Lysfølsomme prodrug nanosamlinger, der rummer en kemoterapeutisk dvalefunktion, forstærker kræftimmunterapi

Abstrakt

Immunterapi kombineret med effektive terapier såsom kemoterapi og fotodynamisk terapi er en vellykket strategi til at aktivere antitumorimmunresponser for forbedret anticancerbehandling. Udvikling af multifunktionelle bionedbrydelige, biokompatible, lavtoksiske, men yderst effektive og klinisk tilgængelige transformerede nano-immunostimulanter er dog stadig en udfordring og er i stor efterspørgsel. Heri rapporterer og designer vi et nyt bærerfrit fotokemoterapeutisk nano-prodrug COS-BA/Ce6 NP'er ved at kombinere tre multifunktionelle komponenter selvsamlede naturligt lille molekyle betulinsyre (BA), et vandopløseligt chitosan-oligosaccharid (COS), og et lavt toksisk fotosensibilisator chlorin e6 (Ce6) for at øge antitumoreffektiviteten af ​​den immunadjuvans anti-PD-L1-medieret cancerimmunterapi. Vi viser, at de designede nanolægemidler rummede en smart og karakteristisk "dvale"-karakteristik i kemoterapeutisk effekt med ønsket lavere cytotoksicitet og flere gunstige terapeutiske egenskaber, herunder forbedret 1 O2-generering induceret af det reducerede energigab af Ce6, pH-respons, god bionedbrydelighed og biokompatibilitet, hvilket sikrer en yderst effektiv, synergistisk fotokemoterapi. Når det kombineres med anti-PD-L1-terapi, kan både nano-coassembly-baseret kemoterapi og kemoterapi/fotodynamisk terapi (PDT) desuden effektivt aktivere antitumorimmunitet ved behandling af primære eller fjerne tumorer, hvilket åbner op for potentielt attraktive muligheder for klinisk immunterapi.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

SØGEORD

Kræftimmunterapi; Nano-immunostimulerende midler; Kemoterapeutisk dvale; Pro-drug; Selvmontering; Naturligt lille molekyle; Betulinsyre; Fotodynamisk terapi

1. Introduktion

Kræftimmunterapi, såsom immuncheckpoint-blokadestrategien ved hjælp af PD-L1 eller CTLA-4 til at bekæmpe kræft ved at aktivere værtens immunsystem, har uden tvivl revolutioneret kræftbehandling1,2. Desværre begrænsede det svage immunrespons og ineffektive terapeutiske virkninger i høj grad dets kliniske udsigter3,4. For nylig har aktuelle undersøgelser afsløret, at en kombination af immunterapi med andre modaliteter såsom kemoterapi5, fotodynamisk terapi (PDT)6, fototermisk terapi (PTT)7 og strålebehandling8, effektivt kan udløse antitumorimmunogenicitet ved at inducere kræftceller til at gennemgå immunogen celledød ( ICD)9, som antyder potentialet for immunmodulation til at aktivere antitumorimmunresponser. Talrige innovative designs af nanomaterialer baseret på disse synergistiske kombinationer af immunterapistrategier har opnået væsentligt forbedret anti-canceraktivitet, herunder uorganiske10, polymer11 og biomimetiske12 nanopartikler (NP'er). Udvikling af multifunktionelle bionedbrydelige, biokompatible, lav toksicitet, men yderst effektive og klinisk tilgængelige transformerede nano-immunostimulanter er dog stadig en stor udfordring og stor efterspørgsel. Naturlige biologiske materialer som nukleinsyrer13, proteiner12, peptider14,15 og små molekylære naturprodukter16,17 har på grund af deres iboende fordele (f.eks. biokompatibilitet, ikke-toksicitet) tiltrukket en betydelig forskningsinteresse for medicinske anvendelser. Især i de senere år er anticancer bioaktive terpenoide naturlige små molekyler (NSM'er) med en selvsamlende funktion blevet opdaget successivt18,19. For eksempel kan betulinsyre (BA), ergosterol (ET) og abietinsyre (AA) selv samles til mikron- eller nanostrukturerede partikler. Disse NSM'er er attraktive byggesten at bruge til at udvikle antitumormidler til synergistisk kemoterapi og PDT. De har vist sig at udvise betydelige fordele ved nem nano-fremstilling, bedre biokompatibilitet og bionedbrydelighed, lavere toksicitet med reduceret leverskade og høj synergisme i antitumorterapi20e23. Dette giver lovende alternativer til udvikling af klinisk tilgængelige oversættelige nano-immunostimulanter til synergistisk immunterapi. Imidlertid førte den generelt stærkere lipofilicitet af disse NSM'er til ineffektiv cellulær endocytose, hvilket svækkede deres anticanceraktivitet og begrænsede deres kliniske værdi til cancerbehandling24. I lighed med de almindeligt rapporterede nanokompositter fremmede de tilsvarende NSMs nano-formuleringer cellulær optagelse for at øge kemoterapeutiske effekter, men øgede også utilsigtet risikoen for uspecifik cytotoksicitet til normale celler22. Derfor er det værd at tænke dybt over, hvordan man maksimerer anticancer-effektiviteten af ​​terpenoid NSM-nano-midler og samtidig minimerer dets toksicitet for normalt væv som et afgørende spørgsmål i den synergistiske immunterapiproces.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Pro-drug-strategier er blevet anvendt i vid udstrækning for at forbedre celleoptagelsen af ​​lipofile små molekyler ved at øge hydrofilicitet25. Generelt har amfifile lægemidler især højere cellulær optagelseseffektivitet end hydrofile eller lipofile lægemidler26. Jo højere cellulær fagocytose, jo bedre terapeutisk effekt24. Således kan udvikling af amfifile terpenoid NSMs pro-drug molekyler være en potentiel metode til at maksimere deres terapeutiske virkninger. Derudover har stimuli-responsive nanolægemidler til det specifikke tumormikromiljø (f.eks. syre, redox-respons) et stort løfte om at kontrollere lægemiddelfrigivelse, hvilket er fordelagtigt til at undertrykke cytotoksiciteten af ​​de kemoterapeutiske lægemidler27,28. I mellemtiden var supramolekylær koassemblering (f.eks. en genudfældningstilgang) en effektiv strategi til at fremstille meget vandopløselige bærerfrie nanolægemidler22,29, som kan forventes at reducere fagocytoseeffektiviteten af ​​amfifile NSM'er en smule til en vis grad og derved svække deres præ- designet cytotoksicitet. Vi antager, at stimuli-responsive og fuldt hydrofile nanolægemidler blev yderligere etableret baseret på amfifile NSM'er pro-drug og effektivt kan undertrykke dets uspecifikke cytotoksicitet til normale celler, mens de stimulerer frigivelsen af ​​meget toksiske amfifile NSM'er i tumorceller, hvilket letter deres dvale i normale væv og aktivering på tumorstedet. Det er vigtigt at vælge den passende vandopløselige og stimuli-responsive forløber for at modificere terpenoid NSM'er for at forberede amfifile pro-drug molekyler. I årevis har chitosan-oligosaccharider (COS), som de nedbrudte produkter af chitosan, ikke kun haft god vandopløselighed og rigelige eOH-ellerNH2-grupper, der fører til et godt pH-respons, men har også gavnlige antitumoraktiviteter ved at forbedre værtens immunfunktion gennem regulering af aktiviteten. af immunceller såsom monocytmakrofager og lymfocytter30,31. Disse garanterer den enorme mulighed for at konstruere stimuli-responsive target nano immunostimulanter til synergistisk immunterapi.

Heri, baseret på ovenstående overvejelser, i vores eksperimentelle design, anvendes en pentacyklisk triterpen-NSM af betulinsyre (BA) som et potent anticancermiddel32, COS blev introduceret til at syntetisere et amfifilt COS-BA-molekyle for at forbedre den kemoterapeutiske effekt. Chlor e6 (Ce6), en meget anvendt fotosensibilisator med meget lav/ingen mørk toksicitet33, blev anvendt til at konstruere et fuldstændigt vandopløseligt bærerfrit lysfølsomt prodrug COS-BA/Ce6 NP'er ved anvendelse af en direkte samsamlingsstrategi. COS-BA/Ce6 NP'er kombinerede to terapeutiske modaliteter, kemoterapi og fotodynamisk terapi (PDT), som effektivt kan øge præsentationen af ​​tumor-afledte antigener til T-celler, hvilket genererer robuste immunologiske responser ved hjælp af en immunadjuvans anti-PD-L1 at forårsage højeffektiv og synergistisk antitumor kemoterapi/PDT/immunterapi (skema 1). De konstruerede COS-BA/Ce6 NP'er viste en smart dvalefunktion med snigende kemoterapieffekter, dvs. ikke-bestrålede co-assembled NP'er viste bemærkelsesværdigt hæmmet in vitro cytotoksicitet sammenlignet med amfifil COS-BA, hvad enten det var mod cancer eller normale celler. Ved at tilskrive den karakteristiske pH-responsive adfærd udfører den lav toksicitet og biosikkerhed for normalt væv in vivo, men er meget toksisk for tumorvæv på grund af den stimulerende frigivelse af hyperaktiv COS-BA i det svagt sure tumormikromiljø34. Så vidt vi ved, er de designede nanolægemidler, der rummer denne kemoterapeutiske hvilefunktion, stadig sjældent rapporteret. I mellemtiden har nanodruget flere gunstige terapeutiske egenskaber såsom forbedret 1 O2-generering ved at reducere energigabet (DEST) af Ce6, hurtig biologisk metabolisme og forbedret tumorakkumulering, hvilket førte til en effektiv og sikker antitumorkombination af kemoterapi og PDT-behandling. Endnu vigtigere er det, at både NP-baseret kemoterapi og kemoterapi/PDT-systemer effektivt kunne aktivere antitumorimmunitet ved at lette spredningen af ​​TNF-a og IFN-g-producerende CD8þ T-celler i primære eller fjerne tumorer. Vores foreslåede bionedbrydelige, biokompatible, unikke sovende, biosikre og højeffektive fotokemoterapeutiske nanolægemiddel opnår betydelige systemiske immunterapeutiske responser, hvilket åbner attraktive muligheder for klinisk anvendelse til behandling af fjern- eller metastatisk cancerterapi.

Skema 1 PDT og kemoterapi af co-assembled COS-BA/Ce6 NP'er forstærkede anti-PD-L1 for at inducere en systemisk antitumor immunterapi. Introduktionen af ​​vandopløselig COS kan effektivt øge den kemoterapeutiske aktivitet af BA (afbildet som et halvsværd), hvilket resulterer i et hyperaktivt COS-BA amfifilt prodrug (langt sværd). Når de blev samlet sammen med fotosensibilisator Ce6 (skede), havde de skalstrukturerede og pH-følsomme nanosamlinger en smart og karakteristisk "dvale"-funktion med hæmmet kemoterapeutisk toksicitet for normalt væv. Men når først det ankom og blev stimuleret af det sure (Hþ) tumormikromiljø, vil det meget aktive amfifile prodrug COS-BA blive frigivet, hvilket resulterer i betydelig kemoterapi. Derudover udviste de konstruerede co-assemblies fremragende PDT-aktivitet med forbedret singlet oxygen (1 O2)-generering induceret af det reducerede energigab mellem singlet- og triplet-exciterede tilstande (DEST) af Ce6. Kombineret med en anti-PD-L1 checkpoint blokade kan frigivelsen af ​​tumorassocierede antigener efter kemoterapi/PDT behandling effektivt aktivere en systemisk antitumor immunrespons til fjern cancer immunterapi.

