Faderlig nikotin forbedrer frygthukommelsen, reducerer nikotinadministration og ændrer Hippocampus genetiske og neurale funktion hos afkom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1 Department of Biobehavioral Health, Penn State University, University Park, Pennsylvania

2 Department of Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine, Nashville, Tennessee

3College of Pharmacy, University of Kentucky, Lexington, Kentucky

4 Institut for neurobiologi og adfærd, University of California Irvine, Irvine, Californien

5Bioinformatik, biokemi og molekylærbiologi, Penn State University, University Park, PA

6 Institut for psykologi, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania

Abstrakt

Nikotinbrug er fortsat meget udbredt med tobak og e-cigaretprodukter, der forbruges over hele verden. Imidlertid antyder stigende beviser for transgenerationel epigenetisk arv, at nikotinbrug kan ændre adfærd og neurobiologi i efterfølgende generationer. Vi testede virkningerne af kronisk paternal nikotineksponering i C57BL6/J-mus på frygtkonditionering i F1- og F2-afkom, såvel som betinget frygtudryddelse og spontan genopretning, selvadministration af nikotin, hippocampus kolinerg funktion, RNA-ekspression og DNA-methylering i F1 afkom. Faderlig nikotineksponering var forbundet med forbedret kontekstuel og cued frygtkonditionering og spontan genopretning af slukkede frygtminder. Yderligere blev nikotinforstærkning reduceret i nikotin-stammede mus, som vurderet i et selvadministrationsparadigme. Disse adfærdsfænotyper blev koblet med ændret respons på nikotin, opreguleret hippocampus nikotinacetylcholinreceptorbinding, reducerede fremkaldte hippocampale kolinerge strømme og ændret methylering og ekspression af hippocampale gener relateret til neural udvikling og plasticitet. Genekspressionsanalyse tyder på multigenerationelle effekter på bredere gennetværk, der potentielt er involveret i neuroplasticitet og psykiske lidelser. Ændringerne i frygtkonditionering antyder på samme måde fænotyper, der er analoge med angstlidelser, der ligner posttraumatisk stress.

NØGLEORD: kolinerg, hippocampus, læring, multigenerationel, nikotin, transgenerationel

virkninger af cistanche

1. INTRODUKTION

Akkumulerende beviser tyder på, at virkningen af ​​eksponering for misbrugsstoffer strækker sig ud over individet til at påvirke fysiologiske og adfærdsmæssige fænotyper hos ueksponerede afkom.1-3 Karakterisering af nikotins virkninger på tværs af generationer er afgørende i betragtning af udbredelsen af ​​tobaksproduktbrug4 og den dramatiske stigning af e-cigaretbrug.5 Gennem sine virkninger på hjernens kolinerge systemer frembringer nikotineksponering markante ændringer i hjernens funktion, der kan ligge til grund for nikotinafhængighed og bidrage til øget risiko for psykiatriske lidelser, herunder depression6 og angst.7 Epigenetiske modifikationer nedstrøms for kolinerg aktivering kan tillade vedvarende effekter på cellulær og kredsløbsfunktion.8,9 Indtil for nylig blev det antaget, at disse epigenetiske modifikationer blev slettet ved etableringen af ​​kimlinien og dermed sekvestreret fra efterfølgende generationer. Imidlertid kan epigenetiske modifikationer, herunder DNA-methylering, posttranslationelle histonmodifikationer og ikke-kodende RNA'er, erhvervet i én generation, nedarves i den næste generation.10,11 Disse epigenetiske modifikationer kan mediere multigenerationelle og transgenerationelle effekter af forældres nikotineksponering på afkoms adfærd og neurobiologi .

Gnaverundersøgelser fra flere uafhængige laboratorier er begyndt at identificere multigenerationelle og transgenerationelle konsekvenser af forældrenes nikotineksponering. Dette arbejde har hidtil identificeret virkninger af forældrenes nikotineksponering på depressive- og angstlignende fænotyper,1 kognitiv fleksibilitet,2 ADHD-lignende adfærd3 og genekspression.1,2 De multigenerationelle og transgenerationelle konsekvenser af nikotineksponering kan påvirke endofænotyper involveret i nikotinafhængighed og mental sundhed. For eksempel har vi vist, at nikotineksponering modulerer kontekstuel frygtkonditionering, en model for hippocampus-afhængig frygtindlæring, der er relateret til sårbarhed over for psykiske lidelser såsom posttraumatisk stresslidelse (PTSD) og afhængighed.12-14 Nikotin's effekter på kontekstuel frygtindlæring moduleres af hippocampus.15,16 Vi har fundet ud af, at akut nikotineksponering øger hippocampusafhængig frygtindlæring,15,17 hæmmer udryddelsen af ​​kontekstuel frygt,18,19 og øger spontan genopretning af kontekstuel frygt efter udryddelse.18 Imidlertid er de multigenerationelle og transgenerationelle virkninger af faderlig nikotineksponering på disse fænotyper ikke blevet undersøgt. Desuden har ingen tidligere undersøgelser karakteriseret nikotins multi-generationelle virkninger på den kolinerge funktion. Multigenerationel nedarvning refererer til fænotyper, der opstår i generationen umiddelbart efter udsatte individer, hvorimod transgenerationel arv består af kimlinjemedieret nedarvning af epigenetisk information mellem generationer i fravær af direkte miljøpåvirkninger, der fører til fænotypisk variation.11 Her undersøgte vi både multigenerationel arv. og transgenerationelle virkninger af faderlig nikotineksponering på kontekstuel og cued frygtindlæring i F1- og F2-generationen såvel som på nikotin-selvadministration, hippocampus nikotinacetylcholinreceptor (nAChR) binding, hippocampus kolinerg funktion, hippocampus genekspression og hippocampus DNA-methylering F1 generationen. Vi antager, at faderlig nikotineksponering vil påvirke frygtkonditionering, hippocampus-genekspression og funktion hos afkom og grand-afkom.

virkninger af cistancheekstrakt

2 METODER OG MATERIALER

2.1 Emner

Forsøgspersonerne var C57BL/6J-han- og hunmus (8-20 uger gamle, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Med undtagelse af opstaldning til haremsavl blev alle dyr gruppeopstaldet med en 12-timers lys/mørke cyklus og ad libitum adgang til mad og vand. Under selvadministration blev forsøgspersonerne fødevarebegrænset til 85 procent til 90 procent af deres kropsvægt, der var fri at spise, og vand blev givet ad libitum. Al adfærdstest fandt sted mellem 9:00 AM og 6:00 PM. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og godkendt af Penn State University, Temple University eller University of California Irvine IACUC komiteer.

2.2 Faderlig nikotineksponering

Mænd (8 uger) modtog 0,9 procent sterilt saltvand eller nikotinhydrogentartratsalt (12,6 mg/kg/dag, fri basevægt—Fisher Scientific, Waltham, MA eller MP Biomedical, Santa Ana, CA) opløst i 0,9 procent sterilt saltvand, leveret subkutant via osmotiske minipumper (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) i 28 dage. Denne dosis producerer nikotin- og cotininniveauer i plasma, der er sammenlignelige med dem, der ses hos moderate rygere.20,21

2.3 Generering af F1- og F2-mus

Halveringstiden for nikotin i mus er ca. 6 minutter.22 Det er tidligere blevet påvist, at virkningerne af nikotinabstinens forsvinder 4 dage efter nikotinfjernelse.23-25 Derfor er der en 4-dages forsinkelse mellem nikotinbehandling og avl blev implementeret for at sikre systemisk eliminering af nikotin før avl. Hanmus blev anbragt i bure med to naive C57BL/6 J-hunner (8-20 uger gamle) i 2 uger for at generere F1-afkom. F2-mus blev genereret ved at parre naive F1-hanmus med naive hunner.

