Del Ⅰ: Mulig relevans af opløselig luteiniserende hormonreceptor under udvikling og voksen alder hos drenge og mænd

Enkel oversigt

De reproduktive hormoner luteiniserende hormon (LH) og humant choriongonadotropin (hCG), begge agonister af den luteiniserende hormonreceptor (LHCGR), er afgørende for mandlig reproduktion under udvikling og voksenalder. lHCGR udtrykkes og stimulerer testosteronproduktion af testikel Leydig-celler. I denne undersøgelse demonstrerer vi, at opløselig LHCGR er til stede i blod, urin og sæd hos raske drenge og mænd, såvel som hos patienter med kønskromosomafvigelser. Vi viser, hvordan cirkulerende niveauer af sLHCGR korrelerer med pubertetsudvikling, testikelfunktion og sædkvalitet, og demonstrerer, at LHCGR frigives fra føtalt humant ikke-gonadalvæv. HCG frigives til serum via testiklerne og andre organer, hvilket tyder på en mulig ekstragonadal rolle for LH eller hCG hos drenge og mænd.

Abstrakt

Luteiniserende hormon (LH) og humant choriongonadotropin (hCG) er agonister af den luteiniserende hormonreceptor (LHCGR), som regulerer den mandlige reproduktive funktion. lHCGR kan frigives til kropsvæsker. Vi ønskede at bestemme, om opløselig LHCGR er en markør for gonadal funktion. Tværsnits-, longitudinelle og interventionelle undersøgelser blev udført på 195 raske drenge og mænd og 396 mænd med infertilitet, mangel eller Klinefelters syndrom (KS) for at forbinde LHCGR målt i serum, sæd, urin og lever/nyrearterier til gonadal funktion . lHCGR blev målt in vitro og in vivo-modeller af humant testikelvæv og cellelinjer, xenograft-musemodeller, og humane Western blot-resultater viste, at LHCGR-fragmenter blev påvist i serum- og gonadale væv af lignende størrelse ved hjælp af tre forskellige antistoffer. Selv efter humane xenotransplantater viste LHCGR-ELISA ingen interspecies krydsreaktivitet eller ikke-specifikke reaktioner i museserum. I modsætning hertil blev sLHCGR frigivet til dyrkningsmediet efter human føtal nyre- og binyrekultur. Serum sLHCGR var signifikant lavere hos raske drenge i puberteten (p=0.0001). Hos raske mænd var serum-sLHCGR negativt korreleret med inhibin B/FSH-forholdet (-0.004,p=0.027). Hos infertile mænd var sæd-sLHCGR negativt korreleret med serum-FSH (0,006, p=0.009), sædkoncentration (-3.5, p=0.003) og det samlede sædtal ( -3.2, s.=0.007). Injektion af hCG reducerede sLHCGR i serum og urin hos raske mænd (p <0,01). Som konklusion frigives sLHCGR til kropsvæsker og er forbundet med pubertetsudvikling og gonadal funktion. Den cirkulerende sLHCGR hos orkidéhanner antyder, at sLHCGR i serum kan stamme fra ikke-gonadet væv og kan fungere i ikke-gonadale væv. (Kliniske forsøg: NTC01411527, NCT01304927, NCT03418896).

Nøgleord

LH-receptor; pubertet; udvikling; infertilitet;Cistanche fordele; ekstra-gonadale effekter; gonadotropiner; føtal nyre; føtal binyre; TCAM2; NTera2