2. Materialer og metoder

2.1. Syntese af COS-BA

Betulinsyre (40 mg, 0,1 mmol), EDC (38 mg, 0,2 mmol) og NHS (17 mg, 0,15 mmol) ) blev opløst i 3 ml N,N-dimethylformamid (DMF). Efter omrøring ved stuetemperatur i 3 0 minutter blev 96 mg COS-vandopløsning (1 ml) forsigtigt tilsat dråbevis til blandingen og omrørt i 24 timer. Derefter blev reaktionsblandingen fortyndet med CH2Cl2 og ekstraheret gentagne gange. CH2Cl2-laget blev inddampet og oprenset på en silicagelsøjle. Den uomsatte BA blev fjernet indledningsvis under anvendelse af petroleumsether:acetone (5:1, v/v) som eluent og derefter ændret til 3:1 for at give hvid COS-BA (udbytte: 42%), hvor COS blev identificeret som dimer ( nZ 2). 1H NMR (40{{70}} MHz, CDCl3) d: 8,98 (1H, s, BA-28 O]CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H-30). 13C NMR (100 MHz, CDCI3) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 , 69,32, 69,22, 65,25, 58,14, 55,62, 55,21, 53,65, 53,22, 50,52, 45,96, 44,32, 44,11, 41,85, 3,7, 3,7, 3,7, 3,8, 3,8, 3,8, 3,8, 3,8, 3,8, 3,8, 3,7, 3,8, 3,8, 3,8, 3,8, 3,8, 3,8, 3,8, 3,8, 3,7, 3,8, 3,8, 3,7, 3,8. 04, 36,39, 35,31, 34,21, 31,81, 31,54, 31,17, 30,28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).

2.2. Fremstilling af COS-BA/Ce6 NP'er

Samlede COS-BA/Ce6 NP'er blev fremstillet ved en-trins genudfældningsmetode. Typisk blev 5 mL Ce6 (33 mmol/L) og 40 mL COS-BA (33 mmol/L) DMSO-opløsninger først blandet. Efterfølgende blev blandingen injiceret hurtigt i 1 ml vand indeholdende 10 ml NaOH (50 mmol/L) under ultralydbehandling (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, Kina). Efter sonikering i 10 minutter blev COS-BA/Ce6 NP'erne opnået ved centrifugering ved 13,000 rpm (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, Kina) i 25 minutter. Andre formuleringer med forskellige forhold mellem COS-BA og Ce6 blev fremstillet ved den samme procedure med et konstant NaOH til Ce6-molforhold på 3:1.

2.3. Cellelinjer

Humane MCF-7, HepG2, LO2 og muse 4T1, L929 cellelinjer leveres af Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS (Kina). MCF-7, HepG2 og LO2 blev dyrket i DMEM-medium med 10 % føtalt bovint serum (FBS, Gibco) og 1 % penicillin-streptomycin-antibiotikum (Life Technology, USA) ved 37 C. 4T1 og L929 blev dyrket i RMPI-1640 medium med samme forhold som ovenfor.

2.4. Studier af cellulær optagelse og endocytiske veje

Til undersøgelse af cellulær optagelse blev 4T1- eller LO2-celler inkuberet med fri Ce6 eller COS-BA/Ce6 NP'er (ækvivalent koncentration af Ce6: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/ml, BA: 10 0,8 mg/ml) til forskellige tidspunkter. Efter vask, fiksering og DIPA (#D9542, Sigma) farvning blev cellerne afbildet under et fluorescerende inverteret mikroskop (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, Kina). Fluorescensintensiteten blev bestemt ved anvendelse af flowcytometri under anvendelse af Guava EasyCyte mini-systemet (Merck Millipore, Tyskland). Til kvantificering af optagelseseffektiviteten blev den cellulære akkumulering af BA og COS-BA målt ved hjælp af HPLC (Agilent 1200, USA). Typisk blev 4T1-celler behandlet med fri COS-BA eller BA (ækvivalent BA: 25 mg/ml) i 0,5 og 3 timer. Efter vask med PBS blev cellepelleterne høstet og gennemgik ultralydshomogenisering (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, Kina) til cellelyse. Derefter blev COS-BA eller BA ekstraheret med chloroform til HPLC-analyse efter lyofilisering af prøverne. Den mobile fase var vand (0,2% phosphorsyre) og acetonitril med en strømningshastighed på 1,0 ml/min, og tilsvarende volumenforhold var 60:40 og 15:85 (v/v) til analyse af henholdsvis COS-BA og BA . Detektionsbølgelængden var 213 nm. Til undersøgelse af endocytiske veje for COS-BA/Ce6 NP'er blev 4T1-celler udsået i 6-brøndplader og inkuberet i 24 timer, før de blev forbehandlet med forskellige endocytosehæmmere i 30 minutter, inklusive en mikropinocytosehæmmer [50 mmol/L , ethylisopropylamilorid (EIPA) (#N132356, Aladdin)], en clathrin-medieret endocytosehæmmer [20 mmol/L, chlorpromazin (#C7010, Solarbio)], en caveolae-medieret endocytosehæmmer [25 mmol/L, nystatin ( #IN0260, Solarbio)], og en lysosomforsuringshæmmer [50 mmol/L, chloroquinphosphat (#C9720, Solarbio)]35. Derefter blev cellerne yderligere dyrket med 2 ml COS-BA/Ce6 NP'er (Ce6: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/ml) i 2 timer og afbildet under FIM (UP Optotech). Cellerne inkuberet uden endocytisk inhibitor ved 37 C blev sat som kontrol og ved lav temperatur inkubation (4 C) til evaluering af den energiafhængige endocytose. I mellemtiden blev den gennemsnitlige fluorescensintensitet af celler også bestemt ved flowcytometri.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Cytotoksicitet assay

4T1-celler blev podet i en 96-brøndplade. Derefter blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af COS-BA NP'er i 24 timer. Derefter blev 10 ml MTT (#M158055, Aladdin) farvestof (5 mg/ml) tilsat til brønden og inkuberet i yderligere 4 timer, og derefter blev 150 ml DMSO tilsat for at opløse formazan-krystallerne . Absorbansen af ​​hver brønd ved 492 nm blev registreret af en mikropladelæser. For bestrålingsgruppen blev cellerne behandlet med lægemidler i 4 timer, derefter bestrålet i 10 minutter med 675  10 nm lys og inkuberet i yderligere 20 timer. Cytotoksiciteten af ​​COS-BA/Ce6 NP'er (1 mg/ml Ce6 svarer til 11,5 mg/mL COS-BA og 6,4 mg/ml BA) mod andre celler (MCF-7, HepG2, LO2 og L929) blev også bestemt ved det samme MTT-assay kun med et andet medium. I mellemtiden blev kombinationsindekset beregnet af softwaren CompuSyn 2.0 ved hjælp af Chou Talalay-sætningsberegning36.

2.6. Dyremodeller

Alle eksperimentelle procedurer blev udført i henhold til protokollerne godkendt af Harbin Medical University Animal Care and Use Committee. 4T1-celler blev suspenderet i RMPI-1640-medium og subkutant injiceret på højre bagside af hver hun BALB/c-mus (18e22 g, 6e7 uger gammel).

2.7. In/ex vivo fluorescensbilleddannelse

En 200 ml COS-BA/Ce6 NPs 5 % glucoseopløsning (ækvivalent Ce6: 0,35 mg/ml, COS-BA: 4,02 mg/ml) blev injiceret gennem halevenen i tumorbærende mus. Derefter blev fluorescensbilleddannelse af tumorsteder på et forudbestemt tidspunkt udført under anvendelse af et AniView 100/600 multi-model in vivo dyrebilleddannelsessystem (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Kina) med excitationen ved 630 nm. Efter 24 timer efter injektion blev de vigtigste organer (hjerte, lever, milt, lunge og nyre) og tumor opsamlet til ex vivo fluorescensbilleddannelse. Desuden blev ex vivo-fluorescensbillederne af tumorer og større organer på forskellige tidspunkter efter iv-injektioner af Ce6 eller COS-BA/Ce6 NP'er også evalueret.

2.8. In vivo kemoterapi/PDT

4T1-bærende mus (75e100 mm3) er tilfældigt opdelt i seks grupper (n Z 5): 1) 5 % glucoseopløsning; 2) Ce6; 3) Ce6 med bestråling; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, hvor BA: 22,3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6 NP'er; 6) COS-BA/Ce6 NP'er med bestråling. For hver gruppe injiceres mus med 200 ml COS-BA/Ce6 NP'er (ækvivalent Ce6: 3,5 mg/kg af kroppen) gennem halevenen på dag 0, 2 og 4. For bestrålingsgrupperne efter 4 timer post-injektion efter hver administration blev alle mus bedøvet med isofluran, og tumorstederne blev bestrålet med 675  10 nm (150 mW/cm2) lys i 15 min. Tumorvolumener og kropsvægte af mus registreres også hver anden dag. Tumorvolumener beregnes ved formlen: VZ width2 length/2. Efter 14 dages behandling blev tumorerne skåret ud og vægtet for at beregne tumorhæmningsforholdet (TIR) ​​ved den almindeligt anvendte ligning: TIRZ (1 prøve/kontrol) 100%. Hvor prøve og kontrol var henholdsvis den gennemsnitlige tumorvægt af hver behandlet gruppe og 5% vandig glucoseopløsningsgruppe.

2.9. In vivo kemoterapi/PDT/immunterapi

For at demonstrere potentialet af COS-BA/Ce6 NP'er kombineret med immunterapi, blev den bilaterale tumormodel designet gennem subkutan injektion af 4T1-celler i venstre og højre flanke. Da tumorerne nærmede sig 75e100 mm3, blev musene opdelt i fem grupper. (1) Kontrol; (2) COS-BA/Ce6 NP'er (COS-BA Z 40,2 mg/kg, hvor BA Z 22,3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6 NP'er þ lys; (4) COS-BA/Ce6 NP'er þ anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NP'er þ anti-PD-L1 þ lys. På dag 0 blev 200 ml 5% glucoseopløsning (Gruppe 1) eller COS-BA/Ce6 NP'er (Ce6Z 3,5 mg/kg) (Gruppe 2, 3, 4, 5) injiceret iv i mus. Efter 4 timer efter injektion blev de højre tumorer i gruppe 3 og 4 bestrålet i 15 minutter. Musene blev bedøvet med isofluran og rullet på den ene side for at undgå at blotlægge de venstre tumorer. Derefter blev anti-PD-L1-antistof (BioXcell, produktnummer: BE0101, klonnummer: 10F.9G2) injiceret iv i mus for gruppe 4 og 5 på dag 2, 4 og 6 (15 mg pr. mus pr. injektion). Længden og bredden af ​​hver tumor blev overvåget hver anden dag. Efter 14 dages behandling blev blodserumet fra mus opsamlet for at evaluere interferon-gamma (IFN-g) (#KMC4021) og tumornekrosefaktor (TNF-a) (#BMS607-3) ved hjælp af ELISA-assay (eBioscience) ). Tumorerne blev opsamlet, dissocieret, behandlet med røde blodlegemer lyseringsbuffer og vasket med PBS ved centrifugering. Derefter blev cellesuspensionen farvet med anti-CD3-FITC (#MA1-10187, klon 145-2C11, eBioscience) og anti-CD8a-PE (#12-0081-85, klon 53-6.7, eBioscience). Bagefter blev den cytotoksiske T-lymfocyt (CTL) infiltration i højre og venstre tumor efter forskellige behandlinger evalueret ved flowcytometri.