2.4 Frygtkonditionering

Procedurer for frygtkonditionering og udryddelse er blevet beskrevet i detaljer tidligere.19 Kort fortalt blev mus trænet og testet i støjdæmpende kamre (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB baggrundsstøj; MED Associates, St. Albans, VT). F1- og F2-mus var frygtkonditionerede med to konditionerede stimuli (CS, 30 s, 85-dB hvid støj) - ubetinget stimulus (USA, 2 s, 0,57-mA fodchok) parringer adskilt af 120 sekunder. For at undersøge de akutte virkninger af nikotin på frygtkonditionering hos F1- og F2-mus modtog afkom akut nikotin (0,09 mg/kg, NIC-fribasevægt, ip; nikotinhydrogentartratsalt, Fisher Scientific) eller saltvand (SAL) 2 til 4 minutter før til træning og testsessioner. Fireogtyve timer efter træning blev musene returneret til træningskonteksten i 5 minutter for at vurdere kontekstuel frysning. Efter kontekstuel testning blev musene anbragt i særskilte kamre for at vurdere cued fear learning. Eksperimentører blev blindet for forhold vurderet frysning, defineret som fravær af frivillig bevægelse bortset fra respiration, via en upartisk tidsprøvetagningsmetode.19 For at undersøge potentielle lofteffekter under cued-testning modtog en separat kohorte af F1-mus identisk træning med kun én CS‐US parring og kontekstuel frygtudryddelse og spontan genopretning blev også undersøgt. Frygtudryddelsen fandt sted over fem på hinanden følgende sessioner, der startede dagen efter kontekstuel og cued-frygttest. Efter den sidste udryddelsessession blev musene efterladt uforstyrrede i deres hjemmebure i 7 dage og derefter gentestet i træningssammenhæng for spontan restitution. For at afgøre, om nogen observerede forskelle i frygtkonditionering skyldtes forskelle i chokfølsomhed, angst eller mere brede indlæringsproblemer, blev han- og hundyr NIC- og SAL-Sired desuden testet i et åbent felt, chokfølsomhed, forhøjet plus labyrint ( EPM) og nye objektgenkendelsesparadigmer (se Understøttende oplysninger for fuldstændige metoder og resultater).

2.5 Mad og intravenøs nikotin selvadministration

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 pellets pr. session på tværs af tre efterfølgende sessioner), blev forsøgspersonerne halsvenekateteriseret under isofluran (1 procent -3 procent)/iltdampbedøvelse, som tidligere beskrevet.26 Mus fik mere end eller lig med 72 timer til at komme sig efter operation før adgang at svare igen for en madbelønning. Genetablering af fødevarerespons sikrer, at musene er tilstrækkeligt restituerede efter intravenøs kirurgi og udviser normal operant respons efter en forsinkelse i adgangen til de operante kamre. Musene fik derefter lov til at erhverve intravenøs (IV) nikotin selvadministration i løbet af 1-times daglige sessioner, 6 til 7 dage om ugen (nikotinhydrogentartratsalt opløst i 0,9 procent sterilt saltvand, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/infusion, fri basevægt; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikotin blev leveret af en Razel-sprøjtepumpe (Med Associates). Hver session havde to tilbagetrækkelige håndtag (en aktiv, en inaktiv). Opfyldelse af responskriterierne på det aktive håndtag resulterede i levering af en IV nikotininfusion (0.{{20}}3 ml infusionsvolumen; FR5TO20 sek tidsplan). Svar på den inaktive håndtag blev registreret, men havde ingen planlagte konsekvenser. Efter otte optagelsessessioner ved 0,03 mg/kg/infusion skiftede infusionsdosis til 0,1 mg/kg/infusion i seks sessioner. For hver dosis blev det gennemsnitlige indtag af de sidste tre sessioner brugt til statistiske analyser. Katetre blev skyllet dagligt med fysiologisk sterilt saltvand (0,9 % vægt/volumen) indeholdende heparin (100 USP enheder/ml). Kateterets åbenhed blev verificeret med Brevital (methohexitalnatrium, Eli Lilly, Indianapolis, IN) efter nikotin-selvadministrationsfasen. For at vurdere tilbagefaldsrelateret adfærd blev musene testet for inkubation af trang efter sessionen umiddelbart efter den sidste 0,1 mg/kg/infusionsdosis af IV nikotin-selvadministration; i denne procedure får musene lov til at reagere på det aktive håndtag, men modtager ingen infusioner af nikotin. På den første baseline-inkubationssession (dag 1) blev mus placeret i operante kamre under FR5TO20 sek.-skemaet med kontingent signallys-aktivering. Derefter blev musene anbragt i hjemmebure i 20 dage. På dag 21 af afholdenhed blev musene undersøgt for inkubation af trang, hvor det aktive håndtagssignal blev leveret under FR5TO20 sek.-skemaet. Undersøgelser blev udført af forsøgspersoner, der var blindet for gruppeforhold, og adfærdsmæssige reaktioner blev automatisk registreret af MedAssociates-software.

2.6 Nikotinisk acetylcholin-receptorbinding

Et radioligandbindingsassay16 blev udført under anvendelse af hippocampi fra 8 uger gamle NIC-Sired (5 M og 10F) og SAL-Sired (9 M og 6F) F1-mus. Prøver blev homogeniseret under anvendelse af lyseringsbuffer (5 mM Tris plus 5 mM EDTA plus 5 mM EGTA), centrifugeret ved 100 000 g i 30 minutter ved 4 grader, resuspenderet i lyseringsbuffer og centrifugeret igen. Pellets blev resuspenderet i Tris/10 procent saccharosebuffer og inkuberet med [3H] Epibatidin ([3H]EB) (~2 nM baseret på 27,28) (specifik aktivitet 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) i 1 time ved stuetemperatur. [3H]EB blev valgt til nAChR-binding, da tidligere resultater viste, at hippocampus heteromere 4 2 nAChR'er medierer virkningerne af nikotin på frygtkonditionering.17 Ikke-specifik binding blev vurderet i nærvær af 300 μM nikotin (nikotinhydrogentartratsalt) opløst i Tris-buffer, fri basekoncentration). [3H]EB-bundne nAChR'er blev filtreret (24-brønds cellehøster, Brandel Co, Gaithersburg, MD), og en væskescintillationstæller (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) målte filterradioaktivitet. Specifik binding udtrykt som fmol/mg væv blev beregnet som forskellen mellem total og uspecifik binding.16

2.7 In vivo amperometriske kolinerge optagelser

En separat kohorte af naive 10- til 20 uger gamle NIC-Sired og SAL-Sired F1 mus blev brugt til at vurdere ændringer i hippocampus kolinerg transmission ved hjælp af amperometri. Keramisk-baserede mikroelektroder (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), med 4 (15 × 333 μm) platinoptagelsessteder arrangeret i par (øvre og nedre), blev coatet med cholinoxidasen (EF-nummer 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), som tidligere rapporteret.29 Elektroder blev elektropolymeriseret med meta-phenylendiamin (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for at øge selektiviteten til detektering af cholinstrømme. Mikroelektroder med en følsomhed på større end eller lig med 3pA/μM og detektionsgrænse mindre end eller lig med 400 nM for cholin blev brugt til at give et følsomt indeks for acetylcholin (ACh) frigivelse.30 Dyrene blev bedøvet med urethan (1,2-1,5) g/kg, ip), og enzymbelagte mikroelektroder blev stereotaksisk sænket til dorsale (A/P -1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V -2,3 mm) eller ventrale (A/P -3,1 mm, M) /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hippocampus. Ventral og dorsal hippocampus blev evalueret separat, da de forskelligt bidrager til kontekstuel frygtkonditionering: den ventrale hippocampus (vHPC) har en mere fremtrædende rolle i frygtassociation og udtryk, mens dorsale hippocampus (DHCP) er kritisk for kontekstuel hukommelse.31 Ag/ AgCl-referenceelektroder blev implanteret i den kontralaterale rostrale cortex.

Amperometriske optagelser blev udført ved 2 Hz ved at anvende et fast potentiale på plus 0,7 V, og data blev digitaliseret (FAST-16 potentiostat, Quainton, Nicholasville, KY). Baggrundsstrømme blev stabiliseret i 60 minutter, derefter blev lægemidler påført hippocampus ved hjælp af en glaskapillar (spidsdiameter: 15 μm) fastgjort til elektroden. Depolarisationsfremkaldt ACh-frigivelse blev målt ved at påføre enten korte pulser af kalium (KCl 70 mM; 100 NL) eller NIC (1 mM fribase, nikotintartrat; 100 NL) ved 2 til 10 psi hvert 2. minut. Optagelser blev udlignet for hippocampus-regionen (dorsal eller ventral) og lægemiddel (kalium eller NIC). Cholinsignalamplituder blev målt ved ændringen i strøm på den enzymbelagte kanal fra basislinjestrøm og omdannet til μM ækvivalenter af cholin baseret på in vitro-kalibrering. Selvreference blev vedtaget for at eliminere artefakter ved at trække strømme fra sentinel-kanaler.29 Mikroelektrodeplacering blev verificeret ved Nissl-farvning af koronale hippocampale sektioner (figur S1). Gennemsnit af to responser pr. lægemiddelmanipulation pr. dyr blev brugt til statistisk analyse.

