3 minutter. Efter 24 timer målte testen igen musenes indlærings- og hukommelsesevner baseret på antallet af fejl og latens.

3) Vandlabyrinteksperiment

Før eksperimentet blev musene anbragt i en vandlabyrintanordning og fik lov til at svømme frit i 2 minutter for at tilpasse sig miljøet.

Positioneringsnavigationseksperiment [15]: Registrer det tidspunkt, hvor mus finder platformen.

Rumudforskningseksperiment [16]: optag tidspunkterne for mus, der krydser platformen.

1. 2. 6 Bestemmelse af antioxidantindhold i hjernevæv hos 6 aldrende mus

Efter adskillelse af musehjernevæv i henhold til konventionelle metoder blev indholdet af SOD, MDA og CAT i hjernevævet i hver gruppe mus målt i henhold til operationstrinnene i SOD, MDA og CAT kits.

1.3 Datastatistik og analyse

I denne undersøgelse blev alle data analyseret statistisk ved hjælp af Excel-regneark og SPSS19.0-software, og forskelle mellem grupperne blev evalueret ved hjælp af parrede t-tests. Når P<0.05, it indicates statistical significance; When P<0.01, it indicates significant statistical significance.

2 Resultater og diskussion

2.1 Ortogonalt eksperiment

Tabel 2 viser resultaterne af det ortogonale eksperiment for Cistanche-glykosider. Det kan ses af tabel 2, at den optimale ekstraktionsproces er A3B1C2D3, med en ekstraktionstemperatur på 80 grader, en ekstraktionstid på 1 minut, et faststof-væskeforhold på 1:10 og tre ekstraktionstider. Den højeste ekstraktionshastighed af Cistanche-glykosider opnås.

Tab. 2 Ortogonalt eksperiment af Cistanche-glykosid

2.2 Bestemmelse af Cistanche-glykosidindhold

Den UV-synlige spektrofotometri blev brugt til at detektere ekstraktet af 8 cistanche-glycosidprøver. Resultaterne er vist i figur 1, og der er signifikante forskelle i indholdet af cistanche glycosid mellem forskellige regioner eller varianter. Blandt dem har Shanxi Beiqi det højeste indhold af cistanche glycosid, mens Shanxi Heipi Qi har det laveste indhold af AA grade cistanche glycosid.

Fig. 1 Bestemmelse af forskellige slags Cistanche-glykosid

2.3 HPLC-detektion af Cistanche-glykosider

Ifølge de kromatografiske betingelser bestemt i afsnit 1.2.3 er HPLC-diagrammet for Cistanche-glykosider vist i figur 2. Retentionstiden for Cistanche-glykosider er 10.64 minutter, og massekoncentrationen er 1.{{ 7}}.0 μ G/mL, med god linearitet og en R-værdi på 0.999 8.

Fig. 2 HPLC-diagram af Cistanche-glycosid

2.4 Præcision og stabilitet

Tag den samme batch af Cistanche glycosid testopløsning og injicer 6 på hinanden følgende gange for at bestemme toparealet af Cistanche glycosid. Resultaterne viste, at præcisions-RSD for Cistanche-glykosider var mindre end 2,5 procent (n=6), hvilket indikerer en god præcision af Cistanche-glykosider.

Tag den samme batch Cistanche-glycosid-testopløsning og mål toparealet af Cistanche-glycosid ved henholdsvis {{0}}, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 og 24 timer. Resultaterne viste, at RSD for Cistanche-glykosidstabilitet var mindre end 2,0 procent (n=6), hvilket indikerer, at Cistanche-glykosid havde god stabilitet inden for 24 timer.

2. 5 Virkning af Cistanche-glycosid på kropsvægt af aldrende modelmus

Reference [17-19] fandt, at doseringen af ​​Cistanche-glycosider anvendt i denne undersøgelse ikke fremkaldte systemisk toksicitet hos mus. Som vist i figur 3 steg vægten af ​​alle grupper af mus før den 6. uge. Sammenlignet med kontrolgruppen faldt vægten af ​​modelgruppemusene signifikant i samme periode (P<0.01), while the weight of the positive control group and astragalus group mice slightly decreased. After the 6th week, the weight of the control group mice continued to increase, while the weight of the model group mice no longer increased. The positive control group and the Cistanche glycoside group slightly increased.