3. Resultater og diskussioner

3.1. Syntese, fremstilling og karakterisering af COS-BA/Ce6 NP'er

I denne undersøgelse designer vi et nyt prodrug lille molekyle COS-BA baseret på vandopløseligt chitosan oligosaccharid (COS), som kan hæve den kemoterapeutiske aktivitet af pentacyklisk triterpen betulinsyre (BA) ved at forbedre celleoptagelsen gennem øget hydrofilicitet. COS (polymerisationsgrad, DP: 2e6) anvendt her blev fremstillet ved vores tidligere beskrevne metode30. Derefter blev COS-BA syntetiseret via en dehydreringskondensationsreaktion. Kombineret med hovedkomponentanalysen af ​​COS blev den kemiske struktur af COS-BA antaget at være et disaccharid (DP:2) modificeret BA (understøttende information Fig. S1), hvilket blev bekræftet af 1H NMR, 13C NMR og ESIeMS (Understøttende information, fig. S2eS4). Analyse af den repræsentative 1H-NMR viste det distinkte protonsignal af COS omkring 2,64e3,93 ppm og C]CH2-toppe (4,60, 4,73 ppm) af BA, hvilket viser den vellykkede syntese af COS-BA (fig. 1A). Til fremstilling af det sammensatte synergistiske antitumorreagens COS-BA/Ce6 NP'er blev der anvendt en alsidig genudfældningstilgang ved at samarbejde med en højeffektiv fotosensibilisator Ce6. Ved at ændre de indledende molære forhold kunne begge COS-BA/Ce6-samsamlingsformuleringer danne sfæriske nanostrukturer med modulerede størrelser (fig. 1B og understøttende information fig. S5). På tværs af forskellige inputforhold af COS-BA/Ce6 var de hydrofile diametre af COS-BA/Ce6 NP'er nær 200e300 nm med et negativt z-potentiale. I betragtning af, at NP'er fremstillet ved en formulering på 8:1 viste et lavere polydispersitetsindeks (PDI, 0,143) med en relativt mindre størrelse (249 nm), var en tilstrækkelig mængde kemoterapeutisk middel COS-BA også påkrævet til den kombinatoriske behandling. Derfor valgte vi formuleringerne af COS-BA/Ce6 (8:1) til følgende undersøgelse. Under denne optimering udviste COS-BA/Ce6 NP'er smalle størrelsesfordelinger (fig. 1C) og god vandopløselighed, hvilket indikerer dens kolloide natur (fig. 1D). For at udforske årsagerne bag denne vellykkede samsamling blev den primære selvsamlingsadfærd af fri COS-BA undersøgt ved hjælp af scanningselektronmikroskopi (SEM) (fig. 1E), hvilket antydede, at COS-BA kunne danne en meget ensartet nano- sfære på w168 nm, hvilket antyder, at den kemiske modifikation af COS ikke ændrer selvsamlingsevnen af ​​BA selv (understøttende information Fig. S6). Det er den egenskab, der til sidst inducerer den vellykkede konstruktion af co-assemblies. Især, bortset fra den faste nanostruktur bekræftet af transmissionselektronmikroskopi (TEM), viste COS-BA/Ce6 NP'er en tydelig skalstrukturfri COS-BA NP'er, og den gennemsnitlige skaltykkelse var cirka 2,35 nm. Den anden fysisk-kemiske karakterisering er opsummeret i fig. 1F. Desuden viste COS-BA/Ce6 NP'er et negativt z-potentiale på 5,38 mV og en hydrodynamisk størrelse på w249 nm, højere end den opnået fra SEM (w182 nm). Samtidig var Ce6-belastnings- og indkapslingseffektiviteten henholdsvis 8,1 og 96 %, som bestemt ved højtydende væskekromatografi (HPLC). Også FT-IR-data (fig. 1G) bekræftede yderligere denne samsamling, fordi COS-BA/Ce6 NP'er udviste de karakteristiske C]N-, CeN- og C]CH-toppe for Ce6, der fremkom ved 1633, 1078 og 633 cm1 , henholdsvis.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

3.2. Samlet mekanisme og dannelsen af ​​skalstrukturen

Efterfølgende, for bedre at forstå co-assembly-mekanismen, undersøgte vi først den primære dannelsesproces af NP'er. Vi fandt ud af, at samsamlingen af ​​COS-BA med Ce6 kan være spontan, fordi disse to arter også kunne danne sfærisk nanostruktur, selvom uden sonikering (Supporting Information Fig. S7), hvilket kan skyldes den negative Gibbs frie energiændring (DG) ) i fællesforsamlinger37. Denne spontane samling antydede også en stærkere intermolekylær interaktion mellem COS-BA og Ce6. Generelt er de intermolekylære interaktioner i supramolekylære selv (eller co-) samlinger ikke-kovalent p‒p-stabling, hydrogenbinding og van der Waals-kræfter 38,39. Til denne analyse undersøgte vi derefter UV-absorptionen af ​​COS-BA/Ce6 NP'er (fig. 1H og F), hvilket antydede et rødforskudt Soret (410 nm) og Qy (667 nm) bånd sammenlignet med fri Ce6 (henholdsvis 405 og 665 nm). I mellemtiden kan den signifikante rødforskudte karakteristiske absorption af COS-BA også findes, hvilket indikerer en mulig intermolekylær pp-stabling mellem COS-BA og Ce640. Efter inkubation med det overfladeaktive stof natriumdodecylsulfat (SDS, 0,2% w/v) (understøttende information Fig. S8), viste COS-BA/Ce6 NP'er desuden et nyligt blåt-skiftet Qy-bånd ved 641 nm og genvandt dramatisk fluorescens, hvilket demonstrerede at de hydrofobe interaktioner også bidrog til samsamlingen28. Siden disse associative ikke-kovalente interaktioner udviste co-samlinger bemærkelsesværdig fluorescensslukning (98,2%) i vand (fig. 1I). Samlet set er det rimeligt at tro, at p‒p-stabling og hydrofobe interaktioner kan være de vigtigste drivkræfter for konstruktionen af ​​co-assemblies. Bagefter, for yderligere at visualisere samlingsprocessen mere intuitivt og afsløre de underliggende årsager til, at skalstrukturerede NP'er kan dannes, udførte vi en simplificeret molekylær dynamik (MD) simuleringsmodel indeholdende 16 optimerede COS-BA-molekyler og yderligere to Ce6 i en vandkasse . Indledningsvis evaluerede vi den mulige interaktion/binding af COS-BA-selvsamlinger inden for 5 ns simuleringstid (fig. 2A og understøttende information fig. S9). Vi fandt ud af, at bortset fra adskillige intramolekylære hydrogenbindinger i COS-fraktionen, kunne adskillige par intermolekylære H-bindinger mellem COS-BA også observeres (fig. 2B og understøttende information fig. S10), hvilket indikerede, at hydrogenbinding kan være én. af de vigtigste drivkræfter for dannelsen af ​​COS-BA NP'er. Særligt interessant, i COS-BA-selvsamlinger danner alle COS-BA-molekyler en tilsyneladende symmetrisk struktur (fig. 2C). Dette fascinerende fænomen motiverede os til at udforske det mulige forhold mellem denne egenskab og dannelsen af ​​skalstrukturerede COSBA NP'er. Derefter forsøgte vi at udvide boksens enheder. Overraskende nok blev de forbundne kasser bestående af COS-BA-molekyler arrangeret på en regelmæssig måde, hvilket resulterede i en "ortogonal" hul netværksstruktur (understøttende information Fig. S11). Endnu vigtigere er det, at vi tilfældigt beregnede tykkelsen af ​​skalmolekylerne og fandt, at de var i overensstemmelse med TEM (w2.35 nm) (fig. 2D). Denne tendens til at danne hule netværksstrukturer kan være ansvarlig for dannelsen af ​​skalstrukturerede NP'er. For at teste denne idé blev MD-strukturen af ​​COS-BA/Ce6-samsamlinger simuleret (Fig. 2E og Understøttende Information Fig. S12). I lighed med COS-BA-selvsamlinger blev der også fundet et stort antal intramolekylære og intermolekylære H-bindinger i co-samlingerne (fig. 2F og understøttende information fig. S13). Derudover blev den mulige pp-stabling mellem C]C af COS-BA og den aromatiske ring af Ce6 observeret i co-samlingerne (fig. 2G), hvilket er i overensstemmelse med data fra tidligere UV-undersøgelser. Efter at have udvidet antallet af kasser, kan lignende hule netværksstrukturer stadig findes, kun med reduceret regelmæssighed og ortogonalitet (understøttende information Fig. S14). Dette kan være den mulige årsag til den uensartede morfologi af COS-BA/Ce6 NP'er sammenlignet med COSBA NP'er. Desuden er den molekylære skal-lag-afstand også tæt på skaltykkelsen (w2,35 nm) af NP'er som set ved hjælp af TEM (fig. 2H). Samlet spekulerede vi i, at dannelsen af ​​skalstrukturerede COS-BA/Ce6 NP'er eller COS-BA NP'er i vid udstrækning kan tilskrives denne tendens hos molekyler til at samle sig i hule skalnetværksstrukturer.

Figur 1 Fremstilling og karakterisering af chitosan-oligosaccharider-modificeret betulinsyre (COS-BA) prodrug-medierede nano-samlinger COS-BA/Ce6 NP'er. (A) De amplificerede nøglepositioner af 1H NMR af COS-BA. (B) Forberedelse af sammenbyggede COS-BA/Ce6 NP'er med forskellige COS-BA/Ce6-forhold. (C) Størrelsesfordeling af COS-BA/Ce6 NP'er ved hjælp af COS-BA og Ce6 (molforhold, 8:1) som byggesten. (D) Vandopløseligheden og Tyndall-effekten af ​​co-assemblies indikerer en kolloid natur. (E) SEM- og TEM-billeder af gratis COS-BA-selvsamlinger og co-monterede COS-BA/Ce6 NP'er. (F) Sammenfatning af fysisk-kemiske egenskaber af COS-BA/Ce6 NP'er. (G) FT-IR-spektre, (H) UV Vis-spektre og (I) fluorescensemissionsspektre af fri Ce6, COS-BA og sammenbyggede COS-BA/Ce6 NP'er i vand.