2.8 Statistisk analyse

Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af SPSS (IBM, Armonk, NY) eller GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Outliers blev bestemt ved værdier 2 standardafvigelser over middelværdien. Hvis der blev opdaget en afviger, er oplysningerne inkluderet i resultatafsnittet. Kriteriet for signifikans blev sat til=.05. Statistisk analyse blev oprindeligt udført, herunder køn som en faktor for alle eksperimenter, der testede både mandlige og kvindelige afkom. Analyser blev kollapset på tværs af køn, når tre- eller to-vejs interaktioner med køn ikke blev påvist (P > 0,05). Data blev analyseret ved t-test, 1-vejs eller 2-vejs ANOVA, alt efter hvad der var relevant. Signifikante hoved- eller interaktionseffekter blev efterfulgt af LSD post hoc sammenligninger. Gentagne målinger ANOVA'er blev efterfulgt af Bonferroni post hoc sammenligning med korrektion for flere sammenligninger. Hvis der blev opdaget ulige varianser, blev Welchs t-test for ulige varianser brugt, og frihedsgrader blev rundet ned.

2.9 RNA/DNA-isolering

Voksne F1-mus (8 uger gamle; n=3 M og 3 F pr. gruppe) blev aflivet via cervikal dislokation. Hippocampi blev hurtigt dissekeret i ventrale og dorsale dele (i forholdet 1:1), samlet fra venstre og højre side og flash-frosset på tøris. DNA og RNA blev co-isoleret og oprenset ved hjælp af et AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA- og DNA-koncentration og kvalitet blev evalueret ved hjælp af NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) og Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). For RNA-ekstraktioner var det mindste RNA-integritetstal (RIN) 8,5.

2.10 Transkriptomanalyse via

RNA-sekventeringsbiblioteker blev udarbejdet af Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) til 150 bp single-end læsninger ved hjælp af Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) og sekventeret på Illumina HiSeq 2500 i hurtig kørselstilstand (tre på hinanden følgende kørsler med ca. 10 million aflæsninger pr. prøve). FASTQ-filer blev kvalitetskontrolleret via FASTQC og havde gennemsnitlig Phred-kvalitetsscore på mere end 30 pr. læst (dvs. mindre end 0,1 procent sekventeringsfejl). FASTQ-filer blev justeret til et musereferencegenom (mm10; UCSC Genome Browser) ved hjælp af TopHat (v2.1.0)32 på Galaxy Project33. Manchetknapper og Cuffmerge (v2.2.1.0)34 blev brugt til at samle transskriptioner fra kortlagte læsninger og flette transskriptionsfiler til endelig transkriptomsamling. Falsk discovery rate (FDR) justerede P-værdier blev beregnet for differentiel genekspression fra NIC-Sired og SAL-Sired prøver ved brug af Cuffdiff (v2.2.1.3),34 med en standard FDR cut-off på 0.05.35 transkriptomdatasæt blev deponeret til Genekspression Omnibus.

2.11 Berigelsesanalyse

Differentielt udtrykte gener blev analyseret ved hjælp af opfindsomhed pathway-analyse (IPA, kørt december 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, USA)36 for at afsløre potentiel berigelse af associative biologiske netværk. Kørselsparametre specificerede et maksimum på 35 molekyler pr. gennetværk og begrænset analyse til pattedyrs CNS-væv eller cellelinjer. Statistisk signifikans for berigelse blev bestemt ved hjælp af en højrehalet Fishers eksakte test korrigeret for multiple test.

2.12 Målrettet bisulfit-sekventering

DNA co-isoleret med RNA (se afsnit 2.9) blev brugt til DNA-methyleringsanalyse. RNA-seq identificerede 952 og 162 differentielt udtrykte gener i henholdsvis vHPC og DHCP. De 1010 unikke gener fra disse kombinerede lister blev udvalgt til berigelse i bisulfit-seq ved hjælp af et tilpasset SeqCap Epi Enrichment System (Roche, Pleasanton, CA, USA; Tabel S1).38 Målrettet bisulfit sekventering blev udført på Penn State Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility. Biblioteker blev konstrueret under anvendelse af KAPA Hyper Prep kit (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Natriumbisulfit-konverterede biblioteker blev PCR-amplificeret og beriget for udvalgte genomiske regioner ved hjælp af et brugerdefineret capture-probesæt (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, USA). Indfanget DNA blev sekventeret på Illumina HiSeq 2500 ved hjælp af 100 nt parret ende-aflæsninger. FASTQ-filer blev kvalitetskontrolleret via FASTQC. Illumina-adaptersekvenser blev fjernet, og lavkvalitetsbaser blev trimmet ved hjælp af Trimmomatic.39 Lavkvalitetsbasetrimning blev udført med en glidende vinduestilgang, trimning, når den gennemsnitlige kvalitet inden for et vindue med fire basepar faldt under en tærskel på 20, med en minimum læselængde på 35. Efter trimning havde FASTQ-filer en gennemsnitlig Phred-kvalitetsscore på mere end 30 pr. læst (dvs. mindre end 0,1 procent sekventeringsfejl). Trimmede læsninger blev kortlagt til musens referencegenom (mm10) ved hjælp af Bowtie240 implementeret i Bismark.41 Methyl_ekstrakt i Bismark blev brugt til at udtrække CpG-methyleringsinformation og til at oprette methyleringsrapporter. MethylKit42 blev brugt til analyse af differentielt methylerede regioner (DMR'er). Methyleringsstatus blev opsummeret over ikke-overlappende vinduer på 500 basepar, og differentiel methyleringsanalyse blev udført, med en standard FDR på 0.05.35 Datasæt er blevet deponeret til Gene Expression Omnibus.

Fordel ved cistancheekstrakt

3 RESULTATER

3.1 Faderlig nikotin forbedrer kontekstuel frygtkonditionering og reverserer akut nikotinforstærkning af kontekstuel frygtkonditionering i F1- og F2-generationsmus

NIC-Sired og SAL-Sired F1 han- og hunmus var frygtkonditionerede efter akut SAL- eller NIC-administration (0.09 mg/kg ip, figur 1A). Komplet analyse af baseline, pre-CS og CS-frysning er inkluderet i understøttende information. En 3-vejs ANOVA af kontekstuel frysning med farbehandling, akut lægemiddelbehandling og køn som faktorer afslørede en signifikant far × akut lægemiddelbehandlingsinteraktion (F(1,36)=32.75, P < .{{27="" }}01).="" fordi="" der="" ikke="" var="" nogen="" signifikant="" interaktion="" mellem="" køn="" og="" far="" eller="" akut="" lægemiddelbehandling,="" blev="" en="" 2-vejs="" anova="" kollapset="" på="" tværs="" af="" køn="" udført="" og="" afslørede="" en="" signifikant="" faderbehandling="" ×="" akut="" lægemiddelbehandlingsinteraktion="" (f(1,40)="20.96" ,="" p="">< 0,001).="" post="" hoc="" sammenligninger="" viste,="" at="" saltvandsbehandlede="" nic-sired="" f1-mus="" udviste="" forstærket="" kontekstuel="" frygtkonditionering="" sammenlignet="" med="" saltvandsbehandlede="" sal-sired="" f1-mus="" (t20="2.73," p="">< .05).="" i="" overensstemmelse="" med="" tidligere="" fund="" producerede="" 43="" akut="" nic="" ved="" 0,09="" mg/kg="" øget="" kontekstuel="" frygtkonditionering="" i="" sal-sired-mus="" (t22="2.99," p="">< .01).="" akut="" nic="" ved="" 0,09="" mg/kg="" svækkede="" imidlertid="" kontekstuel="" frygtkonditionering="" hos="" mus,="" der="" stammer="" fra="" nic="" (t18="3.36," p=""><.01). samlet="" set="" var="" kontekstfrysningsniveauer="" i="" nic-sired="" nic-mus="" sammenlignelige="" med="" dem,="" der="" blev="" observeret="" i="" sal-sired="" sal-mus="" ved="" begge="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

Derudover blev han- og hundyr NIC- og SAL-Sired testet i stødfølsomhed (figur S2), forhøjet plus labyrint (EPM, figur S3), åbent felt og nye objektgenkendelsesparadigmer (figur S4, se understøttende oplysninger for fuldstændige metoder) og resultater). Med undtagelse af NIC-Sired-hunner i EPM (som viste øget angstlignende adfærd) og NIC-Sired-dyr i chokfølsomhed (som viste nedsat vokalreaktivitet over for chok, hvilket ikke ville forvirre den øgede frygt ved at lære multigenerationel fænotype), ingen forskelle blev påvist mellem NIC- og SAL-Sired-mus.

FIGUR 1 Faderlig nikotin forbedrer kontekstuel frygtkonditionering og dæmper akut nikotinforstærkning af frygtkonditionering. Kontekstuel frysning var signifikant højere i NIC-Sired plus SAL sammenlignet med SAL-Sired plus SAL kontroller. Akut nikotin ved 0.09 mg/kg øget kontekstuel frygtkonditionering hos SAL-Sired, men signifikant reduceret kontekstuel frygt-konditionering hos NIC-Sired-dyr (n=10-12 pr. gruppe). B, Kontekstuel frysning var signifikant højere i NIC-grandsire plus SAL sammenlignet med SAL-grandsire plus SAL kontroller (n=9-11 pr. gruppe). Fejlbjælker angiver standardfejl for middelværdien (SEM), *P <>

For at bestemme, om forringet kontekstuel frygtkonditionering fortsatte ind i næste generation (F2), blev NIC-grandsire og SAL-grandsire han- og hun-F2-mus opdrættet fra naive F1-hanmus. Komplet analyse af baseline, pre-CS og CS-frysning er inkluderet i understøttende information. En 3-vejs ANOVA af kontekstuel frysning blev udført med storfaderbehandling, akut lægemiddelbehandling og sex som uafhængige faktorer (figur 1B). Fordi der ikke var nogen signifikant interaktion mellem køn og far eller akut lægemiddelbehandling, blev en 2-vejs ANOVA kollapset på tværs af køn udført. En signifikant hovedeffekt af far (F(1,37)=9.88, P < .01)="" blev="" fundet,="" og="" post="" hoc="" sammenligninger="" indikerede,="" at="" nic-grandsire="" mus="" udviste="" forstærket="" kontekstuel="" frygtkonditionering="" sammenlignet="" med="" sal-grandsire="" mus="" (t39="3.04," p="">< 0.01).="" derudover="" havde="" sal-grandsire-mus="" administreret="" akut="" nic="" forbedret="" kontekstuel="" frygtkonditionering="" (t19="2.41," p="0.026)," men="" akut="" nic="" forbedrede="" ikke="" kontekstuel="" frygtkonditionering="" i="">

FIGUR 2 Faderlig nikotin forbedrer cued fear conditioning og spontan genopretning af frygthukommelsen. For at undersøge potentielle lofteffekter under cued-testning modtog en separat kohorte af F1-mus identisk træning med kun én CS-US-parring. Både kontekstuel og cued fear conditioning blev forstærket i NIC-Sired-mus sammenlignet med SAL-Sired-mus trænet med 1 CS-US-parring (n=8-10 pr. gruppe). B, Faderlig nikotineksponering påvirkede ikke udryddelsen af ​​kontekstuel frygt, men forbedrede spontan genopretning af frygthukommelsen 7 dage efter den sidste udryddelsessession (n=8-10 pr. gruppe). Fejlbjælker angiver standardfejl for middelværdien (SEM), *P <>

3.2 Faderlig nikotin forbedrer cued fear conditioning i F1 generation mus

For at undersøge, om en lofteffekt udelukkede påvisning af gruppeforskelle for cued fear conditioning (se understøttende information), blev en separat gruppe F1-mus trænet med en CS-US-parring. I denne kohorte blev der fundet forbedring af kontekstuel frygtkonditionering (t7=3.21, P < .05)="" såvel="" som="" cued="" fear="" conditioning="" i="" nic-sired-mus="" (t6="2.41," p="">< .="" 05;="" figur="">

3.3 Faderlig nikotin øger spontan genopretning af kontekstuel frygthukommelse hos F1-generationsmus

Kohorten af ​​F1-mus, der modtog én CS-US-parring, blev efterfølgende testet for udryddelse og spontan genopretning af kontekstuel frygthukommelse. F1 NIC-Sired-mus viste normal frygtudryddelse, men viste forbedret spontan genopretning af kontekstuel frygthukommelse i forhold til SAL-Sired-mus (t7=3.38, P < 0.05;="" figur="">

3.4 Faderlig nikotin nedsætter nikotin selvadministration

Forud for træning til selvadministration af nikotin blev forsøgspersonerne analyseret for deres evne til at lære en operant opgave for at opnå madbelønning, og der blev ikke observeret nogen forskelle (understøttende information, figur S5). For at teste potentielle virkninger af fars nikotineksponering på nikotinforstærkning i F1-afkom, blev erhvervelse af IV nikotin-selvadministration (0.03 mg/kg/infusion) vurderet i en 2-vejs mixed-design ANOVA, som identificerede en hovedeffekt af session (F(7.119)=13.60, P < .001)="" og="" en="" session="" ×="" faderbehandlingsinteraktion="" (f(7.119)="5.00," p="">< .001).="" imidlertid="" afslørede="" post="" hoc-test="" ingen="" statistisk="" signifikante="" forskelle="" mellem="" grupperne="" på="" hver="" af="" de="" otte="" erhvervelsessessioner="" (figur="" 3a).="" antallet="" af="" aktive="" og="" inaktive="" håndtagstryk="" blev="" derefter="" analyseret="" for="" at="" bestemme,="" om="" grupperne="" opretholdt="" en="" præference="" for="" den="" aktive="" håndtag="" på="" tværs="" af="" sessioner="" under="" optagelsen="" (figur="" 3b),="" hvilket="" identificerede="" en="" hovedeffekt="" af="" sessionen="" (f(7.238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" og="" en="" session="" ×="" faderbehandlingsinteraktion="" (f(21.238)="11.40," p="">< .001).="" post="" hoc-analyse="" afslørede,="" at="" grupperne="" var="" forskellige="" på="" den="" første="" dag="" af="" nikotin="" selvadministration.="" nic-sired-gruppen="" udviste="" større="" aktiv="" håndtagspresning="" sammenlignet="" med="" sal-sired-gruppen.="" denne="" effekt="" kan="" enten="" repræsentere="" et="" højere="" niveau="" af="" lægemiddelsøgende="" adfærd="" på="" den="" første="" eksponeringsdag,="" udholdenhed="" i="" at="" reagere="" på="" madbelønning="" og/eller="" nedsat="" kognitiv="" fleksibilitet="" i="" overgangen="" til="" at="" reagere="" fra="" mad="" til="" lægemiddel.="" denne="" forskel="" bestod="" dog="" ikke="" på="" tværs="" af="" yderligere="" sessioner.="" sal-sired-mus="" udviste="" en="" konsekvent="" statistisk="" signifikant="" præference="" for="" det="" aktive="" håndtag="" frem="" for="" deres="" inaktive="" håndtag="" (post="" hoc="" p=""><.01), men="" nic-sired-mus="" udviste="" ikke="" denne="" fastholdte="" præference="" for="" session="" 3="" til="">

FIGUR 3 Faderlig nikotin reducerer selvadministration af nikotin. En NIC- og SAL-Sired hanmus (n=9-10 pr. gruppe) adskilte sig ikke i det samlede antal optjente infusioner for hver session i løbet af anskaffelsesperioden den 0 0,03 mg/kg/infusionsdosis. B, Under erhvervelsen afveg antallet af aktive og inaktive håndtagspresser signifikant ved den første session, hvor NIC-Sired mus-nikotin udviste et større antal aktive håndtagspresser sammenlignet med SAL-Sired-mus. På tværs af efterfølgende sessioner faldt NIC-Sired-mus imidlertid i deres respons, hvilket resulterede i ingen signifikante forskelle mellem deres aktive og inaktive antal håndtagstryk på tværs af session 3 til 8. I modsætning hertil udviste SAL-Sired-dyr en konsekvent statistisk signifikant præference for den aktive håndtag over deres inaktive håndtag. C, Det gennemsnitlige antal nikotin-infusioner på tværs af de tre sidste optagelsessessioner var ikke signifikant forskellige mellem NIC- og SAL-Sired-mus. D, Ved en moderat dosis på 0,1 mg/kg/infusion indgav NIC-Sired-mus selv et signifikant lavere antal nikotin-infusioner. E, Inkubation af trangvurdering afslørede en signifikant stigning i respons på den tidligere aktive håndtag efter 21 dages afholdenhed-kun for SAL-Sired mus. Fejlbjælker angiver standardfejl for middelværdien (SEM), *P <>