Klik her for at købeUrte Cistanche ekstrakt

Introduktion

Luteiniserende hormon (LH) og humant choriongonadotropin (hCG) er begge agonister for den luteiniserende hormonreceptor (LHCGR), som er essentiel for mandlig reproduktion under udvikling og voksenalder [1]. HCG er en G-proteinkoblet receptor kendt for at blive udtrykt i Leydig-, granulære lutein- og membranceller og er en potent regulator af kønssteroidproduktion [1]. hCG er en potent og vedvarende agonist, men er kun fysiologisk vigtig under fosterudviklingen [2]. Bortset fra nogle kimcellekræftformer og kræft i bugspytkirtlen, produceres hCG ikke i voksenalderen, selvom en tidligere undersøgelse fandt lav pulserende sekretion af hypofyse-hCG hos voksne mænd og kvinder. hCG bruges til at behandle kvinder for at inducere ægløsning under fertilitetsbehandling, for mænd for at stimulere testosteronsyntese og potentiel spermatogenese hos hypogonadale mænd eller som en diagnostisk test for endogen testosteronproduktion [4]. Ablation af muse-LH-receptoren (LHCGR) fører til et dramatisk fald i testosteron- og sædkvalitet [5], og adskillige forskningsgrupper har identificeret mutationer og SNP i LHCGR, hvilket viser dens betydning for den menneskelige reproduktive funktion [6-8].

LHCGR-genet er placeret på kromosom 2 og består af 11 exoner, hvoraf exoner 1-10 koder for ekstracellulære strukturelle domæner og exon 11 koder for 7 transmembrane og intracellulære strukturelle domæner [9]. Der er flere isoformer af LHCGR, hvoraf den ene menes at blive udskilt, fordi den mangler et transmembrananker [10]. En anden mulighed er, at frigivelsen af ​​LHCGR til kropsvæsker er afhængig af den enzymatiske spaltning af proteiner på cellemembranen, såsom ADAM'er, MMP'er og andre kendte transmembrane proteiner spaltet. Faktisk har hCG vist sig specifikt at opregulere MMP-2 og MMP-9 [11,12], og adskillige undersøgelser har vist post-transkriptionel regulering af LHCGR [13,14]. Opløselig LHCGR (LHC) er blevet målt i kvindelig serum og follikelvæske af ELISA-platformen [15,16]. Specificiteten af ​​de antistoffer, der blev brugt i ELISA-assayet, blev valideret ved at udtrykke forskellige LHCGR-fragmenter i CHO-celler til epitoplokalisering og påvisning af ekspression i den humane placenta [15-17]. sLHCGR blev påvist i serum ved LC-MS/MS [18]. serumkoncentrationer af sLHCGR hos kvinder var forbundet med fertilitetsbehandling, præeklampsi, for tidlig fødsel og graviditet hos børn med Downs syndrom implantationsrater [15,16], men er ikke blevet valideret af andre forskningsgrupper til dato. Så vidt vi ved, er sLHCGR aldrig blevet beskrevet i kropsvæsker hos raske mænd, unge drenge under udvikling eller mænd med kønskromosomafvigelser. sLHCGR kan fungere i den mandlige cirkulation som en markør for gonadal funktion gennem højaffinitetsbindingstransport eller ændring af LH- eller hCG-aktivitet.

Materialer og metoder

1. Kohorter

Unge Mænd fra den almindelige Befolkning

I Danmark skal alle raske unge mænd over 18 år gennemgå en fysisk undersøgelse for at fastslå deres egnethed til værnepligt. Siden 1996 er omkring 300 værnepligtige, der repræsenterer den almindelige befolkning, hvert år blevet undersøgt for sædkvalitet. De gav alle sædprøver, udfyldte et spørgeskema, fik ultralydsundersøgelser af deres testikler og fik udtaget blodprøver. Serum- og sædprøver fra biobanken samt ultralydsvurderinger og information om BMI og alder fra 148 mænd undersøgt i 2013 og 2014 er inkluderet i den aktuelle undersøgelse (godkendelse af etisk udvalg: H-KF-289428).