Figur 2 Strukturer af (A) COS-BA-selvsamlinger og (E) co-monterede COS-BA/Ce6 NP'er efter simulering af molekylær dynamik (MD) i 5 ns med et strukturelt enhedsmolforhold på 8:1 (COS-BA) /Ce6, beregnet ud fra Ce6-belastningseffektivitet). Linjemodellen blev brugt til H2O, og stavmodellerne repræsenterer COS-BA- eller Ce6-molekyler, hvor C-atomerne i Ce6 er mærket med lilla. Hydrogenbindingsinformationen mellem COS-BA-molekyler i (B) dens selvsamlinger og (F) COS-BA/Ce6 NP'er-samsamlinger. (C) Den tilsyneladende symmetriske struktur af COS-BA molekylære arrangement efter MD simulering. (G) Mulige molekylære interaktioner mellem COS-BA og Ce6 viser potentiel pp-stabling. Den angivne tykkelse af skalmolekylerne i en "ortogonal" hul netværksstruktur efter forlængelse af tilsvarende MD-kasser af (D) frie COSBA-selvsamlinger og (H) COS-BA/Ce6 NP'er-samsamlinger.

3.3. Energimekanisme for forbedret 1 O2-generering

Dernæst undersøgte vi yderligere dannelsen af ​​singlet oxygen (1 O2), en af ​​de kritiske reaktive oxygenarter (ROS) af PDT-ydeevne ved at bruge DPBF (1,3-diphenylisobenzofuran) som en sonde. Efter vedvarende bestråling af blandingsopløsningerne af COS-BA/Ce6 NP'er med DPBF faldt UV-absorptionen af ​​DPBF i intensitet, hvilket indikerer 1 O2-generering (fig. 3A). Efter sammenligning med methylenblåt (MB) referencen blev F ( 1 O2) af COS-BA/Ce6 NP'er beregnet som 0.26, lidt højere end fri Ce6 (FZ0.19) (Fig. 3B). Generelt vil energien, der absorberes af fotosensibilisatorer, gennemgå tre afslapningsveje, der involverer fluorescens, varmeeffekt via vibrationsafslapning og ROS-generering gennem en intersystem-krydsning (ISC)41. I overensstemmelse med den signifikant slukkede fluorescensemission fremmede COS-BA/Ce6 NP'er heller ikke nogen opvarmningseffekt i vand (understøttende information Fig. S15), hvilket indebar en forbedret ISC-proces efter samsamling af Ce6 med COS-BA, hvilket førte til den forbedrede 1 O2 generation. For yderligere at belyse den molekylære mekanisme af en sådan effekt, forsøgte vi at optimere og beregne den mulige enkelt-molekyle model af COS-BA/Ce6 bestående af potentiel pp stabling opnået fra MD simulering ved tæthed funktionel teori (DFT) (fig. 3C). . Utroligt nok viste COS-BA/Ce6 en observerbar rødforskudt UV-absorption på 581,24 nm end fri Ce6 (579,30 nm), hvilket indikerer forekomsten af ​​pp-stabling (fig. 3D). Selvom den energiminimerede geometri af COS-BA/Ce6 viste små strukturelle forskelle med den indtastede MD-konfiguration, var den karakteristiske pstacking mellem C]C- eller C]O-bindinger af COS-BA med porfinringen af ​​Ce6 stadig observerbar, hvilket yderligere bekræftede, at ovenstående p‒p-stabling er mulig. I mellemtiden er det for nylig blevet demonstreret, at den øgede elektrondonerende effektivitet ved p‒p-stabling kunne lette ISC-processen42, mens ISC-hastigheden (KISC) er proportional med (1/DEST) 2,43. Det vil sige, at fotosensibilisatorens lavere energigab (DEST) vil forbedre ISC-processen, hvilket fremmer effektiv ROS-generering. Vi beregner efterfølgende den laveste exciterede singlettilstand (S1) og triplettilstanden (T1) af henholdsvis Ce6 og COS-BA/Ce6 (fig. 3E). Resultaterne indikerede, at COS-BA/Ce6 viste en reduceret DEST på 1,1892 eV sammenlignet med fri Ce6 (1,2001 eV), hvilket bekræfter den forbedrede ISC-proces. Reduktionen af ​​DEST er nyttig for 1 O2-produktion, som også er blevet verificeret i andre nanofotosensibilisatorer44. Samlet ser p-stablingen ud til at reducere DEST af Ce6 efter samsamling med COS-BA, hvilket fører til forbedret 1 O2-generering.

Figur 3 Energimekanisme for forbedret 1 O2-generering induceret af COS-BA/Ce6 NP'er. (A) UV Vis-spektre af fotonedbrydning af 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) efter langvarig bestråling af COS-BA/Ce6 NP'er. (B) I første-ordens plots af DPBF UV-absorptionsændringer (DOD) blev 1 O2-udbyttet vurderet under anvendelse af methylenblåt (MB) (FZ 0.52) i DMSO som referenceforbindelsen. (C) Energiminimerede strukturer af en mulig enkelt-molekyle COS-BA/Ce6-model set fra siden og forfra, som blev opnået i henhold til den indledende molekylære konfiguration mellem Ce6 med COS-BA efter MD-simulering og efter DFT-beregninger. (D) Forudsagte UV Vis absorptionsspektra overgange (lodrette søjler) af fri Ce6 og en optimeret COS-BA/Ce6 model. (E) Beregnede energiniveauer for henholdsvis deres laveste exciterede singlettilstand (S1) og laveste triplettilstand (T1), [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Hvor DEST blev beregnet som ES1 ET1.

3.4. Dvalekarakteristika for kemoterapi

Bagefter, for at validere designkonceptet i denne undersøgelse, at udvikling af amfifilt COS-BA-molekyle effektivt kunne øge den terapeutiske effekt af BA ved at forbedre celleoptagelsen gennem øget hydrofilicitet og i mellemtiden yderligere konstruere stimuli-responsive og fuldt hydrofile COS-BA/Ce6 NP'er lettede dets dvale i normalt væv og aktivering i tumorsteder. For at teste denne hypotese undersøgte vi først lægemiddelfrigivelsesadfærden for COS-BA/Ce6 NP'er i forskellige bufferopløsninger (fig. 4A). Resultaterne indikerede, at COS-BA/Ce6 NP'er viste en pH-responsiv adfærd med en kumulativ Ce6-frigivelse på henholdsvis 88% ved pH 5,6 og 57% ved pH 7,4 efter 24 timer. Denne funktion opstod sandsynligvis fra ødelæggelsen af ​​adskillige hydrogenbindinger, der eksisterede i COS-BA/Ce6 NP'er efter introduktionen af ​​sur Hþ45, hvilket fører til øget Ce6-frigivelse (fig. 4B). Dette blev yderligere bekræftet af adskillelsen af ​​COS-BA/Ce6 NP'er efter inkubation i sure miljøer direkte (fig. 4C). Denne pH-responsive egenskab kan være gavnlig for en effektiv antitumorterapi på grund af det svagt sure tumormikromiljø34. I mellemtiden havde COS-BA/Ce6 NP'er bedre stabilitet, fordi der ikke kunne observeres væsentlige størrelses- eller PDI-ændringer efter inkubation i PBS og 1640-RMPI cellekulturmedium i 10 dage (understøttende information, fig. S16), hvilket ville være vigtigt for deres potentielle anvendelse til yderligere biomedicinske anvendelser. Efterfølgende blev yderligere undersøgelser udført ved at evaluere cytotoksiciteten af ​​frit lipofilt BA (kontaktvinkel q: 133,3) og amfifilt COS-BA (q: 52) (fig. 4D) ved hjælp af en standard methylthiazolyl-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assays. Som forudsagt, enten for 4T1-kræftceller eller normale LO2-hepatocytter, har individuel COS i det væsentlige ingen anticanceraktivitet ved relativt lave doser. Dette kan skyldes, at anti-spredningseffekterne af COS kun aktiveres via inducerende NF-kB-signalvej ved høje koncentrationer (ca. på milligramniveau)30. Mens COS-BA udfører bemærkelsesværdigt forbedret cytotoksicitet med ekstremt lave IC50-værdier (6,03 mg/ml for 4T1 og 9,92 mg/ml for LO2) sammenlignet med dem for BA (17,63 mg/ml for 4T1 og 20,53 mg/ml for LO2) endda ved samme massekoncentrationer (fig. 4E og J). De frembragte resultater antydede, at modifikation af vandopløseligt COS i høj grad øger den cellulære optagelseseffektivitet af lipofilt BA, hvilket fører til den stærke anticanceraktivitet af COS-BA. For at kvantificere optagelseseffektiviteten blev akkumuleringen af ​​BA eller COS-BA i 4T1-celler direkte bestemt ved HPLC (understøttende information Fig. S17). Resultaterne understøttede klart, at amfifil COS-BA udviser en signifikant højere optagelse end fri BA (ca. 3.6-fold efter 3 timers inkubation), hvilket viser den øgede kemoterapeutiske aktivitet af COS-BA. Ovenstående konklusion blev yderligere understøttet af den signifikant forbedrede cytotoksicitet af amfifil COSBA mod HepG2 og MCF-7 cancerceller (understøttende information Fig. S18), som er godt i overensstemmelse med designkonceptet. Efter samsamling med Ce6 fandt vi ud af, at COS-BA/Ce6 NP'er uden bestråling udviser bemærkelsesværdigt hæmmet cytotoksicitet mod 4T1-kræftceller sammenlignet med den tilsvarende COS-BA, især ved 11,5 mg/ml, men den grundlæggende PDT-aktivitet blev ikke påvirket ( fig. 4F). For at validere dette fænomen mere fuldstændigt undersøgte vi yderligere in vitro cytotoksiciteten af ​​COS-BA/Ce6 NP'er mod andre cancerceller, herunder MCF-7 og HepG2. Interessant nok udviste amfifil COS-BA meget stærkere cytotoksicitet mod MCF-7-celler (Fig. 4G), men den kemoterapeutiske aktivitet faldt signifikant efter co-assembly med Ce6, dvs. ikke-bestrålede COS-BA/Ce6 NP'er. Lignende resultater blev også observeret i HepG2-celler kun med et lille fald (fig. 4H). For yderligere at understøtte ovenstående konklusioner evaluerede vi også de kemoterapeutiske virkninger af nano-samlinger og COS-BA mod normale musefibroblast-L929-celler og humane LO2-hepatocytter (fig. 4I). Resultaterne indikerede, at de samlede COS-BA/Ce6 NP'er signifikant reducerede det oprindelige meget toksiske amfifile lægemiddel COS-BA, hvilket viste fremragende biokompatibilitet. Ved at analysere cytotoksiciteten var IC50-værdierne for den amfifile COS-BA signifikant lavere end den for de sammenbyggede COS-BA/Ce6 NP'er uanset cancer eller normale celler (fig. 4J). Det vil sige, at konstruering af fuldstændig hydrofile og stimuli-responsive nano-samsamlinger effektivt kan undertrykke den høje cytotoksicitet af amfifilt lægemiddel COS-BA på forhånd. I betragtning af den karakteristiske pH-responsive egenskab ser det ud til, at COS-BA/Ce6 NP'er vil være i dvale i normalt væv med ønsket lav kemoterapitoksicitet, men aktive i tumorvæv på grund af deres stimulerende frigivelse af meget giftig COS-BA i den svagt sure tumor mikromiljø. I modsætning til den bredt rapporterede neofunktionalisering af kemoterapeutiske reagenser, der har forbedret anticanceraktivitet22,23, udviser amfifile COS-BA-medierede nanosamlinger ikke kun en smart "dvale"-karakteristik med snigende kemoterapieffekter, men bevarer også specialiseret PDT-aktivitet, der viser et enormt potentiale til smart antitumorterapi.