For yderligere at undersøge potentielle gruppeforskelle, mens der blev kontrolleret for variabilitet i den indledende fase af erhvervelsen, blev det gennemsnitlige antal nikotininfusioner undersøgt for de sidste tre sessioner, et tidspunkt, hvor forsøgspersonerne viste mere konsistente reaktioner for nikotin (figur 3C). Grupperne afveg ikke signifikant i det gennemsnitlige antal nikotininfusioner (P > .05). Derefter blev musene overført til en 0,1 mg/kg/infusionsdosis af nikotin, som tidligere har vist sig at være foretrukket i voksne C57BL6/J-mus.44 Ved denne dosis selvadministrerede NIC-Sired-mus et lavere antal infusioner (t{ {7}}.20, P < .05;="" figur="" 3d).="" til="" inkubation="" af="" trangadfærd,="" som="" betragtes="" som="" et="" mål="" for="" øget="" stofsøgning="" under="" afholdenhed,="" identificerede="" en="" 2-vejs="" mixed-design="" anova="" med="" sessions-="" og="" farbehandling="" hovedeffekten="" af="" ​​sessionen="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p=""><.001). mens="" sal-sired-dyr="" udviste="" en="" inkubationseffekt="" med="" større="" respons="" på="" dag="" 21="" af="" abstinens="" sammenlignet="" med="" dag="" 1,="" viste="" nic-sired-mus="" ikke="" en="" stigning="" i="" nikotin-søgende="" adfærd="" (p=""><>

3.5 Faderlig nikotineksponering ændrer hippocampus kolinerge binding og funktion

Hippocampus heteromer nAChR-binding med høj affinitet blev opreguleret i NIC-Sired F1-mus (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic-sired="1.34" ±="" 0,044).="" ét="" forsøgsperson="" (nic-sired)="" blev="" fjernet,="" fordi="" bindingsværdierne="" var="" to="" standardafvigelser="" over="">

Amperometriske optagelser af kalium- og nikotin-fremkaldte ACh-strømme blev vurderet i F1 dHPC og vHPC. På grund af ulige prøvestørrelser pr. køn blev køn ikke inkluderet som en foreløbig faktor i disse analyser. KCl-depolarisationsfremkaldte cholinerge signaler var ikke forskellige mellem SAL- og NIC-Sired-mus i dHPC (P > 0,05; figur 4A); lokal nikotinpåføring resulterede imidlertid i en signifikant reduktion i cholinerge signalamplituder hos NIC-Sired-mus (t8=2.33, P <.05; figur="" 4c).="" i="" vhpc="" blev="" ach-frigivelse="" reduceret="" i="" nic-sired-mus="" efter="" påføring="" af="" kcl="" (t8="2.60," p=""><.05; figur="" 4b)="" eller="" nikotin="" (t8="2.98," p=""><.05 figur="">

FIGUR 4 Faderlig nikotin reducerer cholinerg signalering i hippocampus. En dHPC population cholin signaler fremkaldt af KCl-induceret terminal depolarisering. Der blev ikke påvist signifikante forskelle mellem NIC- og SAL-Sired-dyr (n=5 pr. gruppe). B, vHPC population cholin signaler fremkaldt af KCl-induceret terminal depolarisering blev reduceret i NIC-Sired mus. C, Nikotin-fremkaldt population dHPC-cholinsignaler blev reduceret i NIC-Sired-mus. D, Nikotin-fremkaldt population vHPC-cholinsignaler blev reduceret i NIC-Sired-mus. Ingen effekter af sex på kolinerg signalering blev observeret. Fejlbjælker angiver standardfejl for middelværdien (SEM), *P <>

3.6 Faderlig nikotineksponering ændrer differentielt dorsal og ventral hippocampal genekspression

F1 hippocampal transkriptomanalyse via RNA-sekventering afslørede 952 differentielt udtrykte gener i vHPC (FDR=0.05; Tabel S2). Af disse gener blev 612 nedreguleret og 340 blev opreguleret i NIC-Sired mus. I dHPC blev kun 162 gener differentielt udtrykt i NIC-Sired-mus sammenlignet med SAL-Sired-mus (FDR=0.05). Af disse 162 gener blev 86 nedreguleret og 76 opreguleret. Et hundrede tre gener med ændret genekspression overlappede mellem vHPC og dHPC.

3.7 Faderlig nikotineksponering ændrer transkriptionelle veje involveret i nervesystemets udvikling

I vHPC identificerede IPA-analyse topnetværket "Neurologisk sygdom, organismskade og abnormiteter, celledød og overlevelse" (score=41, tabel S3) og det andet topnetværk "Nervesystemudvikling og -funktion, vævsmorfologi, neurologisk Sygdom" (score=23). De fem øverste kategorier af molekylære og cellulære funktioner var: "Cellemorfologi" (88 molekyler), "Cellulær samling og organisation" (79 molekyler), "Cellulær udvikling" (96 molekyler), "Cellulær funktion og vedligeholdelse" (79 molekyler), og "Cellular Growth and Proliferation" (87 molekyler). De øverste fysiologiske systemudvikling og funktion var "Nervesystemets udvikling og funktion" (175 molekyler), og nogle af de bedste sygdoms- og lidelsesfunktioner inkluderer "neurologisk sygdom" (anden, 191 molekyler) og "psykologiske lidelser" (fjerde, 90 molekyler) ) (Tabel S4).

Supplerende til IPA-resultaterne gav berigelsesanalyse ved hjælp af Enrichr yderligere bevis for ændringer i cellulær vækst og udvikling i vHPC, med top GO biologiske termer, herunder "RNA-splejsning", "respons på udfoldet protein" og "regulering af cellevækst" og " proteinstabilisering" (tabel S5). Tilsvarende blev "spliceosomal kompleks" identificeret som en top GO cellulær term. KEGG pathway-analyse via Enrichr pegede desuden på spliceosomfunktion og MAPK-signalering som potentielt påvirkede veje.

På trods af en betydeligt kortere liste over differentielt udtrykte gener i dHPC sammenlignet med vHPC, blev lignende dHPC-berigede veje og udtryk identificeret (Tabel S3 og S4). IPA-analyse identificerede topnetværket "Adfærd, Neurologisk sygdom, Organismisk skade og abnormiteter" (score=24) og det andet topnetværk "Neurologisk sygdom, Organismisk skade og abnormiteter og psykologiske lidelser (score=20) .

De fem øverste kategorier af molekylære og cellulære funktioner i dHPC var "Cellulær udvikling" (29 molekyler), "Cellulær vækst og spredning" (29 molekyler), "Cellemorfologi" (27 molekyler), "Cellulær samling og organisation" (23 molekyler) og "Cellulær funktion og vedligeholdelse" (25 molekyler). "Nervesystemudvikling og -funktion" blev igen identificeret som et topberiget udtryk under klassificeringen af ​​fysiologisk systemudvikling og -funktion (for det andet, 44 molekyler). Topberigede udtryk under funktionsklassifikationen for sygdomme og lidelser inkluderede "Neurologisk sygdom" (1., 51 molekyler) og "psykologiske lidelser" (femte, 31 molekyler). Berigelsesanalyse ved hjælp af Enrichr identificerede flere forskellige GO biologiske termer for dHPC sammenlignet med vHPC, herunder "regulering af neurondød" og "hjerneudvikling" (tabel S5), som er komplementær til IPA's molekylære og cellulære funktion "Cell Death and Survival."

For yderligere at udforske den funktionelle rolle af differentielt udtrykte transkripter, der overlapper mellem dHPC og vHPC, blev differentielt udtrykte gener, der er fælles for begge regioner (103 i alt), evalueret. Overlappende differentielt udtrykte transkripter mellem de to regioner blev alle nedreguleret eller opreguleret i samme retning, hvilket tyder på almindelige ændringer i transkriptionelle veje på tværs af hjerneregioner i NIC-sired mus. De fem øverste kategorier af molekylære og cellulære funktioner identificeret af IPA var "Celledød og overlevelse" (17 molekyler), "Cellulær bevægelse" (10 molekyler), "Cell-til-celle-signalering og interaktion" (17 molekyler), "Cellulær vækst". and Proliferation" (18 molekyler) og "Cellemorfologi" (17 molekyler) (tabel S4)

Differentielt udtrykte gener, der er unikke for dHPC og vHPC, blev efterfølgende analyseret separat i IPA for at teste for divergerende neurobiologiske tilpasninger mellem de to regioner (tabel S6). Ingen berigede kanoniske veje overlappede mellem de unikke vHPC unikke dHPC-analyser. Topberigede kanoniske pathways unikke for vHPC (44 i alt) inkluderede "Calcium signaling" og "Glucocorticoid receptor signaling", mens top dHPC kanoniske pathways (otte i alt) inkluderede "thyroidhormonmetabolisme" og "retinsyremedieret apoptosesignalering." Berigede sygdomme og funktioner unikke for vHPC (295 i alt) inkluderede "dannelse af [Hippocampus] Ammons horn" og "mængde af cellulære fremspring", mens unikt dHPC-berigede sygdomme og funktionsudtryk (111 i alt) inkluderede "betændelse af hvidt stof" og "demyelinisering ."

3.8 Faderlig nikotineksponering ændrer hippocampus DNA-methylering

En målrettet DNA-methyleringsanalyse blev udført for at bestemme, om ændret DNA-methylering i tilsvarende regulatoriske regioner stod for den differentielle genekspression i NIC-Sired F1-afkom. Mål inkluderede 1114 differentielt udtrykte gener identificeret i enten dHPC eller vHPC. I vHPC blev 11 differentielt methylerede regioner (DMR'er) påvist, hvor otte viste øget methylering og tre viste nedsat methylering (tabel 1). Af de 11 DMR'er var 10 lokaliseret i regioner forbundet med et gen, der udviste ændret ekspression i vHPC. I dHPC'en blev 30 DMR'er påvist, hvor 15 viste øget methylering og 15 viste nedsat methylering. Af de 30 DMR'er var 29 lokaliseret i regioner forbundet med et gen, der udviste ændret ekspression i dHPC.

Benefit af cistanche echinacoside

4 DISKUSSION

Øget forståelse af epigenetiske processer i forbindelse med nyere data, herunder de nuværende resultater, har udfordret den traditionelle forståelse af arv. Faktorer ud over genotype alene kan bestemme fænotyper i efterfølgende generationer, og eksponeringer inden for en generation bliver muligvis ikke sekvestreret fra afkom. Den nuværende undersøgelse tyder på, at de sundhedsskadelige virkninger af nikotineksponering kan overskride individuel eksponering og påvirke efterfølgende generationer. Vi identificerede multigenerationelle og transgenerationelle effekter af prækonception faderlig nikotineksponering i C57BL/6J-mus på Pavlovsk frygtkonditionering, hvilket resulterede i stærkere frygtminder i F1- og F2-afkom. Faderlig nikotineksponering resulterede også i nedsat nikotin-selvadministration og svækket tilbagefaldsrelateret adfærd, hvilket tyder på en større afersiv reaktion på nikotin. Til støtte for disse adfærdsforskelle blev der observeret multigenerationelle ændringer i hippocampus kolinerge funktion og epigenetiske processer. Tilsammen peger disse resultater på ændringer i nervesystemets funktion i afkommet af nikotin-eksponerede mus, hvilket resulterer i ændrede adfærdsfænotyper.

F1- og F2-afkom fra hanmus udsat for nikotin udviste forbedret kontekstuel og cued-frygtkonditionering. På trods af ingen forskelle i kontekstuel frygtudryddelse mellem NIC- og SAL-Sired F1-mus, viste NIC-Sired-mus forbedret spontan genopretning af kontekstuelle frygtminder. Det er vigtigt, at der ikke blev fundet nogen forskelle i stødfølsomhed mellem NIC- og SAL-Sired-mus, der kunne forklare øget frygtkonditionering. Forbedret frygtkonditionering kan tyde på generaliseret forbedring af læreprocesser i modsætning til modulering af processer, der er mere specifikke for frygt for at lære. Der blev dog ikke observeret ændringer i genkendelse af nye objekter, operant fodertræning eller bevægelse i åbent felt i NIC-Sired-mus, selvom en kønsspecifik effekt af øget EPM-åbningstid i NIC-Sired-hunmus blev identificeret. Selvom dette ikke udelukker potentielle ændringer af andre læringssystemer eller kognitive processer, tyder disse resultater sammen på, at frygtindlæring kan være mere følsom over for de multigenerationelle og transgenerationelle virkninger af faderlig nikotineksponering. Desuden tyder disse fund på en ændret kolinerg funktion i NIC-Sired dyr. Nikotin modulerer kontekstuel frygtkonditionering. Mens akut nikotin øger kontekstuel frygtkonditionering, 15,45 forstyrrer abstinenser fra kronisk nikotin kontekstuel frygtkonditionering.16,21 I denne undersøgelse forstærkede akut nikotin kontekstuel frygtkonditionering i F1- og F2-mus fra saltvandsbehandlede mus. I modsætning hertil forstyrrede akut nikotin kontekstuel frygtkonditionering i NIC-Sired-mus og havde ingen effekt i NIC-grandsire-mus, hvilket kan pege på ændret kolinerg funktion i hippocampus.

Virkningerne af faderlig nikotineksponering på efterfølgende nikotin-selvadministration i F1-generationen peger også på forstyrret kolinerg funktion. Under erhvervelsen af ​​IV nikotin-selvadministration ved den lavere dosis adskilte grupperne sig ikke i antallet af nikotin-infusioner, selvom en stigning i antallet af aktive håndtagspresser blev fundet i NIC-Sired-gruppen. Dette tyder på, at NIC-Sired-musene kan have udvist udholdenhed i at reagere på madbelønning og/eller nedsat kognitiv fleksibilitet i overgangen til at reagere fra mad til lægemiddel. Det er dog også værd at bemærke, at grupperne ikke var forskellige på dag 1 af inkubation af trang, hvilket repræsenterer en udryddelsessession (f.eks. ingen nikotin-infusioner under sessionen), og derfor ser denne effekt ud til at have været til stede, når forstærkere er skiftet, men ikke i mangel af en forstærker under en ekstinktionssession. NIC-Sired-musene udviste også nedsat nikotin-selvadministration ved den moderate dosis, hvilket stemmer overens med nyligt arbejde med at identificere fald i alkohol-, kokain- og opioidadministration forbundet med forældres alkohol-, kokain- og morfineksponering (f.eks. Vassoler et al,46 som anmeldt i Goldberg og Gould47). Den observerede reduktion i selvadministration af nikotin kan tilskrives enten nedsat følsomhed over for de givende virkninger af nikotin og/eller øget følsomhed over for nikotins aversive virkninger. Faktisk adskilte grupperne sig ved den moderate nikotindosis, men ikke den lavere nikotindosis, hvilket understøtter forestillingen om en øget afersiv respons med den højere dosis. Interessant nok fandt vi også en mangel på inkubation af trang på dag 21 i NIC-Sired-mus efter selvadministration ved den moderate dosis, hvilket tyder på, at nedsat nikotin-søgende adfærd kunne være relateret til en aversionsassocieret hukommelse for nikotin. Selvom forskellige neurale substrater kan ligge til grund for disse virkninger på nikotinindtagelse og tilbagefaldsrelateret respons, fandt en nylig undersøgelse, at nedsat DNA-methyltransferase i hippocampus CA1-regionen reducerede morfin-selvadministration.48 Dette fund, sammen med den kendte funktion af kolinerg hippocampus funktion i lærings- og hukommelsesprocesser, understøtter yderligere forestillingen om forstyrret nikotin-medieret behandling i hippocampus af NIC-Sired mus.

Langs disse linjer udviste NIC-Sired-mus øget hippocampus højaffinitets-nAChR-binding. Vi fandt også reduktioner i kalium-fremkaldt ACh-frigivelse i vHPC såvel som i nikotin-fremkaldt ACh-frigivelse i både dHPC og vHPC af NIC-Sired-dyr. Ændringer i depolarisationsfremkaldt ACh-frigivelse afspejler ændret cholinerg funktion nedstrøms for receptorbinding, mens ændringer i nikotin-fremkaldt ACh-frigivelse afspejler ændret nAChR-funktion. Disse data er i overensstemmelse med tidligere fund af opreguleret højaffinitets nAChR-binding efter nedsat nAChR-funktion.49 Fordi både kalium-fremkaldt og nikotin-fremkaldt ACh-frigivelse blev ændret i vHPC af NIC-Sired-mus, kan vHPC være mere følsom overfor de multigenerationelle virkninger af faderlig nikotineksponering. DHPC er kendt for at modulere kontekstuel frygtkonditionering.31,50 Hæmning af vHPC forstyrrer både cued og kontekstuel frygttilstand ing51,52 og vHPC kolinerge læsioner svækker cued fear conditioning.53

Urtecistanche

Vi har også vist, at direkte nikotininfusion i dHPC forbedrer kontekstuel frygtkonditionering, mens infusion i vHPC forstyrrer kontekstuel frygtkonditionering.15 vHPC kan også modulere spontan gendannelse af kontekstuelle frygtminder, da inaktivering af vHPC-prælimbiske kredsløb mindsker spontan gendannelse af kontekstuelle frygtminder. 54 Mens andre hjerneregioner involveret i frygtkonditionering, såsom amygdala,55 også kan være påvirket af faderlig nikotineksponering, tyder disse resultater sammen med de nuværende data på, at ændringer i vHPC-funktionen kan være ansvarlige for ændret frygtkonditionering hos NIC-Sired mus . Vi antog, at de multigenerationelle virkninger af faderlig nikotineksponering kan være relateret til ændringer i transkriptionelle effektorer, der virker opstrøms for disse neurale systemer. Genomomfattende transkriptionel sekventering i vHPC og dHPC af F1-generationsmus identificerede 1114 differentielt udtrykte gener mellem NIC- og SAL-Sired-mus. Denne forskel var større i vHPC (952) versus dHPC (162), på linje med den større ændring i vHPC i forhold til dHPC kolinerge funktion og ændringer i både kontekstuel og cued fear conditioning. Efterfølgende pathway-analyse foreslog brede ændringer af transkriptionelle veje forbundet med glukokortikoid signalering og neural udvikling/plasticitet i begge hippocampale regioner.

For at identificere potentielle tilpasninger, der er specifikke for vHPC, blev pathway-analyse udført ved kun at bruge transkripter, der er specifikke for enten hippocampus subregion. Ingen berigede IPA kanoniske veje overlappede mellem vHPC og dHPC, som er funktionelt adskilte subregioner af hippocampus.31 Da gener, der overlappede mellem dHPC og vHPC blev fjernet, inkluderede topberigede kanoniske veje unikke for vHPC "Glucocorticoid Receptor Signaling", hvilket tyder på en unik , yderligere ændring af glukokortikoid funktion i denne region sammenlignet med dHPC. Med det formål at identificere opstrøms epigenetiske regulatorer, der kan virke på genekspression, udførte vi målrettet DNA-methyleringssekventering ved hjælp af den kompilerede liste over dHPC og vHPC differentielt udtrykte gener identificeret fra RNA-sekventering. Overraskende nok fandt vi kun 11 DMR'er i vHPC og 30 DMR'er i dHPC mellem NIC- og SAL-Sired dyr. Selvom dette er uventet i betragtning af det meget højere antal differentielt udtrykte transkripter i vHPC, er DNA-methylering kun en af ​​flere regulatoriske faktorer, der kan påvirke genekspression, og DNA-methylering oversættes ikke konsekvent til ændret genekspression.56 Af de 11 vHPC DMR'er, syv udviste methyleringsmønstre i overensstemmelse med retningen af ​​differentiel transkription (nedsat transkription med øget DNA-methylering og øget transkription med reduceret methylering). Differentielt methylerede gener i vHPC inkluderede Fkbp5, Ksr1 og Pnpla2. Interessant nok blev Fkbp5- og Ksr1-transkription afbrudt i en adfærdsmæssig musemodel af PTSD57, hvor mus blev udsat for et elektrisk fodchok og derefter præsenterede situationelle påmindelser. Fkbp5 koder for en glukokortikoid receptor chaperon, hvis funktion har været forbundet med en utilpasset langvarig stressrespons hos personer med PTSD og andre angstlidelser.58

Specifikt viser humane undersøgelser, at Fkbp5-methylering og transkription korrelerer med sværhedsgraden af ​​PTSD-symptomer, således at øget methylering og nedsat transkription forudsiger mere alvorlig PTSD-symptomologi.59,60 Fkbp5-ekspression modulerer HPA-aksens funktion, hvilket menes at mediere dets involvering i PTSD.59,61 Vores opdagelse af øget spontan genopretning af frygthukommelse i forbindelse med dysregulering af transkriptionelle veje forbundet med glukokortikoid-signalering hos NIC-Sired-dyr kan pege på øget sårbarhed over for PTSD-lignende fænotyper. I dHPC var DMR-mønstre stort set uoverensstemmende med retningen af ​​differentiel transkriptekspression fundet ved RNA-sekventering, hvilket tyder på, at ændringer i vHPC DNA-methylering produceret af faderlig nikotineksponering er mere konsekvensmæssige med hensyn til at påvirke genekspression end dem i dHPC. Dette er i tråd med vores identifikation af et større antal differentielt udtrykte transkripter og mere overdrevne ændringer i kolinerg transmission i NIC-Sired vHPC sammenlignet med dHPC. Vores målrettede sekventeringstilgang kan have begrænset evnen til at detektere potentiel transkriptionel regulering af distalt methylerede sekvenser. Fremtidige undersøgelser, herunder analyse af genom-dækkende DNA-methylering, histonmodifikationer og lille RNA-ekspression vil give en mere fuldstændig fortolkning af disse fund.

En potentiel begrænsning af vores nikotineksponeringsdesign er fokus på faderlig nikotineksponering for at undersøge den multigenerationelle og transgenerationelle virkning af nikotineksponering. Selvom andre undersøgelser, der fandt multi/transgenerationelle fænotyper efter faderlig stofeksponering, inklusive kokain46 og morfin62, ikke fandt nogen forskelle i moderpleje, er det muligt, at faderlig nikotineksponering kan påvirke moderens omsorg. Fremtidige undersøgelser, der undersøger indvirkningen på mødrepleje, er berettigede. Da vores nuværende fokus var på faderlig eksponering, bør fremtidigt arbejde også sammenligne virkningerne af faderlig vs modereksponering. Samlet set giver de nuværende resultater en ny forståelse af de multigenerationelle og transgenerationelle virkninger af nikotineksponering, som understøttes af en voksende litteratur, der karakteriserer multigenerationelle og transgenerationelle virkninger af lægemiddeleksponering (som gennemgået i Goldberg og Gould47). Denne undersøgelse var den første til at teste kontekstuel frygtkonditionering i F1- og F2-afkom af nikotin-eksponerede mænd og identificerede forbedret frygthukommelsesdannelse og spontan genopretning af frygtminder. Denne undersøgelse var også den første til at identificere ændret nikotin-selvadministration og inkubation af trang hos F1 nikotin-eksponeret afkom.

Differentiel methylering i gener forbundet med PTSD og HPA-akse dysregulering samt samtidige forstyrrelser i stress-relaterede transkriptionsveje blev fundet i NIC-Sired mus. Faderlig nikotin var også forbundet med nedsat hippocampus kolinerg funktion og øget hippocampus nAChR-binding. Interessant nok viser PTSD-patienter, der ikke røg, signifikant højere mesiotemporal kortikal højaffinitets nAChR-binding63, og PTSD er forbundet med større frygtkonditionering og spontan genopretning af slukkede frygtminder.64 Sammen tyder vores resultater på, at nikotineksponering kan have en multigenerationel effekt af øget afkoms modtagelighed for PTSD-lignende symptomologi. Dette fund sammen med andre nylige resultater, der viser multigenerationelle effekter af nikotineksponering på kognitiv fleksibilitet2 tyder på, at de negative sundhedsresultater af nikotineksponering kaster et bredere net end tidligere antaget.

Cistanche ekstrakt

REFERENCER

1 Dai J, Wang Z, Xu W, et al. Faderlig nikotineksponering definerer forskellig adfærd i efterfølgende generation via hypermethylering af mmu-miR-15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr. Lowe SE, et al. Nikotineksponering af hanmus giver adfærdssvækkelse hos flere generationer af efterkommere. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Transgenerationel overførsel af hyperaktivitet i en musemodel af ADHD. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Det skiftende offentlige billede af rygning i USA: 1964-2014. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2014;23(1):32-36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Elektronisk cigaretbrug blandt gymnasieelever og dets sammenhæng med cigaretbrug og rygestop, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 og 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, et al. Langsigtede virkninger af kronisk nikotin på følelsesmæssig og kognitiv adfærd og hippocampus cellemorfologi hos mus: sammenligninger af voksen og teenagers nikotineksponering. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Sammenhæng mellem cigaretrygning og angstlidelser i ungdomsårene og tidlig voksenalder. JAMA. 2000;284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, et al. En epigenetisk mekanisme medierer udviklingsmæssige nikotineffekter på neuronal struktur og adfærd. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. Cholin forbedrer voksnes læringsunderskud og reverserer epigenetisk modifikation af kromatinomdannelsesfaktorer relateret til teenagers nikotineksponering. Neurobiol Lær Mem. 2018;155:239-248.

10. Fugl A. Perceptions of epigenetics. Natur. 2007;447:396-398.

11. Skinner MK. Miljø epigenetisk transgenerationel arv og somatisk epigenetisk mitotisk stabilitet. Epigenetik. 2011;6:838-842.

12. Davis JA, Gould TJ. Associativ læring, hippocampus og nikotinafhængighed. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9‐19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Nikotinafhængighed og psykiatriske lidelser. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171-208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. nAChR-dysfunktion som et fælles substrat for skizofreni og komorbid nikotinafhængighed: aktuelle tendenser og perspektiver. Schizophr Res. 2016;171:1-15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Nikotiniske receptorer i den dorsale og ventrale hippocampus modulerer differentielt kontekstuel frygtkonditionering. Hippocampus. 2012;22:1681-1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Genetisk baggrund påvirker virkningerne af abstinenser fra kronisk nikotin på indlæring og nikotinacetylcholin-receptorbinding med høj affinitet i den dorsale og ventrale hippocampus. Psykofarmakologi (Berl). 2013;225(1): 201-208.