Sunde drenge før og efter puberteten

Copenhagen Adolescence Study er en kombineret tværsnits- og longitudinel undersøgelse af raske danske børn [20]. Fra tilfældigt udvalgte folkeskoler blev 6203 børn inviteret til at deltage. Det samlede antal deltagere var 2020 børn. Longitudinel opfølgning af 209 børn (101 drenge) blev udført hver 6. måned og omfattede fysisk undersøgelse, Tanner-vurdering af pubertetsstadier og blod- og urinprøver. Seksogtredive drenge med longitudinel opfølgning blev inkluderet i denne undersøgelse for at vurdere sLHCGR under puberteten (klinisk forsøg: NTC01411527).

Infertile mænd uden alvorlig komorbiditet

Copenhagen-Bone-Gonad Study er et kohortestudie af 307 infertile mænd uden alvorlige følgesygdomme, som besøgte vores mandlige klinik fra 2011 til 2015, herunder i alt 1427 mænd [21,22]. Alle mænd blev henvist til vores klinik på grund af lav sædkvalitet og ønske om forældreskab. Alle gennemgik en fysisk undersøgelse, inklusive testikel-ultralyd, fik udtaget blodprøver og udleverede sædprøver. En specialist fik deres detaljerede sygehistorier. Mændene blev fulgt i 150 dage af forskerne og tog D-vitamin eller placebo som tidligere beskrevet. Alle data, der blev givet i denne undersøgelse, var fra det indledende besøg før intervention, og alle inkluderede variabler var foruddefinerede (klinisk forsøg: NCT01304927).

Standardiseret Cistanche

Mænd og drenge med Klinefelters syndrom og patienter med anorkia

Vi identificerede 64 drenge og mænd med Klinefelters syndrom (KS), 47 post-pubertale og 16 præ-pubertale, defineret i henhold til Tanner-stadie, fra vores mandlige klinik. Vi havde nøjagtige kromosomafvigelser, sygehistorie, pubertetsstartstatus og seruminformation tilgængelig for alle. 7 drenge gennemgik longitudinel opfølgning med regelmæssig klinisk evaluering og blodprøver før og under pubertetens begyndelse.

Vi inkluderede også 8 mænd med normalt kromosomtal, som fik fjernet bilaterale testikler for tidligere tilstande: testikelkimcellecarcinom (n=4), diffus prostatacancer (n=1), bilateral kryptorkisme og pædiatrisk orkiektomi ( n=1), bilateral kimcelle-neoplasi in situ (n=1) og fremskreden testikelkræft efter fjernelse af de resterende testikler på grund af traumer (n=1).

Voksne, der gennemgår Splanchnicus-flowmåling

Vi inkluderede tre mænd og tre postmenopausale kvinder med normal leverfunktion, som blev indlagt for mistanke om mesenterisk iskæmi og henvist til måling af visceral blodgennemstrømning, men som ikke viste mesenterisk iskæmi. Blodprøver blev udtaget samtidigt fra leveren, nyren, lårbensvenen og den tilsvarende arterie (godkendelse af den etiske komité: H.18048245)

Interventionsundersøgelse: Raske mænd udsat for humant choriongonadotropin

Elleve raske mænd blev rekrutteret til at deltage i den kliniske intervention gennem en meddelelse fra Rigshospitalet. Frivillige blev behandlet med 5000 IE humant choriongonadotropin, og deres maksimale produktion af endogent testosteron blev målt ved at sammenligne baseline-blod- og urinprøver med opfølgningsprøver indsamlet 8, 24 og 72 timer efter hCG-injektion (klinisk forsøg: NCT03418896).

2. Mus, humant væv og cellelinjer

To stammer af humane testikelkræftceller NTera-2 og TCam-2, der repræsenterer henholdsvis embryonalt karcinom og seminom, blev brugt og dyrket som tidligere beskrevet [23].

Sera blev indsamlet fra tumorfrie nøgne mus (WT) og TCam-2 xenograft nøgne mus behandlet med henholdsvis vektor, LH eller hCG (Animal Experiment Inspectorate, København, Danmark, licensnummer: 2012-15-2934-00051) .