Figur 4 (A) In vitro Ce6-frigivelsesprofiler fra COS-BA/Ce6 NP'er i PBS (pH 7,4, 6,5 eller 5,6) indeholdende Tween 80 (0,5 %, v/v) ved 37 C. (B) Den mulige pH-reagerende mekanisme, som Hþ udløser demontering af NP'er. (C) Demontering af COS-BA/Ce6 NP'er efter direkte inkubation i ca. pH 4.0 vand. (D) Kontaktvinklen for henholdsvis fri BA, Ce6, COS-BA og COS-BA/Ce6 NP'er. (E) Cellecytotoksicitet af fri BA, COS og amfifil COS-BA mod repræsentative cancer 4T1- og normale LO2-celler. Cellelevedygtighed af (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 cancerceller efter at være blevet inkuberet med frie COS-BA, COS-BA/Ce6 NP'er med/uden bestråling ved angivet ækvivalent COS-BA koncentration i 24 timer. (I) Cellecytotoksicitet af fri COS-BA, ikke-bestrålede COS-BA/Ce6 NP'er mod normale LO2- og L929-celler. (J) IC50-analysen af ​​COS-BA mod cancer og normale celler. Data er udtrykt som middel SD (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0.01 og ***P ˂ 0.001 viser de signifikante forskelle.

For at udforske de mulige årsager bag denne kemoterapi-dvalekarakteristik blev den tidsafhængige cellulære optagelsesadfærd af COS-BA/Ce6 NP'er evalueret successivt ved at inkubere med 4T1-kræftceller. Resultaterne viste, at selvom COS-BA/Ce6 NP'er viste bemærkelsesværdig fluorescensslukning, viste de stadig forbedret fagocytisk effektivitet sammenlignet med fri Ce6 på grund af den stærkere cytoplasmatiske røde fluorescens, som bestemt ved flowcytometri kvantitativ analyse (fig. 5A). Denne forbedrede cellulære internalisering af NP'er kan tilskrives endocytose21. Tilsammen spekulerede vi i, at selvom meget vandopløselige co-assemblies COS-BA/Ce6 NP'er (kontaktvinkel q: 36,7) udviste forbedret cellulær endocytose end lipofil Ce6 (q: 132,6, tæt på BA), den reducerede fagocytoseeffektivitet af NP'er kan forekomme sammenlignet med amfifile COS-BA-molekyle, hvilket ser ud til at undertrykke den kemoterapeutiske cytotoksicitet af COS-BA/Ce6 NP'er. Det vil sige, celleoptagelseseffektiviteten fra høj til lav som sådan sekvens: amfifil COS-BA, hydrofil COS-BA/Ce6 NP'er, lipofil BA eller Ce6. Endnu vigtigere kan den utilstrækkelige adskillelse af cellulære NP'er være en anden vigtig årsag til den svækkede kemoterapeutiske effekt, som alle kan være relateret til den smarte kemoterapidvale af COS-BA/Ce6 NP'er. Desuden, fordi adskillelsen af ​​NP'er specifikt blev udført i det sure miljø af tumorceller, for at demonstrere den pH-responsive funktion, forsøgte vi yderligere at sammenligne optagelseseffekterne af COS-BA/Ce6 NP'er i normale LO2-celler (fig. 5B). . COS-BA/Ce6 NP'er udviste imidlertid ikke signifikant hæmmet Ce6 rød fluorescens i LO2-celler. I modsætning hertil var optagelsesadfærden af ​​LO2 den samme som for 4T1-kræftceller, hvilket tyder på, at COS-BA/Ce6 NP'er også kan adskilles selv i normale celler, hvilket kan skyldes de svagt sure pH-intracellulære rum (endosomer/lysosomer), der findes inde i både cancer og normale celler46. Da den cellulære optagelse af NP'er afhænger af endocytoseprocessen, fremhæver den direkte lægemiddelinkubation muligvis ikke pH-responsen af ​​COS-BA/Ce6 NP'er på cellulært niveau. Ikke desto mindre er tumormikromiljøet (TME) meget surt sammenlignet med normalt væv47. Uanset kræft intracellulært eller TME, kan COS-BA/Ce6 NP'er være pH-responsive og adskilles for at udløse frigivelsen af ​​meget giftig COS-BA. Mens COS-BA/Ce6 NP'er i normalt væv kun kunne adskilles efter indtræden i et normalt cellulært miljø, hvilket reducerer sandsynligheden for COSBA-frigivelse. Derfor udleder vi, at kemoterapi-dvalen karakteristisk for COS-BA/Ce6 NP'er til tumormikromiljøet er gyldig og pålidelig, og designideen i denne undersøgelse er gennemførlig.

3.5. In vitro kemoterapi/PDT anticancer effektivitet af COS-BA/Ce6 NP'er

Derudover, forud for detaljeret in vitro kemoterapi/PDT anticancer-effektivitet af COS-BA/Ce6 NP'er og for yderligere at afdække endocytosemekanismen, studerer vi de fire vigtigste endocytose-veje ved at tilføje tilsvarende endocytiske hæmmere, herunder chlorpromazin (clathrin-medieret), chloroquinphosphat ( lysosomforsuringshæmmer), nystatin (caveolae-medieret) og en makropinocytosehæmmer EIPA (ethylisopropylamilorid) (fig. 5C og D). Vi observerer, at introduktionen af ​​nystatin og chlorpromazin mere effektivt kunne hæmme fagocytisk effektivitet end EIPA og chloroquinphosphat, hvilket viser signifikant nedsat cellulær fluorescens sammenlignet med normal 37 C. Disse resultater indikerede, at COS-BA/Ce6 NP'er blev internaliseret af flere mekanismer, hovedsageligt gennem de clathrin og caveolae-medierede endocytoseveje. Siden den øgede 1 O2-generering via intermolekylære interaktioner udviser COS-BA/Ce6 NP'er væsentligt forbedret intercellulært ROS-udbytte end Ce6-udbyttet som angivet af den stærkere grønne fluorescens af DCFH-proben (fig. 5E), hvilket indebærer den højere fotodynamiske effektivitet. MTT-assays viser, at COS-BA/Ce6 NP'er under bestråling udfører en bemærkelsesværdigt forbedret hæmningseffekt på 4T1-celler end tilsvarende Ce6, mens de har relativt moderat cytotoksicitet uden bestråling (fig. 5F). Det er væsentligt, at IC50 af Ce6 (0,53 mg/ml) i COS-BA/Ce6 NP'er var meget lavere end frit Ce6 (1,39 mg/mL) (fig. 5G), hvilket tyder på en bemærkelsesværdig forbedret PDT-effektivitet, som var yderligere perfekt demonstreret af cytotoksiciteten af ​​COSBA/Ce6 NP'er mod humane MCF-7 og HepG2 cancerceller (understøttende information Fig. S19). Ligeledes blev de relativt lavere IC25-, IC50- og IC75-værdier også observeret i co-assemblies (fig. 5G) sammenlignet med fri Ce6. I mellemtiden, sammenlignet med Ce6 PDT alene og enkelt kemoterapi af NP'er i mørke, opnåede COS-BA/Ce6 NP'er under bestråling mere effektiv kombineret kemoterapi/PDT mod de ovennævnte tre cancerceller, hvilket viste en synergisme (kombinationsindeks: CI ˂ 1) ( Fig. 5I). Desuden bekræftede den dobbelte farvning af levende/døde cellers fluorescens ved hjælp af calcein-acetoxymethylester (calcein-AM) og propidiumiodid (PI) yderligere, at COS-BA/Ce6 NP'er effektivt kunne inducere celleapoptose og nekrose, da de behandlede celler næsten var farvede med rødt PI-fluorescenssignal, når det dyrkes i yderligere 10 timer efter bestråling (fig. 5H). I mellemtiden havde ikke-bestrålede COS-BA/Ce6 NP'er (højere dosis Ce6: 3,2 mg/ml) også en vis kemoterapeutisk aktivitet, set af AM- og PI-signalerne samtidigt. Denne bemærkelsesværdigt forbedrede PDT-aktivitet af COS-BA/Ce6 NP'er blev yderligere valideret af AM/PI-farvning efter behandling i yderligere 20 timer (understøttende information Fig. S20). Desuden, når man tilføjede natriumazid (SA) og D-mannitol (DM), en separat speciel quencher af 1 O2 og $OH48, til de COS-BA/Ce6 NPs-PDT-behandlede 4T1-celler, indebar den åbenlyst øgede cellelevedygtighed, at Type I ($OH) og Type II (1 O2) fotoreaktioner fandt sted samtidigt i COSBA/Ce6 NPs-medieret PDT-proces (fig. 5J). Ydermere besidder COS-BA/Ce6 NP'er især bedre blodkompatibilitet som angivet af den ubetydelige hæmolyse af røde blodlegemer (fig. 5K), hvilket tyder på potentialet for biomedicinske anvendelser via intravenøs administration.

3.6. In vivo biofordeling af COS-BA/Ce6 NP'er

Efterfølgende, forud for in vivo distributionsundersøgelsen, vurderede vi derefter farmakokinetikken af ​​COS-BA/Ce6 NP'er ved at overvåge Ce6-koncentrationen i blodet efter intravenøs injektion med tilsvarende Ce6 eller COS-BA/Ce6 NP'er. Ce6-koncentration-tidsprofilerne i blodet (fig. 6A) og de sammenlignende farmakokinetiske parametre (understøttende informationstabel S1) understøtter klart, at COS-BA/Ce6 NP'er har en forlænget cirkulation i blodbanen, hvilket kan give mulighed for større akkumulering ved tumor. websteder. Især COS-BA/Ce6 NP'er viste hurtig blodeliminering inden for 2 timer, hvilket indebærer gunstig biologisk nedbrydelighed. I overensstemmelse hermed undersøgte vi derefter in vivo biofordelingen og tumorakkumuleringsevnen af ​​COS-BA/Ce6 NP'er (fig. 6B og C). I lighed med universelt rapporterede Ce6 nanokompositter33, kan COS-BA/Ce6 NP'er distribueres hurtigt i hele kroppen. Især i løbet af de første 4 timer udviste samlinger tydeligvis stærkere fluorescensemission på tumorsteder end fri Ce6, hvilket tyder på den forbedrede retention og tumormålrettede akkumuleringsevne af COS-BA/Ce6 NP'er, sandsynligvis tilskrevet den passive forbedrede permeabilitetsretention (EPR) effekt nanopartiklerne14. Efter 6 timer efter injektion faldt fluorescensintensiteten på tumorsteder gradvist hurtigt. I modsætning til de almindeligt rapporterede nanokompositter med signifikant forbedret tumorakkumulering sammenlignet med frit positivt lægemiddel29, viste COS-BA/Ce6 NP'er ikke særlig fremtrædende akkumulering ved tumorsitting 24 timer efter injektion end fri Ce6 (fig. 6C), hvilket var yderligere understøttet af billeddannelsen af ​​den udskårne tumor (fig. 6D og E). Den fremragende biologiske nedbrydelighed af NP'er kan være ansvarlig for introduktionen af ​​naturlige små organiske molekyler. Dette blev også observeret med andre terpenoider små molekyle-medierede nano-samlinger49. Desuden viste COS-BA/Ce6 NP'er også en lignende vævsfordeling som fri Ce6 (fig. 6E), og den ex vivo gennemsnitlige fluorescensintensitet var generelt lavere end den præsenterede in vivo, hvilket yderligere indebærer god bionedbrydelighed. I betragtning af den tætte fluorescensniveauforskel mellem 2 og 4 timer efter injektion af NP'er og Ce6, samt eksperimentel operationsevne, der tillader tilstrækkelige intervaller til bestråling, blev 4 timer efter administration valgt som lystidspunkt for efterfølgende PDT-terapi.