17. Davis JA, Gould TJ. Virkningerne af DHBE og MLA på den nikotin-inducerede forbedring af kontekstuel frygtkonditionering i C57BL/6-mus. Psykofarmakologi (Berl). 2006;184:345-352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Pre-adolescent og teenager mus er mindre følsomme over for virkningerne af akut nikotin på udryddelse og spontan restitution. Brain Res Bull. 2018;138:50-55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Akut nikotin forsinker udryddelsen af ​​kontekstuel frygt hos mus. Behav Brain Res. 2014;263:133-137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3rd. Nikotinkemi, metabolisme, kinetik og biomarkører. I: Nikotin psykofarmakologi. Berlin, Heidelberg: Springer; 2009:29-60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Tilbagetrækning fra kronisk nikotinadministration svækker kontekstuel frygtkonditionering hos C57BL/6-mus. J Neurosci. 2005;25:8708-8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. En sammenlignende undersøgelse af dispositionen af ​​nikotin og dets metabolitter i tre indavlede musestammer. Drug Metab Dispos. 1984;12:725-731.

23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM, et al. Varigheden af ​​nikotinabstinensassocierede underskud i kontekstuel frygtkonditionering er parallel med ændringer i hippocampus højaffinitetsnikotinacetylcholinreceptoropregulering. Neurofarmakologi. 2012;62:2118-2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu-Chen LY, Gould TJ. Forringelse af kontekstuel frygtudryddelse ved kronisk nikotin og tilbagetrækning fra kronisk nikotin er forbundet med hippocampus nAChR-opregulering. Neurofarmakologi. 2016;109:341-348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Karakterisering af spontan og udfældet nikotinabstinenser hos mus. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Habenulær alpha5 nikotinreceptorsubunit-signalering styrer nikotinindtaget. Natur. 2011;471:597-601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Kvantitativ analyse af de heteromere neuronale nikotinreceptorer i rottehippocampus. J Neurochem. 2010;115:625-634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Parallelle anxiolytisk-lignende virkninger og opregulering af neuronale nikotiniske acetylcholinreceptorer efter kronisk nikotin og vareniclin. Nicotine Tob Res. 2011;13:41-46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Præfrontale beta2-underenhedsholdige og alpha7 nikotiniske acetylcholinreceptorer kontrollerer differentielt glutamaterg og cholinerg signalering. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.

30. Parikh V, Starter M. Forhjernens kolinerge systemer og kognition: ny indsigt baseret på hurtig påvisning af cholinspidser ved hjælp af enzymbaserede biosensorer. I: Microelectrode Biosensors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013:257-277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Er den dorsale og ventrale hippocampus funktionelt adskilte strukturer? Neuron. 2010;65(1):7-19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: nøjagtig justering af transkriptomer i nærværelse af insertioner, deletioner og genfusioner. Genom Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. Galaxy-platformen for tilgængelige, reproducerbare og kollaborative biomedicinske analyser: 2016-opdatering. Nucleic Acids Res. 2016;44:W3‐w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et al. Transkriptsamling og kvantificering med RNA-Seq afslører uannoterede transkripter og isoformskift under celledifferentiering. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511-515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Kontrol af den falske opdagelsesrate i adfærdsgenetikforskning. Behav Brain Res. 2001; 125(1-2):279-284.

36. Kramer A, Green J, Pollard Jr., Tugendreich S. Causal analyse tilgange i Opfindsomhed Pathway Analysis. Bioinformatik. 2014;30(4): 523-530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et al. Enrichr: en omfattende gensæt berigelse analyse webserver 2016 opdatering. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1): W90-W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Målrettet bisulfit-sekventering ved hjælp af SeqCap epi-berigelsessystemet. Metoder Mol Biol. 2018;1708:383-405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: en fleksibel trimmer til Illumina-sekvensdata. Bioinformatik. 2014;30(15):2114-2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Hurtig justering med mellemrum med Bowtie 2. Nat-metoder. 2012;9(4):357-359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: en fleksibel aligner og methyleringsopkald til Bisulfite-Seq applikationer. Bioinformatik. 2011;27(11):1571-1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, et al. methylKit: en omfattende R-pakke til analyse af genom-dækkende DNA-methyleringsprofiler. Genom Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotin forbedrer kontekstuel frygtkonditionering og forbedrer ethanol-inducerede underskud i kontekstuel frygtkonditionering. Opfør Neurosci. 2003;117(6):1276-1282.

44. Fowler CD, Kenny PJ. Intravenøs nikotin selvadministration og cue-induceret genindsættelse i mus: virkninger af nikotin dosis, hastighed af lægemiddelinfusion og forudgående instrumentel træning. Neurofarmakologi. 2011;61(4):687-698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Nikotinforstærkning af kontekstuel frygtkonditionering. Behav Brain Res. 1999;102(1-2):31-39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri-Vakili G, Pierce RC. Epigenetisk arv af en kokain-resistens fænotype. Nat Neurosci. 2013;16(1):42-47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Multigenerationelle og transgenerationelle virkninger af faderlig eksponering for misbrugsstoffer på adfærdsmæssig og neural funktion. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453-2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, et al. DNMT3a i hippocampus CA1 er afgørende i erhvervelsen af ​​morfin-selvadministration hos rotter. Addict Biol. 2019;▪:▪‐▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Nikotiniske kolinerge receptorbindingssteder i hjernen: regulering in vivo. Videnskab. 1983;220(4593):214-216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Hippocampale læsioner forårsager indlæringsmangel hos indavlede mus i Morris-vandlabyrinten og betinget frygtopgave. Opfør Neurosci. 1997;111(1):104-113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Den ventrale hippocampus og frygtkonditionering hos rotter: forskellige anterograd amnesi af frygt efter infusion af N-methyl-D-aspartat eller dets ikke-kompetitive antagonist MK-801 i den ventrale hippocampus. Behav Brain Res. 2001;126(1-2):159-174.

52. Maren S, Holt WG. Hippocampus og Pavlovsk frygtkonditionering hos rotter: muscimolinfusioner i den ventrale, men ikke dorsale, hippocampus hæmmer erhvervelsen af ​​betinget frysning til en auditiv betinget stimulus. Opfør Neurosci. 2004;118(1):97-110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Afbrydelse af de mediale septum og diagonale bånd af Broca cholinerge projektioner til den ventrale hippocampus forstyrrer den auditive frygthukommelse. Neurobiol Lær Mem. 2018;152:71-79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Banespecifik aktivering af ventrale hippocampale celler, der projicerer til den prælimbiske cortex, mindsker frygtfornyelse. Neurobiol Lær Mem. 2019;161:63-71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Den laterale amygdaloidkerne: den sensoriske grænseflade af amygdala i frygtkonditionering. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.

56. Jones PA. Funktioner af DNA-methylering: øer, startsteder, genlegemer og videre. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484-492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X, et al. Region- og tidsafhængig genregulering i amygdala og anterior cingulate cortex af en PTSD-lignende musemodel. Mol Hjerne. 2019;12(1):25.

58. Bindemiddel EB. Rollen af ​​FKBP5, en co-chaperone af glukokortikoidreceptoren i patogenesen og terapien af ​​affektive lidelser og angstlidelser. Psykoneuroendokrinologi. 2009;34(Suppl 1): S186‐S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et al. Genetiske markører for PTSD-risiko og modstandsdygtighed blandt overlevende fra World Trade Center-angrebene. Dis Markører. 2011;30(2-3):101-110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. Epigenetiske biomarkører som forudsigere og korrelater af symptomforbedring efter psykoterapi i kampveteraner med PTSD. Front Psych. 2013;4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Genekspressionsmønstre forbundet med posttraumatisk stresslidelse efter eksponering for World Trade Center-angreb. Biol Psykiatri. 2009;66:708-711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, et al. Udvikling af angstlignende adfærd via hippocampal IGF-2-signalering i afkommet af forældremorfineksponering: virkning af beriget miljø. Neuropsykofarmakologi. 2014;39(12):2777-2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et al. beta2 Nicotinic acetylcholin receptor tilgængelighed i posttraumatisk stresslidelse. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419-424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et al. Neurobiologisk grundlag for manglende genkaldelse af ekstinktionshukommelse ved posttraumatisk stresslidelse. Biol Psykiatri. 2009;66(12):1075-1082.