Humant føtalt væv i første trimester blev indsamlet fra donerede kvinders væv efter planlagte aborter. Fosternyre og føtalt binyrevæv blev dyrket i suspensionsdråbemodeller som beskrevet tidligere, og mediet blev indsamlet til analyse [24,25] (godkendelse af den etiske komité: H-1-2012-007).

Voksne testikelprøver blev indhentet fra æggestoktomerede mænd med testikelkræft (godkendelse af den etiske komité: H{{0}}). Peritumoralt væv indeholdende ikke-maligne områder blev opbevaret ved - 80◦ C eller fikseret natten over ved 4◦ C i formalin eller modificeret Stieve's-fiksativ (200 ml 37 procent formaldehyd, 40 ml eddikesyre i 1 L 0,05 M fosfat buffer, pH 7,4).

3. Biokemiske analyser

Påvisning af total sLHCGR i serum, sæd, urin og forskellige dyrkningsmedier blev udført i en valideringsproces ved hjælp af ELISA-kits fra New Dutch Biomarker Catalyst Laboratory (NBCL) under anvendelse af antistoffet LHR029 mod humant LHCGR og målte alle af disse gentagne gange. ELISA-assayet havde en detektionsgrænse på 0,01 pmol/ml og et maksimalt niveau på 15,55 Seks mænd fra den generelle befolkning med sLHCGR-niveauer over den øvre detektionsgrænse fik deres prøver fortyndet og genmålt, hvilket viste niveauer op til 30 pmol/ml. ydeevnen af ​​ELISA-platformen er blevet beskrevet detaljeret tidligere [15-17].

Cistanche kosttilskud

Vi oprettede også to forskellige in-house ELISA, sat op af vores laboratorieteknikere, og alle yderligere reagenser blev leveret af Origin Biomarkers Ltd, UK, i henhold til deres foreslåede opsætning [26]. For det første blev cirkulerende sLHCGR bundet til hCG påvist ved hjælp af sandwich ELISA-sæt med antistoffer 5A10C9 (ProMab) og am{0{{20}}904pun ( OriGene) rettet mod henholdsvis LHCGR og hCG. For det andet brugte vi på samme måde in-house ELISA til at bestemme samlede arterielle og venøse prøver fra lever, nyrer og underekstremiteter fra seks voksne sLHCGR, hvor vi brugte det samme antistof LHR029 (NBCL Holland) mod sLHCGR. To forskellige protokoller blev testet. Alle sLHCGR-målinger beskrevet i dette papir blev udført ved hjælp af NBCL ELISA, bortset fra hCG-sLHCGR-komplekset og arterielle/venøse prøver fra organerne beskrevet ovenfor. Hos raske drenge blev testosteron analyseret ved hjælp af DPC-coated-a count RIA kit (Diagnostic Products, Los Angeles, CA) med en detektionsgrænse (LOD) på 0,23 nmol/L og en CV på 8,6 procent ved brug af tidsopløst immunfluorescens (Delfia; Wallac, Turku, Finland), var detektionsgrænsen 0,20 nmol/l med en CV på 6,4 procent. Hos voksne blev testosteron og kønshormonbindende globulin (SHBG) analyseret ved kemiluminescensimmunoassay (Access, Beckman Coulter, USA) med LOD'er på henholdsvis 0,35 nmol/L og 0,33 nmol/L. Serum- og urin-FSH- og LH-niveauer blev målt under anvendelse af tidsopløst immunfluorescens (Delfia; Wallac, Turku, Finland) med detektionsgrænser på henholdsvis 0,06 og 0,05 IE/L og CV og lt; begge på 5 pct. Inhibin B-assay blev udført under anvendelse af et specifikt bilateralt enzymimmunoassay (inhibin B genII, Beckman Coulter, USA) CV <11 procent. Til AMH brugte vi Beckman Coulter enzymimmunoassay (Immunotech, Beckman Coulter, Marseille, Frankrig) og en CV <8 procent. Endelig blev IGF1 og IGF-BP3 bestemt ved hjælp af kemiluminescensanalysen af ​​det IDS-iSYS immundiagnostiske system med CV'er på henholdsvis 10 procent og 9 procent. Frit østradiol blev beregnet ved hjælp af Mazers konstant og frit testosteron (FT) blev beregnet ved hjælp af Vermeulens formel [27,28].