I betragtning af den ikke særlig fremtrædende tumorakkumulering efter 24 timer end fri Ce6, for yderligere at validere den øgede EPR-effekt, som COS-BA/Ce6 NP'er har, overvågede vi straks ex vivo fluorescensbillederne af tumorer på forskellige tidspunkter efter injektion intravenøst ​​med nanolægemidler ( fig. 6F og G). Bemærkelsesværdigt, enten 20 minutter eller 12 timer efter injektion, viste COS-BA/Ce6 NP'er faktisk stærkere fluorescensemission på tumorsteder end fri Ce6, hvilket viste fremragende og forbedret tumorakkumuleringsevne. I mellemtiden, som tiden gik, blev fluorescensintensiteterne tilbageholdt i tumorvæv gradvist svækket (fig. 6G), hvilket er helt i overensstemmelse med resultaterne af in vivo dyrefluorescensbilleddannelse. Det er klart, at denne hurtige biologiske metabolisme og forbedrede tumorakkumulering undgåede potentiel langsigtet akkumuleringstoksicitet, hvilket garanterer højeffektiv antitumorterapi med bedre biosikkerhed.

Figur 5 In vitro anticancereffektivitet af COS-BA/Ce6 NP'er. Cellulær internalisering af (A) 4T1 cancerceller og (B) LO2 normale celler inkuberet i fri Ce6 eller COS-BA/Ce6 NP'er i 0,5 og 3 timer, og tilsvarende flowcytometrisk analyse af fluorescensintensitet. (C) Optagelsesinhibering af specifikke endocytiske pathway-undersøgelser og (D) tilsvarende fluorescensintensitet af celler målt ved flowcytometri efter inkubation med COSBA/Ce6 NP'er med/uden endocytiske inhibitorer, herunder chlorpromazin, chloroquin, nystatin og ethylisopropylamilorid (EIPA). Skala søjler Z 20 mm. (E) Cellulær ROS-generering induceret af fri Ce6 eller COS-BA/Ce6 NP'er (ækvivalent Ce6: 1,6 mg/ml). Målestok Z 20 mm. (F) Cellelevedygtighed af 4T1-celler efter forskellige behandlinger i 24 timer. (G) IC25-, IC5-0-, IC75-analysen af ​​frie Ce6- og COS-BA/Ce6-NP'er mod henholdsvis 4T1-, MCF--7- og HepG2-celler. (H) Calcein-AM/propidiumiodid (PI) levende/død farvning af COS-BA/Ce6 NP'er (Ce6: 1,6 mg/mL)-behandlede 4T1-celler efter inkubation i yderligere 10 timer, samt ikke-bestrålet COS- BA/Ce6 NP'er (Ce6: 3,2 mg/ml). Skala stænger Z 50 mm. (I) Kombinationsindeks (CI) af COS-BA/Ce6 NP'er på 4T1-, MCF-7- og HepG2-celler, som bestemt ved Chou Talalay-sætningsberegning. (J) PDT-mekanismer (Type I og Type II) induceret ved bestråling af COS-BA/Ce6 NP'er og evalueret af henholdsvis specifik 1 O2 og $OH quencher natriumazid (SA) og D-mannitol (DM). (K) Procent hæmolyse af røde blodlegemer efter inkubation med COS-BA/Ce6 NP'er i 4 timer. Data er udtrykt som middel SD (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 og ***P ˂ 0,001 viser de signifikante forskelle.

Figur 6 In vivo blodcirkulation og biofordeling af COS-BA/Ce6 NP'er. (A) Ce6-koncentration-tidsprofiler i blodet efter iv-injektioner af tilsvarende Ce6 eller co-assembled COS-BA/Ce6 NP'er (n Z 3). (B) Helkropsfluorescensbilleder af 4T1-tumorbærende mus efter iv-injektioner af indikerede lægemidler på forskellige tidspunkter. (C) Gennemsnitlig fluorescensintensitet opnået fra tumorstederne i (B). (D) Ex vivo fluorescensbilleder af tumorer og større organer udskåret fra ovennævnte mus efter 24 timer, og tilsvarende (E) fluorescensintensitet kvantitativt resultat (n Z 3). (F) Ex vivo fluorescensbilleder af tumorer og større organer på forskellige tidspunkter efter iv-injektioner af Ce6 eller COS-BA/Ce6 NP'er og (G) tilsvarende fluorescensintensitetsanalyse af tumorer. Data er udtrykt som middel SD (n Z 3).

3.7. In vivo kemoterapi/PDT kombinatorisk antitumorbehandling 

Motiveret af den unikke dvalekarakteristik, gode bionedbrydelighed og PDT-aktivitet, blev in vivo kemoterapi/PDT-kombinationen antitumorterapi undersøgt. 4T1-tumorbærende mus blev tilfældigt opdelt i 6 grupper og injiceret intravenøst ​​med ækvivalent Ce6 (3,5 mg/kg krop) hver 2. dag i i alt tre doser. 4 timer efter injektion blev tumorstederne for mus i de lette grupper bestrålet i 15 minutter (fig. 7A). I mellemtiden blev tilsvarende tumorvolumener eller kropsvægte registreret hver anden dag. Efter 14 dages behandling (fig. 7B) var fri Ce6 med bestråling og fri COS-BA ineffektive til tumorundertrykkelse, sandsynligvis på grund af den begrænsede lægemiddelakkumulering i tumorvæv. I modsætning hertil blev den mest signifikante tumorhæmning efter bestråling af COS-BA/Ce6 NP'er observeret, hvilket validerede den fremragende kemoterapi/PDT-kombinationseffektivitet. De gennemsnitlige tumorvægte (fig. 7D) og tilsvarende fotografier af dissekerede tumorer (fig. 7E) viste begge den bedste antitumoreffektivitet af COS-BA/Ce6 NP'er under bestråling, da behandlede mus viste de mindste tumorstørrelser end de fra andre grupper. Det gennemsnitlige tumorhæmningsforhold for PDT-behandlede COS-BA/Ce6 NP'er nåede 80,3 %, højere end for fri Ce6 PDT (42,4 %) og fri COS-BA (38,5 %). Navnlig selvom tidligere in vitro undersøgelser har vist, at COS-BA/Ce6 NP'er uden lys viste en sovende funktion af kemoterapeutisk aktivitet, udfører de stadig en forbedret antitumoreffektivitet (49,5%) sammenlignet med fri COS-BA (fig. 7D). Vi spekulerede i, at to mulige årsager bidrager til dette resultat, den ene er den højere tumorakkumulering af COS-BA/Ce6 NP'er på grund af den bredt rapporterede EPR-effekt. En anden faktor er det svagt sure tumormikromiljø, der stimulerede frigivelsen af ​​meget giftig COS-BA. På grund af den højere kritiske micellekoncentration (CMC, 187 mg/mL) af COS-BA (understøttende information Fig. S21), kunne den eksistere i monomertilstanden i tumormiljøet, hvilket således fremmer den forbedrede kemoterapi af ikke-bestrålet COS- BA/Ce6 NP'er. For yderligere at verificere den overlegne anticancer-effektivitet af COS-BA/Ce6 NP'er blev hæmatoxylin og eosin (H&E)-farvning af tumorer udført (fig. 7G).

Figur 7 Effektivitetsundersøgelse med en subkutan 4T1 xenograft-model. (A) Skematisk illustration af in vivo PDT-behandling. (B) Tumorvækstprofiler, (C) ændringer i kropsvægt og (D) udskårne tumorvægte indeholdende tumorhæmningsforhold af 4T1-bærende mus efter forskellige behandlinger i de angivne grupper (n Z 5 for hver gruppe). (E) Billeder af udskårne tumorer fra repræsentative mus efter behandling. (F) Serumbiokemianalyse efter behandling med COS-BA/Ce6 NP'er i 14 dage. (G) Repræsentativ H&E-farvning af udskårne tumorsektioner efter forskellige behandlinger. Skaleringsstænger Z 50 mm. (H) TUNEL-farvning af fri Ce6 og COS-BA/Ce6 NP'er PDT-behandlede tumorsektioner. Skala søjler Z 20 mm **P < 0,01 angiver de signifikante forskelle.

Resultaterne indikerede, at COS-BA/Ce6 NPs-PDT-behandlede tumorsektioner viste alvorlig vævsforringelse og kernemangel, mens moderat vævsnekrose blev observeret i de andre grupper. Samtidig, sammenlignet med frit Ce6-lys, øgede COS-BA/Ce6 NP'er under bestråling bemærkelsesværdigt antallet af TUNEL-positive celler, der viste en stærkere brun nuklear farvning (fig. 7H), hvilket yderligere bekræftede den fremragende kemoterapi/PDT-kombinationsterapi. Desuden blev der ikke observeret nogen åbenlyse variationer af kropsvægte i alle grupper (fig. 7C). Selvom COSBA/Ce6 NP'erne eller Ce6 light-grupperne havde et beskedent tab i kropsvægt under administration, vendte kropsvægtene tilbage til normale efter et par dage. Ingen tydelig skade eller inflammatorisk læsion kunne findes i de større organer høstet ved afslutningen af ​​behandlinger (understøttende information Fig. S22), hvilket begge indikerer lav/ingen systemisk toksicitet og god biosikkerhed af COS-BA/Ce6 NP'er. Selvom COS-BA/Ce6 NP'er hovedsageligt akkumuleres i levervæv, viste de tilsvarende leverfunktionsmarkører (ALT, AST og ALP) ikke signifikante ændringer sammenlignet med normale raske mus (fig. 7F), hvilket tyder på bedre biokompatibilitet. Derudover så nyrefunktionsmarkørerne (BUN, CRE og UA) og biokemiske parametre (ALB og TBIL) også ud til at ligne normale mus, hvilket yderligere indebærer bedre biosikkerhed. Det er klart, at dette prodrug organiske lille molekyle COS-BA-medierede co-assembler COS-BA/Ce6 NP'er har flere gunstige terapeutiske egenskaber, der åbner attraktive muligheder for anvendelser i klinisk medicin.