Fig. 3 Virkningen af ​​Cistanche-glycosid på kropsvægten af ​​de aldrende modelmus

2.6 Adfærdseksperimentresultater

2. 6. Observation af virkningen af ​​Cistanche Cistanche-glycosid på aldrende modelmus gennem mørkeundgåelseseksperiment

Som vist i figur 4A blev latensperioden for mus i hver gruppe forlænget på den anden dag sammenlignet med den første dag. Sammenlignet med kontrolgruppen var latenstiden for modelgruppemusene signifikant reduceret (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of mice in the positive control group and the Cistanche glycoside group was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).

2. 6. Observation af virkningen af ​​Cistanche Cistanche-glycosid på aldrende modelmus gennem et to-trins platformseksperiment

Som vist i figur 5 blev latenstiden for springplatformen i hver gruppe af mus forlænget på den anden dag sammenlignet med den første dag. Sammenlignet med kontrolgruppen var springstadiet for modelgruppemusene signifikant reduceret (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of the jumping platform in the positive control group and the Cistanche glycoside group of mice was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).

Sammenlignet med kontrolgruppen, P<0.05; Compared with the control group, P<0.01; Compared with the model group, the '#' is P<0.05; Compared with the model group, P<0.01, the same below

Fig. 4 Mørkeundgåelseseksperimenter for at observere virkningen af ​​Cistanche-glycosid på de aldrende modelmus. Latenstid (A); Antal fejl （B）

Fig. 5 Virkningen af ​​Cistanche-glycosid på de aldrende modelmus observeret ved platformspring-eksperiment. Latenstid (A); Antal fejl

2. 6. 3 Morris-vandlabyrinteksperiment for at observere virkningen af ​​Cistanche-glykosider på aldrende modelmus

Som vist i figur 6, efterhånden som antallet af træningsdage stiger, falder tiden for hver gruppe mus til at finde platformen gradvist. Sammenlignet med kontrolgruppen steg tiden for modelgruppemusene til at finde platformen signifikant (P<0.05), while the time for the positive control group and the Cistanche glycoside group mice to find the platform slightly increased.

Sammenlignet med kontrolgruppen, P<0.05

Fig. 6 Virkningen af ​​Cistanche-glycosid på de aldrende modelmus observeret ved positioneringsnavigationseksperiment

Som vist i figur 7, efterhånden som antallet af træningsdage stiger, stiger antallet af gange, hver gruppe mus krydser platformen gradvist. Sammenlignet med kontrolgruppen faldt antallet af gange, modelgruppemusene krydsede platformen signifikant (P<0.05), while the number of times the positive control group and the Cistanche glycoside group mice crossed the platform slightly decreased.

Fig. 7 Virkningen af ​​Cistanche-glycosid på de aldrende modelmus observeret ved rumudforskningseksperiment

2. 7 Virkning af Cistanche Glycosider på antioxidantniveauer i hjernevæv hos aldrende modelmus

Som vist i figur 8, sammenlignet med kontrolgruppen, var SOD- og CAT-enzymaktiviteterne i hjernevævet hos modelgruppemusene signifikant reduceret (P<0.05). The SOD and CAT enzyme activities in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice were slightly increased, while the MDA content in the brain tissue of the model group mice was significantly increased (P<0.05). The MDA content in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice was slightly reduced.

Kinesisk urtecistanche

3 Konklusion

Denne undersøgelse brugte ekstraktionshastigheden af ​​Cistanche-glycosid som evalueringsindikator og ekstraherede Cistanche-glycosid ved hjælp af den enzymatiske hydrolysemetode. Indholdet af Cistanche-glycosid blev bestemt ved HPLC. Følgende konklusioner blev draget:

1) Når forholdet mellem materiale og væske er 1:1{{10}}, er ekstraktionsfrekvensen 3 gange, ekstraktionstemperaturen er 80 grader, og ekstraktionsreagenset er 1 minut , er ekstraktionshastigheden af ​​Cistanche-glykosider den højeste. Indholdet af cistanche-glycosid i 8 forskellige varianter blev bestemt ved hjælp af et UV-synligt spektrofotometer. Resultaterne viste signifikante forskelle i indhold af cistanche-glycosid mellem forskellige regioner eller varianter. Blandt dem havde Shanxi Beiqi det højeste indhold af cistanche-glycosid, mens Shanxi Heipi Qi havde det laveste indhold af cistanche-glycosid i AA-klassen. For yderligere at etablere et separations- og oprensningssystem for Cistanche-glycosid blev der etableret et fingeraftryk af Cistanche-glycosid ved HPLC. Resultaterne viste, at retentionstiden for Cistanche-glycosid var 10,64 minutter, massekoncentrationen var 1,0~40,0 μG/mL, med god linearitet og en R-værdi på 0.999 8, og HPLC-metoden har god stabilitet og præcision.