Sædanalyse

Raske unge mænd og infertile voksne deltagere gav sædprøver og indhentede selvrapporterede oplysninger om varigheden af ​​ejakulatorisk abstinens. Sædanalyse blev udført af uddannede teknikere som tidligere beskrevet [19]. Sædvolumen blev estimeret ved vejning. Til vurdering af sædlevedygtighed blev 10 μL godt blandede sæd-replikater anbragt på objektglas og undersøgt under et × 400x mikroskop ved en opvarmet sektion på 37◦ C. Sædceller blev klassificeret som enten avanceret levedygtig (WHO klasse a plus B), ikke-progressiv levedygtig (klasse C) eller inaktiv (klasse D). Gennemsnittet af de to levedygtighedsvurderinger blev brugt. For at vurdere sædkoncentrationen blev prøverne fortyndet i en destilleret vandopløsning af 0,6 mL/L NaHCO3 og 0,4% (v/v) formaldehyd og derefter evalueret ved hjælp af et Bürker-Türk hæmocytometer, og gennemsnittet af vurderingerne blev brugt. Kun spermatozoer med haler blev talt. Til sidst blev udstrygninger fremstillet og farvet med Pap-farve, og sædmorfologi blev evalueret strengt i henhold til kriterierne i [29].

Western Blotting

Humant testikelvæv blev homogeniseret i lyseringsbuffer, fortyndet i SDS-belastningsbuffer og derefter opvarmet ved 95◦ C i 5 minutter. Prøver blev sat på 4-20 procent præfabrikerede polyacrylamidgeler (BioRad, kat# 456-8096) og kørt ved 100 V i 1 time for at adskille proteiner. For at detektere sLHCGR i serum blev albumin og IgG fjernet ved brug af Pierce albumin/IgG-fjernelsessættet (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA, kat nr. 89875), før prøverne blev lagt på gelen. efter gelelektroforese blev proteiner overført til polyvinylidendifluoridmembraner ved anvendelse af en våd blotter (BioRad). Membraner blev lukket i tris-bufret saltvand og 5 procent skummet tørmælk i 1 time, derefter inkuberet natten over ved 4◦ C med primære antistoffer og i 1 time ved stuetemperatur med sekundære antistoffer. Membraner blev vasket med forbedret kemiluminescens (Thermo Scientific Super Signal West Femto Maximum Sensitive Substrate, Cat # 34095) og fotodetektor med et chemiDoc MP billeddannelsessystem (BioRad, Cat # 17001402). Tre forskellige antistoffer blev brugt til at påvise LHCGR i væv og serum: Aviva System Biology (OASG04237); NBCL Holland, det samme antistof som i serum-ELISA-kittet (LHR029) og Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA, SC- 26341). -2 mikroglobulin blev brugt som en ladningskontrol.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført som tidligere beskrevet [25]. Kort fortalt blev sektioner fikseret med modificeret stift fikseringsmiddel, afvokset og rehydreret. Antigenekstraktion blev udført i en autoklav indeholdende citratekstraktionsbuffer (10 mM, pH 6.0). Endogen peroxidase blev blokeret med 3 procent (v/v) H2O2 i methanol i 30 min. Mellem hvert trin blev sektioner vasket i TBS. Sektioner blev inkuberet med 0,5 procent BSA hesteserum i 30 minutter, efterfulgt af inkubation natten over med to forskellige primære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur (LHR029 for WB/ELISA, Santa Cruz Biotechnology SC- 25828). Sektioner blev inkuberet med sekundære antistoffer i 30 minutter. Billeder blev visualiseret med aminoethylcarbazol (AEC, Invitrogen, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Negative kontroller var uden primære antistoffer. Ingen af ​​de negative kontroller var farvet. Modfarvning blev udført med Mayers hæmatoxylin og montering blev udført med Aquatex. Sektioner blev evalueret på et Nikon Microphot-FXA mikroskop (Nikon Corporation, Melville, NY, USA). Den endelige analyse blev udført ved hjælp af softwaren NDPview version 1.2.36 (Hamamatsu Photonics, Iwata City, Japan.