3.8. Antitumorimmunitet af kombineret kemoterapi/PDT og anti-PD-L1 blokade

For nylig har talrige innovative undersøgelser vist, at kombinationen af ​​cancerimmunterapi med andre behandlingsmodaliteter effektivt kunne vække tumorspecifikke immunresponser til eliminering af primære eller fjerne tumorer1. Opmuntret af den unikke kemoterapi-dvalefunktion og fremragende kemoterapi/PDT-antitumoreffektivitet af COS-BA/Ce6 NP'er, spekulerer vi derfor på, om det også kunne udløse immunologiske responser ved hjælp af en immunadjuvans anti-PD-L1 for at forårsage højeffektiv antitumorterapi . Kunne det behandle fjerne tumorer, der ikke kan behandles direkte ved hjælp af PDT-behandling, og derved give en alternativ strategi til kliniske anticancer-applikationer? For at teste denne hypotese blev der i denne undersøgelse etableret en "to tumorer"-model, og detaljerede eksperimentprocedurer blev vist i fig. 8A. Typisk blev to 4T1-tumorer inokuleret i både venstre og højre side af hver mus. I betragtning af at anti-PD-L1 alene ikke har en iøjnefaldende immunterapeutisk effekt50, blev eksperimenterne opdelt i 5 grupper inklusive en ubehandlet gruppe, COS-BA/Ce6 NP'er, COS-BA/Ce6 NP'er med anti-PD-L1, COS- BA/Ce6 NP'er med lys, COS-BA/Ce6 NP'er med lys og anti-PD-L1. Efter en enkelt iv-injektion af NP'er (Ce6: 3,5 mg/kg) blev de højre tumorer (primær tumor) i de lette grupper bestrålet i 15 minutter for at evaluere de immunologiske virkninger af PDT/kemoterapi, mens de venstre tumorer (fjerne tumorer) i alle grupper uden nogen behandling blev udvalgt til individuel kemoterapi. Efterfølgende, på dag 2, 4 og 6, blev mus i immungrupperne injiceret iv med anti-PD-L1-antistof (15 mg pr. mus pr. injektion) i i alt tre doser. Det er væsentligt, uanset PDT-behandling eller ej, at COS-BA/Ce6 NP'er plus anti-PD-L1 effektivt kunne hæmme den primære tumorprogression (fig. 8B). Og tilsvarende gennemsnitlige tumorhæmningsforhold nåede separat 86,7 % (bestråling) og 76,5 % (ingen bestråling), langt højere end individuel kemoterapi (5,7 %) eller kemoterapi/PDT (27,4 %) behandling (fig. 8C) . Fotografierne af dissekerede tumorer (fig. 8D) og 4T1-bærende mus (understøttende information fig. S23) efter 14 dages behandling understøttede også visuelt ovenstående konklusion. Disse resultater antydede, at både NPs-baseret kemoterapi og kemoterapi/PDT effektivt kunne aktivere antitumorimmunitet. I mellemtiden var det mest slående, at anti-PD-L1-blokade plus NP'er også tilbød en bemærkelsesværdig tumorhæmningseffekt til ikke-bestrålede fjerne (venstre) tumorer (fig. 8E og F), generelt stærkere end COS-BA/Ce6 NP'er alene, som var også bekræftet af de tilsvarende dissekerede tumorer og musebilleder efter behandling (fig. 8D og fig. S23), hvilket yderligere viser den effektive antitumorimmunrespons induceret af COS-BA/Ce6 NP'er.

For fuldt ud at udforske denne effektive antitumorimmunrespons blev CD8þ cytotoksiske T-lymfocytter (CTL'er), en kritisk immunocyt for cancerimmunterapi4, yderligere evalueret ved at analysere immuncellerne i højre eller venstre tumorer efter 14 dages behandling. Det blev fundet, at COS-BA/Ce6 NP'er plus anti-PD-L1 med eller uden PDT-behandling inducerede robust CD8þ CTL-infiltration i de primære tumorer (fig. 8H og J). CD8þ CTL-infiltrationen var op til 11,3 % efter COS-BA/Ce6 NPs-baseret kemoterapi/PDT plus anti-PD-L1-behandling, lidt højere end COS-BA/Ce6 NPs plus anti-PD-L1 (9,63%), og meget højere end i andre grupper uden anti-PD-L1, inklusive behandling med COS-BA/Ce6 NPs-baseret kemoterapi (5,12 %) eller kemoterapi/PDT alene (4,07 %). Sammenlignet med ikke-immune grupper blev der også observeret signifikant øget CTL-infiltration i venstre (fjerne) tumorer for mus efter COS-BA/Ce6 NP'er plus antiPD-L1 med eller uden PDT-behandling (fig. 8I og K), yderligere indebærer højeffektive immunresponser induceret af kemoterapi eller kemoterapi/PDT kombinationsterapi. I mellemtiden førte både COS-BA/Ce6--baseret kemoterapi og kemoterapi/PDT efter introduktionen af ​​anti-PD-L1 til robust produktion af flere cytokiner, der spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​de cytotoksiske funktioner af CTLs8, herunder tumor nekrosefaktor-alfa (TNF-a) (fig. 8L) og interferon-gamma (IFN-g) (fig. 8M) i serumprøverne fra mus efter 14 dages behandling, hvilket yderligere understøtter, at der var effektive antitumorimmunresponser. Desuden blev der ikke observeret nogen synlige ændringer i kropsvægt i forskellige behandlingsgrupper (fig. 8N), hvilket indikerer den gunstige biosikkerhed af denne kombinerede kemoterapi/PDT/immunterapi. Tilsammen fandt vi, at selvom anti-PD-L1 plus COSBA/Ce6 NP'er med lys viste et lidt højere tumorhæmningsforhold (86,7%) end den ikke-bestrålede gruppe (76,5%) mod de rigtige tumorer På grund af påvirkningen af ​​PDT (fig. 8B‒D) blev der ikke observeret nogen signifikante forskelle i terapeutiske virkninger på de venstre tumorer i nærvær (77,8%) eller fravær (78,4%) af PDT (fig. 8E‒G). Vi spekulerer på, at følgende mulige årsager fører til dette fænomen. For det første, for mekanismen for kemoterapi eller PDT, der forstærker de immunologiske virkninger af anti-PD-L1 checkpoint blokade, har akkumulerende undersøgelser vist, at disse behandlingsmodaliteter kunne udløse akut inflammation i tumorområdet og derved øge præsentationen af ​​tumorassocierede antigener til T celler, hvilket inducerer kræftceller til at gennemgå ICD8,9. Tumorceller, der gennemgår ICD, vil opregulere "spis mig"-signaler ved at eksponere calreticulin (CRT) på overfladerne af immunogent døende tumorceller og "fare"-signaler ved at frigive gruppeboks 1 med høj mobilitet (HMGB1), hvilket fremmer aktivering af dendritiske celler at aktivere CTL'er, hvis aktivitet kunne forstærkes af anti-PD-L1, hvilket resulterer i væsentligt forbedret anticancer immunterapi51.

Figur 8 Antitumoreffekt af COS-BA/Ce6 NPs-baseret kemoterapi/PDT plus checkpoint blokade anti-PD-L1 immunterapi. (A) Skematisk illustration af CNPs-baseret kemoterapi/PDT med anti-PD-L1-terapi. (BeD) (B) Tumorvækstprofilerne, (C) gennemsnitlige tumorvægte og (D) billeder af udskårne tumorer fra repræsentative mus for primære (højre) tumorer efter forskellige behandlinger i 14 dage som angivet. (EeG) (E) Tumorvækstkurverne, (F) gennemsnitlige tumorvægte og (G) billeder af udskårne tumorer for ikke-bestrålede fjerne (venstre) tumorer efter forskellige behandlinger som angivet. (H) Populationer af CD8þ T-celler i højre tumorer og (J) procenter af CTL-infiltration blev kvantitativt påvist ved flowcytometri efter 14 dages behandling. (I, K) Populationer af CD8þ T-celler i venstre tumorer på dag 14 blev detekteret kvantitativt ved flowcytometri (n Z 3). Sekretion af cytokiner i sera efter 14 dages behandling inklusive (L) IFN-g og (M) TNF-a målt ved ELISA-assay (n Z 3). (N) Ændringer i musens kropsvægt under forskellige behandlinger. *P < 0.05, **P < 0.01 og ***P < 0.001 viser de signifikante forskelle.

For det andet, i dette arbejde, kunne COS-BA/Ce6 NP'er fordeles på venstre og højre tumorer samtidigt, både venstre kemoterapi og højre kemoterapi/PDT har et enormt potentiale til at inducere tumorceller, der gennemgår ICD. I mellemtiden administreres COS-BA/Ce6 NP'er i kun én dosis, immunterapien afhænger hovedsageligt af tre doser anti-PD-L1, hvad enten det er kemoterapi eller kemoterapi/PDT, de er kun primere. De terapeutiske forskelle i at inducere tumorcelle ICD mellem individuel kemoterapi og kombinerede kemoterapi/PDT-behandlinger er muligvis ikke særlig fremtrædende. Procentdelen af ​​CD8þ CTL'er til venstre (fig. 8I og K) og højre tumorer (fig. 8H og J) understøttede også ovenstående spekulation, ingen signifikant forskel i CD8þ CTL'er blev observeret i nærvær eller fravær af PDT. Derfor opnåede COS-BA/Ce6 NP'er plus anti-PD-L1 med eller uden bestråling lignende anticancereffektivitet mod venstre tumorer. Fordi 4T1-celler udtrykker lave niveauer af PD-L152, er anti-PD-L1 alene i vid udstrækning blevet bevist at have enhver iøjnefaldende immunterapeutisk effekt på 4T1-brystkræft53,54. På trods af ICD-effekterne medieret af COS-BA/Ce6 NP'er berettiger yderligere undersøgelser, har de præsenterede resultater vist, at COS-BA/Ce6 NP'er opnår bemærkelsesværdigt forbedrede immunresponser ved hjælp af anti-PD-L1. Samlet ser det ud til, at COS-BA/Ce6 NP'er faktisk forstærkede cancerimmunterapien af ​​anti-PD-L1, ikke kun en kombinationsterapi. Selvom anti-PD-L1 plus COS-BA/Ce6 NP'er med eller uden PDT-behandling ikke viste signifikante forskelle i terapeutiske virkninger, viste begge af dem tydeligvis forbedret antitumoreffektivitet sammenlignet med én dosis COS-BA/Ce6 NP'er. Det vil sige, selv om uden lysbehandling, når først immunadjuvansen antiPD-L1 blev introduceret, kan immunogeniciteten af ​​tumorrester efter COS-BA/Ce6 NPs kemoterapi boostes, hvilket resulterer i bemærkelsesværdige systemiske antitumorimmunresponser, hvilket fører til effektiv suppression af primære eller fjerne tumorer. Det skulle således være muligt at eliminere primære og metastatiske tumorer under klinisk anticancer immunterapi med gentagne behandlinger med NP'er. Det er klart, at disse resultater kollektivt giver bevis for yderst effektive og synergistiske antitumorimmunresponser induceret af COS-BA/Ce6 NP'er i kombination med en anti-PD-L1 blokade, med enten kemoterapi alene eller i kombination med kemoterapi/PDT.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

4 konklusioner

Sammenfattende har vi målrettet designet, syntetiseret og udviklet et biokompatibelt, bionedbrydeligt, lavt toksisk, men yderst effektivt og klinisk tilgængeligt transformeret fotokemoterapeutisk nano-prodrug COS-BA/Ce6 NP'er ved at kombinere tre multifunktionelle komponenter selvsamlet naturlig lille molekyle betulinsyre (BA), en vandopløselig COS og en lavtoksisk fotosensibilisator Ce6 til kombineret kemoterapi/PDT. Det udløser efterfølgende yderst effektive og synergistiske antitumorimmunresponser i kombination med en anti-PD-L1 blokade, med enten kemoterapi alene eller i kombination med kemoterapi/PDT. Specifikt viser vi, at hult netværks molekylært arrangement kan lette dannelsen af ​​skalstrukturerede nanopartikler. Modifikationer af vandopløseligt COS kunne i høj grad øge anticanceraktiviteten af ​​lipofile naturlige små molekyler ved at konstruere et amfifilt prodrug. Vi viser også, at de resulterende nanolægemidler viste flere gunstige terapeutiske egenskaber, især en smart "dvale"-funktion med snigende kemoterapieffekter. Kombineret med den karakteristiske pH-følsomhed udfører disse co-assemblies lav toksicitet og biosikkerhed med normalt væv, men er meget toksiske for tumorvæv. Sammen med den forbedrede 1 O2-generation, god bionedbrydelighed og biokompatibilitet, som alle bidrog til den yderst effektive, synergistiske og sikre anticancer kemoterapi/PDT/immunterapi. Især individuel kemoterapi uden PDT-behandling kan aktivere systemiske antitumorimmunresponser, hvilket åbner attraktive muligheder for klinisk synergistisk anticancer-kemoterapi-immunterapi. Samlet set giver dette arbejde lovende indsigt i udvikling af naturlige multifunktionelle meget bioaktive og lavtoksiske nano-immunostimulanter til klinisk immunterapi.

Referencer

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Nylige fremskridt inden for nanomateriale-baseret synergistisk kombination af cancerimmunterapi. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ, et al. Nanomedicin-baserede cancerimmunterapier udviklet ved at omprogrammere tumorassocierede makrofager. Nanoskala 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL, et al. Kombineret lokal immunstimulerende radioisotopterapi og systemisk immunkontrolpunktblokade giver kraftige antitumorresponser. Nat Biomed Eng 2018;2:611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY, et al. Fototermisk kemoterapi integrerede nanopartikler med tumormikromiljørespons forbedrede induktionen af ​​immunogen celledød til effektiv behandling af kolorektal cancer. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K, et al. Intracellulær aggregering af peptid-omprogrammerede små molekyle nanosamlinger forbedrer cancerkemoterapi og kombinatorisk immunterapi. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.

6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X, et al. Forbedret immunterapi baseret på fotodynamisk terapi til både primær og lungemetastase-tumorudryddelse. ACS Nano 2018;12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Immunologiske reaktioner udløst af fototermisk terapi med kulstofnanorør i kombination med anti-CTLA-4-behandling for at hæmme cancermetastaser. Adv Mater 2014;26:8154e62.

8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR, et al. Core-shell nanoskala koordinationspolymerer kombinerer kemoterapi og fotodynamisk terapi for at forstærke checkpoint blokade cancer immunterapi. Nat Commun 2016;7:12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Immunogen celledød i cancer og infektionssygdomme. Nat Rev Immunol 2017;17: 97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH, et al. En kombination af fucoidan-baserede magnetiske nanopartikler og immunmodulatorer forbedrer tumor-lokaliseret immunterapi. Nat Nanotechnol 2018;13:746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY, et al. Biologisk nedbrydeligt hypocretin-derivat nanovesikel som et nær-infrarødt lys-drevet termostik til dobbelt fotoaktiv cancerbilleddannelse og -terapi. Biomaterials 2018;185:133e41.

12. Spicer CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Peptid- og proteinnanopartikler konjugerer alsidige platforme til biomedicinske anvendelser. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL, et al. Nylige fremskridt inden for nanomaterialer til nukleinsyrelevering i cancerimmunterapi. Biomater Sci 2019;7:2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Nylige fremskridt inden for sono photo dynamisk cancerterapi: fra udviklede nye sensibilisatorer til nanoteknologi-baserede effektivitetsforbedrende strategier. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Smart peptid-baserede supramolekylære fotodynamiske metallo-nano-lægemidler designet af multikomponent koordination selvsamling. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Selvsamlet lille molekyle naturprodukt gel til lægemiddel levering: et gennembrud i ny anvendelse af små molekyle naturlige produkter. Acta Pharm Sin B 2020;10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB, et al. Enkelte små molekyle-samlede nanopartikler medierer effektiv oral medicinafgivelse. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J, et al. Naturproduktgelatorer og en generel metode til at opnå dem fra organismer. Nanoskala 2018;10:3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Selvsamlede naturlige små molekyle diterpensyrer med gunstig anticanceraktivitet og biosikkerhed til synergistisk forbedret antitumor kemoterapi. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Udforskning af den naturlige aktive små-molekyle lægemiddel-loading proces og højeffektiv synergistisk antitumor effektivitet. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J, et al. Enkle og multifunktionelle naturlige selvsamlede steroler med anticanceraktivitetsmedierede supramolekylære fotosensibilisatorer til forbedret fotodynamisk antitumorterapi. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Bioaktiv naturlig lille molekyle-tunet sammensætning af lysfølsomme lægemidler til højeffektiv synergistisk og forbedret Type I fotokemoterapi. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicin-cum-bærer ved samsamling af naturlige små produkter til synergistisk forbedret antitumor med vævsbeskyttende virkninger. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Liu HP. Nylige fremskridt inden for design af amfifile lægemidler og vacciner til selvlevering. Adv Ther 2019;3:1900107.

25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. Forbedring af cellulær optagelse af terapeutiske enheder gennem interaktion med komponenter i cellemembranen. Drug Deliv 2019;26:328e42.

26. Pujals S, Giralt E. Prolinrige, amfipatiske cellegennemtrængende peptider. Adv Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H, et al. Smarte mikro/nanopartikler i stimulus-responsive lægemiddel/gen-leveringssystemer. Chem Soc Rev 2016;45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Bærerfri triterpen-prodrugs med glutathionrespons og biosikkerhed til synergistisk forbedret fotokemoterapi. ACS Appl Mater Interfaces 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Supramolekylære fotosensibilisatorer forynger fotodynamisk terapi. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW, et al. Strukturel karakterisering og antitumoreffekter af chitosan-oligosaccharider mod ortotopisk levertumor via NF-kB-signalvej. J Funct Foods 2019;57:157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY, et al. Chitosan-oligosaccharider inducerer apoptose i humant nyrecarcinom via reaktivt ilt-arts-afhængigt endoplasmatisk retikulum-stress. J Agric Food Chem 2019;67:1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY, et al. Anti-ødem og antioxidant kombinationsterapi til iskæmisk slagtilfælde via glyburidfyldte betulinsyre nanopartikler. Theranostics 2019;9: 6991e7002.

33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mohwald H, Yan XH. Enkel peptid-tunet selvsamling af fotosensibilisatorer mod fotodynamisk terapi mod kræft. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y, et al. Tumor mikromiljø-responsiv form-reverserende selv-målretning virus-inspireret nanolægemiddel til billeddiagnostik-guidet nær-infrarød-II fototermisk kemoterapi. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y, et al. Nanogel-hybridsamling til exosom intracellulær levering: effekter på endocytose og fusion ved exosom overfladepolymerteknik. Biomater Sci 2020;8:619e30.

36. Chou TC. Teoretisk grundlag, eksperimentelt design og computeriseret simulering af synergisme og antagonisme i lægemiddelkombinationsstudier. Pharmacol Rev 2006;58:621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z, et al. Bærerfrie, dobbeltfunktionelle nanorods via selvsamling af rene lægemiddelmolekyler til synergistisk kemo-fotodynamisk terapi. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. Biomedicinske anvendelser af supramolekylære systemer baseret på vært-gæst-interaktioner. Chem Rev 2015;115:7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y, et al. Nanoengineering af et nydesignet chlorin e6-derivat til amplificeret fotodynamisk terapi via regulering af laktatmetabolisme. Nanoskala 2021;13:11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM, et al. Et mitokondrie-metabolisme-regulerbart bærerfrit nanolægemiddel til at forstærke følsomheden af ​​fototermisk terapi. Chem Commun (Camb) 2021;57:8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y, et al. Let supramolekylær tilgang til nukleinsyre-drevet aktiverbare nanotheranostics, der overvinder ulemperne ved fotodynamisk terapi. ACS Nano 2018; 12:681e8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hybrid TiO2-ruthenium nano-fotosensibilisator producerer synergistisk reaktive oxygenarter under både hypoxiske og normoksiske forhold. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J, et al. Tuning af singlet-triplet energigabet: en unik tilgang til effektive fotosensibilisatorer med aggregerings-induceret emission (AIE) karakteristika. Chem Sci 2015;6:5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ, et al. Polymerisering øget fotosensibilisering. Chem 2018;4:1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. Lysstyret selvsamling af ikke-fotoresponsive nanopartikler. Nat Chem 2015;7:646e52.

46. ​​Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. Hyaluronsyre-baserede pH-følsomme polymermodificerede liposomer til cellespecifikke intracellulære lægemiddelleveringssystemer. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L, et al. Selektiv billeddannelse og cancercelledød via pH-omskiftelig nær-infrarød fluorescens og fototermiske effekter. Chem Sci 2016;7:5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ, et al. Nem syntese af chitosan-assisteret multifunktionel magnetisk Fe3O4@ SiO2@CS@pyropheophorbide - en fluorescerende nanopartikler til fotodynamisk terapi. New J Chem 2016;40:8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Udforskning af selvsamlingsmekanismen og effektiv synergistisk antitumor kemofototerapi af et bionedbrydeligt og glutathion-responsivt ursolsyre-prodrug-medieret lysfølsomt nanodrug. Biomater Sci 2021;9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS, et al. Aptamer-baseret logisk databehandlingsreaktion på levende celler for at muliggøre ikke-antistof immun checkpoint blokadeterapi. J Am Chem Soc 2021;143: 8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC, et al. Elimination af etablerede tumorer med nanodisk-baseret kombinationskemoimmunterapi. Sci Adv 2018;4:eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG, et al. PD-L1 påvisning i tumorer ved hjælp af [(64)Cu]atezolizumab med PET. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. Terapeutisk antitumorimmunitet ved kontrolpunktblokade forstærkes af ibrutinib, en hæmmer af både BTK og ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q, et al. Nanopartikelmedieret intern radioisotopterapi til lokalt at øge tumorvaskulaturpermeabiliteten for synergistisk forbedrede cancerterapier. Biomaterialer 2019;197:368e79.