2) Virkning af Cistanche deserticola-glycosid fremstillet ved enzymatisk hydrolyse på aldrende modelmus, observer indlærings- og hukommelsesevnerne hos aldersmodelmus og detekter hjernevævsoxidationsniveauer. Resultaterne viste, at sammenlignet med kontrolgruppen forbedrede Cistanche-glykosider signifikant indlærings- og hukommelsesevnerne hos aldersmodelmus efter behandling (P<0.05); Compared with the control group, the activity of SOD and CAT enzymes in the brain tissue of aging model mice significantly increased (P<0.05) after treatment with Cistanche glycosides, while the content of MDA significantly decreased (P<0.05).

Reference:

［1］ Wang Xiaoju. Ekstraktion, separation og aktivitetsundersøgelse af de aktive komponenter af Cistanche glycosid ［D］. Xi'an: Shanxi University, 2005.

［ 2 ］ Wang Guangzhong, Hu Di, Chen Jingbing. Ortogonalt design til at optimere ekstraktionsprocessen af ​​totale flavonoider og totale saponiner af Cistanche-glycosid ［J］. Chinese Patent Medicine, 2004, 26(10): 3-4.

［ 3 ］ Liu Jinhua, Chen Jingran, You Guangfu. Fremskridt inden for farmakologisk forskning om myokardiebeskyttelse af Astragalus ［J］. Chinese Patent Medicine, 2002, 24(8): 623-626.

［ 4 ］ Guo Wei. Farmakologi og klinisk forskningsoversigt over traditionel kinesisk medicinCistanche glycosid ［J］. Shanxi Traditionel Kinesisk Medicin, 2011, 27(11): 52-54.

［ 5 ］ Lu Yanqi, He Xueli. En gennemgang af de kemiske bestanddele og farmakologiske virkninger af Cistanche glycosid ［J］. Journal of Baoding Teachers College, 2004, 17（4）: 40-42.

［ 6 ］ Li Qin, Liu Hong. Farmakologiske virkninger og klinisk anvendelse af Cistanche glycosid ［J］. Chinese Medicine of Traditional Chinese Medicine, 2004, 10（10）: 633-635.

［7］ Jin Jizi. Forskningsfremskridt vedrørende de farmakologiske virkninger og klinisk anvendelse af Cistanche glycosid ［J］. Chinese Medicine of Traditional Chinese Medicine, 2008, 17（20）: 134-135. ［ 8 ］ Chen Jianzhen, Lv Guiyuan, Ye Lei. Forskningsfremskridt vedrørende kemiske bestanddele og farmakologiske virkninger af Cistanche glycosid flavonoider ［J］. Medical Herald, 2009, 28（10）: 1314-1316.

［ 9 ］ Liang Liansheng, Yu Jing. Farmakologiske virkninger af flavonoider i Cistanche glycosid ［J］. Journal of Integrative Chinese and Western Medicine Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases, 2005, 3（12）: 1085-1087.

［10］ Zhang Dongqing, Wang Deqing. Forskningsfremskridt vedrørende biologisk aktivitet af totale flavonoider af Cistanche-glycosid ［J］. China Important Journal, 2010, 35（2）: 253-256.

［11］ Li Y, Guo S, Zhu Y, Yan H, et al. Blomster af Cistanche glycoside membranaceus var. mongholicus som et nyt biprodukt med højt potentiale: fytokemisk karakterisering og antioxidantaktivitet ［J］. Molecules, 2019, 24（3）: 434.

［12］ Butkutė B, Dagilytė A, Benetis R, et al. Mineralske og fytokemiske profiler og antioxidantaktivitet af urtemateriale fra to tempererede Cistanche-glycosidarter ［J］. Biomed. Res. Int., 2018.

［13］ Sharifi-Rad M, Pohl P, Epifano F, et al. Grøn syntese af sølv nanopartikler ved hjælp af Cistanche glycoside tribuloides delile. Rodekstrakt: karakterisering, antioxidant, antibakteriel og anti-inflammatorisk aktivitet ［J］. Nanomaterialer （Basel）, 2020, 10（12）: 2383.

［14］ Wang D, Zhuang Y, Tian Y, et al. Undersøgelse af virkningerne af totale flavonoider af Cistanche-glycosid på åreforkalkningsdannelse og potentielle mekanismer ［J］. Oxid. Med. Celle. Longev., 2012.