Cistanche ekstrakt fordele for nyrer

REFERENCER

1. Dufau, ML Den luteiniserende hormonreceptor. Annu. Rev. Physiol. 1998, 60, 461-496.

2. Rao, CV Differentielle egenskaber af humant choriongonadotropin og humant luteiniserende hormon, der binder til plasmamembraner af bovin corpora lutea. Acta Endocrinol. 1979, 90, 696-710.

3. Odell, WD; Griffin, J. Pulserende sekretion af humant choriongonadotropin hos normale voksne. N. Engl. J. Med. 1987, 317, 1688-1691.

4. Bang, AK; Nordkap, L.; Almstrup, K.; Priskorn, L.; Petersen, JH; Rajpert-De Meyts, E.; Andersson, A.-M.; Juul, A.; Jørgensen, N. Dynamisk GnRH og hCG-testning: Etablering af nye diagnostiske referenceniveauer. Eur. J. Endocrinol. 2017, 176, 379-391.

5. Zhang, FP; Poutanen, M.; Wilbertz, J.; Huhtaniemi, I. Normal prænatal, men standset postnatal seksuel udvikling af luteiniserende hormonreceptor knockout (LuRKO) mus. Mol. Endokrinol. 2001, 15, 172-183.

6. Bruysters, M.; Christin-Maitre, S.; Verhoef-Post, M.; Sultan, C.; Auger, J.; Faugeron, I.; Larue, L.; Lumbroso, S.; Themmen, APN; Bouchard, P. En ny LH-receptorsplejsningsmutation er ansvarlig for mandlig hypogonadisme med subnormal sædproduktion i propositus og infertilitet med regelmæssige cyklusser hos en berørt søster. Hum. Reprod. 2008, 23, 1917-1923.

7. Latronico, AC; Arnhold, IJP Inaktiverende mutationer af den humane luteiniserende hormonreceptor hos begge køn. Semin. Reprod. Med. 2012, 30, 382-386.

8. Simoni, M.; Tüttelmann, F.; Michel, C.; Böckenfeld, Y.; Nieschlag, E.; Gromoll, J. Polymorfismer af det luteiniserende hormon/choriongonadotropinreceptorgen: Association med mal-descended testikler og mandlig infertilitet. Pharmacogenet. Genom. 2008, 18, 193-200.

9. Ascoli, M.; Fanelli, F.; Segaloff, DL Lutropin/choriogonadotropin-receptoren, et 2002-perspektiv. Endocr. Rev. 2002, 23, 141-174.

10. Tena-Sempere, M.; Zhang, FP; Huhtaniemi, I. Vedvarende ekspression af en trunkeret form af den luteiniserende hormonreceptor-budbringer-ribonukleinsyre i rottetestis efter selektiv Leydig-celledestruktion med ethylenmethansulfonat. Endokrinologi 1994, 135, 1018-1024.

11. Fluhr, H.; Bischof-Islami, D.; Krenzer, S.; Licht, P.; Bischof, P.; Zygmunt, M. Humant choriongonadotropin stimulerer matrixmetalloproteinaser-2 og -9 i cytotrofoblastiske celler og reducerer vævsinhibitor af metalloproteinaser-1, -2 og -3 i decidualiserede endometriale stromaceller. Fertil. Steril. 2008, 90, 1390-1395.

12. Licht, P.; Fluhr, H.; Neuwinger, J.; Wallwiener, D.; Wildt, L. Er humant choriongonadotropin direkte involveret i reguleringen af ​​human implantation? Mol. Celle. Endokrinol. 2007, 269, 85-92.

13. Li, Y.-X.; Guo, X.; Gulappa, T.; Menon, B.; Menon, KMJ SREBP spiller en regulerende rolle i LH/hCG-receptor-mRNA-ekspression i humane granulosa-luteinceller. J. Clin. Endokrinol. Metab. 2019.

14. Menon, KMJ; Menon, B.; Wang, L.; Gulappa, T.; Harada, M. Molekylær regulering af gonadotropinreceptorekspression: forhold til sterolmetabolisme. Mol. Celle. Endokrinol. 2010, 329, 26-32.

15. Chambers, AE; Griffin, C.; Naif, SA; Mills, I.; Mills, WE; Syngelaki, A.; Nicolaides, KH; Banerjee, S. Kvantitative ELISA'er for serumopløseligt LHCGR- og hCG-LHCGR-kompleks: Potentiel diagnostik i graviditetsscreening i første trimester for dødfødsel, Downs syndrom, præmatur fødsel og præeklampsi. Reprod. Biol. Endokrinol. 2012, 10, 113.

16. Chambers, AE; Nayini, KP; Mills, WE; Lockwood, GM; Banerjee, S. Cirkulerende LH/hCG-receptor (LHCGR) kan identificere IVF-patienter før behandling med risiko for OHSS og dårlig implantation. Reprod. Biol. Endokrinol. 2011, 9, 161.

17. Chambers, AE; Stanley, PF; Randeva, H.; Banerjee, S. Mikrovesikel-medieret frigivelse af opløselig LH/hCG-receptor (LHCGR) fra transficerede celler og placenta-eksplantater. Reprod. Biol. Endokrinol. 2011, 9, 64.

18. Gao, HJ; Chen, YJ; Zuo, D.; Xiao, MM; Li, Y.; Guo, H.; Zhang, N.; Chen, RB Kvantitativ proteomisk analyse for høj gennemløbsscreening af differentielle glycoproteiner i hepatocellulært karcinomserum. Cancer Biol. Med. 2015, 12, 246-254.

19. Priskorn, L.; Nordkap, L.; Bang, AK; Krause, M.; Holmboe, SA; Egeberg Palme, DL; Winge, SB; Mørup, N.; Carlsen, E.; Joensen, FN; et al. Det gennemsnitlige sædtal forbliver uændret på trods af reduktionen i mødres rygning: Resultater fra et stort tværsnitsstudie med årlige undersøgelser over 21 år. Hum. Reprod. 2018, 33, 998-1008.

20. Sørensen, K.; Aksglaede, L.; Petersen, JH; Juul, A. Nylige ændringer i pubertetstiming hos raske danske drenge: Sammenslutninger med kropsmasseindeks. J. Clin. Endokrinol. Metab. 2010, 95, 263-270.

21. Blomberg Jensen, M.; Lawaetz, JG; Petersen, JH; Juul, A.; Jørgensen, N. Effekter af vitamin D-tilskud på sædkvalitet, reproduktive hormoner og levende fødselsrate: et randomiseret klinisk forsøg. J. Clin. Endokrinol. Metab. 2018, 103, 870-881.

22. Blomberg Jensen, M.; Gerner Lawaetz, J.; Andersson, A.-M.; Petersen, JH; Nordkap, L.; Bang, AK; Ekbom, P.; Joensen, FN; Prætorius, L.; Lundstrøm, P.; et al. D-vitaminmangel og lavt ioniseret calcium er forbundet med sædkvalitet og kønssteroidniveauer hos infertile mænd. Hum. Reprod. 2016, 31, 1875-1885.

23. Lorenzen, M.; Nielsen, JE; Andreassen, CH; Juul, A.; Toft, BG; Rajpert-De Meyts, E.; Daugaard, G.; Blomberg Jensen, M. Luteiniserende hormonreceptor udtrykkes i testikelkimcelletumorer: mulige implikationer for tumorvækst og -prognose. Kræft 2020, 12, 1358.

24. Eldrup, E.; Theilade, S.; Lorenzen, M.; Andreassen, CH; Poulsen, KH; Nielsen, JE; Hansen, D.; El Fassi, D.; Berg, JO; Bagi, P.; et al. Hypercalcæmi efter kosmetiske olieinjektioner: Opklaring af ætiologi, patogenese og sværhedsgrad. J. Bone Miner. Res. 2020, 36, 322-333.

25. Jørgensen, A.; Macdonald, J.; Nielsen, JE; Kilcoyne, KR; Perlman, S.; Lundvall, L.; Langhoff Thuesen, L.; Juul Hare, K.; Frederiksen, H.; Andersson, A.-M.; et al. Nodalsignalering regulerer kimcelleudvikling og etablering af seminiferøse snore i den menneskelige føtale testis. Cell Rep. 2018, 25, 1924–1937.e4.

26. Chambers, AE; Fairbairn, C.; Gaudoin, M.; Mills, W.; Woo, I.; Pandian, R.; Stanczyk, FZ; Chung, K.; Banerjee, S. Opløselig LH-HCG-receptor og østradiol som prædiktorer for graviditet og levende fødsel i IVF. Reprod. Biomed. Online 2019, 38, 159-168.

27. Vermeulen, A.; Verdonck, L.; Kaufman, JM En kritisk evaluering af simple metoder til estimering af frit testosteron i serum. J. Clin. Endokrinol. Metab. 1999, 84, 3666-3672.

28. Mazer, NA En ny regnearksmetode til beregning af de frie serumkoncentrationer af testosteron, dihydrotestosteron, østradiol, østron og cortisol: Med illustrative eksempler fra mandlige og kvindelige populationer. Steroider 2009, 74, 512-519.

29. Menkveld, R.; Stander, FS; Kotze, TJ; Kruger, TF; van Zyl, JA Evalueringen af ​​morfologiske karakteristika af menneskelige spermatozoer i henhold til strengere kriterier. Hum. Reprod. 1990, 5, 586-592.

Li Juel Mortensen¹, Mette Lorenzen¹, Anne Jørgensen², Jakob Albrethsen², Niels Jørgensen²,Søren Møller^3,4, Anna-Maria Andersson², Anders Juul^2,4og Martin Blomberg Jensen^1,5

1. Gruppen af ​​skelet-, mineral- og gonadalendokrinologi, Universitetsafdelingen for Vækst og Reproduktion, Rigshospitalet, 2100 København, Danmark; li.juel.mortensen@regionh.dk (LJM); mette.lorenzen.01@regionh.dk (ML)

2. Institut for Vækst og Reproduktion og Internationalt Center for Forskning og Forskeruddannelse i Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), Rigshospitalet, Københavns Universitet, Blegdamsvej 9, 2100 København, Danmark; Anne.Joergensen.02@regionh.dk (AJ); Jakob.Christian.Albrethsen@regionh.dk (JA); Niels.Joergensen@regionh.dk (NJ); Anna-Maria.Andersson@regionh.dk (A.-MA); Anders.Juul@regionh.dk (AJ)

3. Center for Funktionel og Diagnostisk Billeddiagnostik og Forskning, Afdeling for Klinisk Fysiologi og Nuklearmedicin 260, Hvidovre Hospital, 2650 København, Danmark; Soeren.Moeller@regionh.dk

4. Institut for Klinisk Medicin, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet, 2200 København, Danmark

5. Afdeling for knogle- og mineralforskning, Harvard School of Dental Medicine/Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA