DelⅠ: Tubulær mitokondriel AKT1 aktiveres under iskæmisk reperfusionsskade og har en kritisk rolle i prædisposition for kronisk nyresygdom.

Abstrakt

Renal tubulær dysfunktion kan føre til akut nyreskade og transformation til kronisk nyresygdom. Selvom tubulære mitokondrier er forbundet med patofysiologien af ​​nyresvigt, er mekanismen uklar. Her viser vi, at iskæmi-reperfusionsskade inducerer akut translokation og aktivering af mitokondriel proteinkinase B (også kendt som AKT1) i nyretubuli. Vi antog, at mitokondriel AKT1-signalering kunne forhindre udviklingen af ​​akut nyreskade og efterfølgende kronisk nyresygdom. For at teste denne forudsigelse brugte vi Cre-Lox-strategien til at generere to nye nyretubuli-specifikke transgene musestammer, der inducerede ekspression af enten mitokondrier-målrettet dominant-negativ AKT1 eller konstitutivt aktiv AKT1. i mitokondrie-målrettede dominante AKT1-negative mus forværrede hæmning af mitokondriel AKT1 azotæmi, tubulær skade, nyrefibrose, glomerulosklerose og overlevelse efter iskæmi-reperfusionsskade negativt. I modsætning hertil, i mitokondrier-målrettede konstitutivt aktive AKT1-mus, forstærket tubulær mitokondriel AKT1-signalering svækket nyreskade, beskyttet nyrefunktion og signifikant forbedret overlevelse efter iskæmi-reperfusionsskade (henholdsvis 76,9 procent vs. 20,8 procent). Når mitokondriel AKT1 blev hæmmet, blev der fundet en stigning i ukoblet mitokondriel respiration og oxidativt stress i renale tubuli, hvilket understøtter rollen som mitokondriel dysfunktion i patofysiologien af ​​nyresvigt. Vores undersøgelse tyder således på, at den rørformede mitokondrielle AKT1-signalvej kan være et nyt mål for udviklingen af ​​nye strategier til bedre at forebygge og behandle nyreskade.

Oversættelseserklæring

Akut nyreskade (AKI) og den efterfølgende udvikling af kronisk nyresygdom (CKD) er store sundhedsproblemer. Vi udviklede en transgen musemodel og bestemte rollen for AKT-aktivering af proksimale renale tubulære mitokondrier i AKI og CKD. Denne redningsmekanisme til nyrebeskyttelse kan være et nyt mål for udvikling af nye strategier til bedre at forebygge og behandle AKI og CKD. Fremtidige undersøgelser bør bekræfte involveringen af ​​den mitokondrielle AKT-signalvej i human nyreskade og udforske lægemiddelmål for den mitokondrielle AKT1-vej.

Nøgleord

Mitokondriel Akt1; Iskæmi-refusionsskade; Akut nyreskade; Kronisk nyresygdom;Cistanche ekstrakt.

Klik her for at fåCistanche fordele for nyrerne

Introduktion

Akut nyreskade (AKI) og den efterfølgende udvikling af kronisk nyresygdom (CKD) er store sundhedsproblemer. I øjeblikket er specifikke medicinske behandlinger for disse sygdomstilstande begrænset, delvist på grund af manglende forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for nyreskade. Nyren er et af de mest energikrævende organer i kroppen, og mitokondrier, som er nødvendige for at lette aktiv transport, opretholde korrekte elektrokemiske gradienter og regulere væskehomeostase, er den primære kilde til cellulær ATP-produktion gennem oxidativ phosphorylering. forstyrrelser i ATP-produktion og mitokondriel dysfunktion kan føre til øget produktion af reaktive oxygenarter (ROS), som igen forringer nyrecellefunktionen og inducerer celledød. Selvom mitokondriel skade og dysfunktion er blevet rapporteret hos patienter med nyresygdom og dyremodeller for akut og kronisk nyreskade, er viden om mitokondriers patofysiologiske rolle ved nyreskade fortsat ufuldstændig.

Den forbedrede mitokondriefunktion kan forhindre iskæmi-reperfusionsskade (IRI). Under den iskæmiske fase af IRI hæmmer iltsvind elektronoverførsel i den mitokondrielle respiratoriske kæde og reducerer ATP-produktion. Den efterfølgende tilstrømning af natriumioner og efflux af protoner hjælper med at genoprette normal pH og kan fremme celleoverlevelse ved at genoprette intracellulært volumen Under reperfusion er genoprettelse af blodgennemstrømning forbundet med øget reaktive oxygenarter (ROS), Ca2 plus indadtilstrømning til mitokondrier, tab af mitokondrielle transmembrane elektrokemiske gradienter og aktivering af apoptotiske veje Disse intracellulære ændringer kan være skadelige for celler, der overlever efter indledende iskæmisk skade.

AKI er mere almindelig hos indlagte patienter og kan fremskynde indtræden af ​​ny CKD, forværre eksisterende CKD og føre til nyredød Mekanismerne bag overgangen fra AKI til CKD er uklare. Nylige dyreforsøg tyder på, at renal tubulær dysfunktion spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​AKI til CKD, hvilket afspejler overgangen fra AKI til CKD hos mennesker. Forståelse af signalvejene, der regulerer nyreskade, vil give os mulighed for at identificere nye terapeutiske mål for at afbøde nyreskade og forhindre progression af AKI til CKD.

Forbindelsen mellem cytoplasmatiske signalveje og mitokondriefunktion under nyreskade er stort set ukendt. Mitokondriel funktion er tæt forbundet med cytoplasmatisk signalering, andre organeller og nukleare veje Vores laboratorium har identificeret aktivering og translokation af AKT1 til mitokondrier som et nøgletrin i at beskytte kardiomyocytter mod IRI-skader ved at regulere oxidative fosforyleringskomplekser, hvilket øger effektiviteten af ​​oxidativ fosforylering. reducere ROS. Hvorvidt IRI kan udløse translokation af aktiveret AKT1 fra cytoplasmaet til mitokondrierne i nyretubuli er uvist. Hvis mitokondriel AKT1 kan aktiveres i nyretubuli som reaktion på nyreskade, ville det være vigtigt at vurdere den patofysiologiske rolle af mitokondriel AKT1 i udviklingen af ​​akut nyreskade (AKI) og kronisk nyresygdom (CKD). Her brugte vi to inducerbare renal tubuli-specifikke transgene musemodeller, der modulerer mitokondriel AKT1-signalering in vivo og demonstrerede den beskyttende rolle af renal tubulær mitokondriel AKT1-aktivering under IRI mod AKI og efterfølgende CKD-udvikling.

Cistanche kosttilskud

Resultater

Aktivering af mitochondrial AKT1 i nyretubuli efter IRI

Vi undersøgte først, om IRI aktiverer AKT1 i renale mitokondrier. Til dette formål etablerede vi en renal IRI-model ved at ligere den venstre nyrearterie i 30 minutter efterfulgt af kontralateral nefrektomi (Nx). Ligeringen af ​​den venstre nyrearterie blev vendt for at afslutte den iskæmiske fase, reperfusion blev udført, og den venstre nyre blev høstet med det angivne tidsinterval.

Den renale cortex beriget i nyretubuli blev isoleret, og mitokondrier blev fremstillet ved subfraktionering. Ved reperfusion blev overfloden af ​​mitokondriel pAKT1 og AKT1 øget, hvilket tyder på translokationen af ​​aktiveret AKT1 ind i mitokondrierne (figur 1A). Dette svarer til, hvad vi observerede i myokardiet sammenlignet med sham-opererede kontroller eller resekerede nyrekontroller, hvor mitokondriel AKT1 var signifikant forhøjet 30-60 minutter efter reperfusion (figur 1A og B) (n= 11-15). Mitokondriel pAKT1 blev også øget. Disse resultater tyder på, at IRI-induceret aktivering og translokation af AKT1 til renale mitokondrier. iHC-farvning bekræftede phosphorylering af AKT1 i nyretubuli efter IRI (figur 1C). Baggrundsfarvning for pAKT1 var minimal i nyretubuli af sham-opererede kontroller, hvorimod pAKT1 var dramatisk forhøjet i nyretubuli efter IRI (figur 1C og 1D). Ingen pAKT1 blev set i nogen nyreregion undtagen tubuli. for at bekræfte den subcellulære lokalisering af pAKT1 i tubuli, blev pAKT1 farvet i kombination med mitokondrielle markører. signifikant co-lokalisering af pAKT1 og mitokondrier blev observeret i renale tubulære celler ved IRI (figur 1E). Sammen antyder disse resultater IRI-translokation og aktivering af AKT1 til mitokondrier.

Figur 1. Iskæmi-reperfusion-induceret akut translokation og aktivering af AKT1 i renale mitokondrier.

Generering af transgene mus med inducerbar renal tubuli-specifik ekspression af en dominerende negativ AKT i mitokondrier

For at teste hypotesen om, at aktivering af renal tubulær mitokondriel AKT1 under IRI beskytter nyren mod AKI og efterfølgende CKD-udvikling, genererede vi en transgen musemodel, der muliggør tamoxifen (TAM)-induceret ekspression af tubulær-specifik mitokondriel målretning af dominant-negativ AKT1. Dominant negative AKT1 (mdnAKT) og mitokondrielle målretningssekvenser blev tilføjet til N-terminalen. Betinget ekspression af tamoxifen af ​​AKT1-transgener blev medieret under anvendelse af pCALNL (se materialer og metoder). For at udelukke forvirrende effekter forbundet med den tilfældige integration af transgenarrays i genomet, blev en enkelt kopi af transgenet introduceret ved homolog rekombination i ES-celler med målrettede transgener ved Gt(ROSA) 26 eller locus på et kromosom. To-gen mus (KMDAKT) blev opnået ved at krydse tam-inducerede af mdnAKT-musene med hemizygote KSP-CreERT2-mus, hvor tam-induceret Cre-aktivitet blev drevet af de renale tubulære celle-specifikke calmodulin 16-promotorer. tam-injektion inducerede Cre-aktivitet, isolerede mitokondrier og SDS-PAGE-separerede mitokondrielle proteiner til immunblotting. Resultaterne viste, at TAM med succes inducerede ekspressionen af ​​mutant AKT1. Mutantproteinet var ikke-detekterbart i KMDAKT-mus, KSPCreERT2-mus og vildtype-mus (majsolie-injektion).

For at verificere nyrespecifik ekspression blev mitokondrielle proteiner ekstraheret fra forskellige væv efter TAM-injektion. his-mærket mutant AKT1 blev kun udtrykt i nyren. Nyresektioner blev farvet med anti-his-tag-antistoffer og mitokondriel Mitotracker til immunfluorescensbilleddannelse. Resultaterne viste, at alle mutanter AKT1 var farvet med His-tag-antistof og lokaliseret til mitokondrier. Ingen AKT1-mutationer blev påvist i glomeruli. Den enzymatiske aktivitet af mitokondriel AKT1 blev analyseret ved hjælp af rekombinant GSK3 for at bekræfte en væsentlig negativ rolle i mitokondrierne af tam-behandlede KMDAKT tubuli. Da renal tubuli mitokondriel AKT1 aktiveres af IRI, sammenlignede vi den enzymatiske aktivitet af AKT1 i mitokondrier isoleret fra tam-behandlede mus og majsolie-behandlede mus efter IRI. Resultaterne viste, at den renale mitokondrielle AKT1-aktivitet var signifikant hæmmet i de TAM-behandlede KMDAKT-mus. Derfor er denne transgene muselinje en god model til at studere AKT1's rolle i rørformede mitokondrier.

Cistanche fordele

Hæmning af renal tubuli mitokondriel AKT forværrede IRI in vivo

IRI blev induceret ved unilateral nyreiskæmi. I den sidste række af eksperimenter var phosphoryleret AKT1 knap påviselig i mitokondrierne i de proksimale nyretubuli. Ingen signifikante forskelle i nyrehistologi, blodurinstofnitrogen (BUN) og serumkreatinin (Cr) blev observeret i majsolie-injicerede og tam-injicerede KMDAKT-mus, hvilket tyder på, at mitokondriel AKT1-signalering ikke har nogen signifikant rolle i nyrestruktur og funktion ved baseline før induktion af IRI. For at undersøge, om mitokondriel AKT1 spiller en beskyttende rolle under IRI, blev unilateral IRI brugt til at inducere AKI i majsoliemus eller TAM-KMDAKT-mus. der var ingen forskelle i BUN- eller Cr-niveauer opnået umiddelbart efter IRI-induktion, men i TAM-KMDAKT-mus var både BUN- og Cr-niveauer signifikant forhøjet efter 45 dage. Disse resultater tyder på, at blokeret aktivering af mitokondriel AKT1 i nyretubuli under IRI forværrede den sene udvikling af nyredysfunktion. histologisk analyse af H&E-farvede nyresektioner viste, at nyreskade blev forværret i TAM-KMDAKT-mus. Jablonskis score for renal tubulær skade var højere med tab af tubulær børstekant, tubulær lysis og mere affald i det tubulære lumen (p=0.018). For at udelukke effekten af ​​TAM- eller Cre-rekombinase analyserede vi også TAM-injicerede KSP/CreERT2-mus, og Jablonski-score var ens i majsolie KMdakt- og TAM-KSP/CreERT2-mus på dag 7 efter IRI (figur 3D) (p{{ 19}}.7613). Disse data tyder på, at vores resultater ikke blev forvirret af virkningerne af TAM eller Cre rekombinase. Hos TAM-KMDAKT-mus efter IRI viste Masson-trikromfarvning højere fibrotisk areal (procent) (p<0,001), ledsaget af uordnede rørformede strukturer med intra-luminale afstøbninger og affald. col1a-ekspression blev øget, i overensstemmelse med Masson-trikromfarvning. tGF-ekspression blev ikke øget, hvilket tyder på, at mitokondriel AKT1 ikke regulerede det inflammatoriske respons. Efter IRI blev ekspressionen af ​​tubulær skadesmarkør-KIM -1 øget i TAM-KMDAKT-gruppen, hvilket bekræfter den øgede nyreskade i TAM-KMDAKT-gruppen (p=0.002).

TUNEL-farvning blev brugt til at evaluere nyrecelleapoptose. Antallet af apoptotiske celler var signifikant øget i tubuli (p{{0}}.0054) og glomeruli (p<0,001) hos TAM-KMDAKT-mus sammenlignet med kontrolgruppen. Det foreslås, at inhibering af tubulær mitokondriel AKT1 under IRI forværrer tubulær celledød og glomerulær skade. I overensstemmelse med dette var aktivering af både caspase 9 (promotor) og caspase 3 (executor) signifikant øget i TAM-KMDAKT renale tubulære epitelceller. For yderligere at udforske kroniske glomerulære ændringer blev periodisk syre-Schiff (PAS)-farvningsanalyse udført på nyresektioner for at kvantificere glomerulosklerose. Selvom der ikke blev set nogen forskel i glomerulosklerose 7 dage efter IRI (p=0.2634), blev der fundet mere glomerulosklerose i TAM-KMDAKT-mus 45 dage efter IRI (p<0,001). Dette fund tyder på, at den renale tubulære mitokondrielle AKT-signalvej kan regulere glomerulær ardannelse under udvikling af CKD. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste effekten af ​​inhibering af tubulær mitokondriel AKT på IRI-resultatet. Overlevelse blev reduceret efter IRI i TAM-KMDAKT-mus sammenlignet med kontroller (p=0.0013).

Overlevelsesraten for TAM-KMDAKT-mus var signifikant lavere end for kontroller inden for 7 dage efter IRI, men BUN/Cr-niveauerne for TAM- og majsolie-KMDAKT-mus var ens i denne periode. De rapporterede BUN/Cr-ændringer i TAM-behandlede mus kan være blevet undervurderet på grund af manglende tilgængelighed af BUN/Cr-data fra døde mus. Derudover kan den højere dødelighed i TAM-KMDAKT-mus være forårsaget af distale organdysfunktion (lunge, hjerte, hjerne) snarere end blot BUN/Cr-ændringer.

Rollen af ​​rørformet mitokondriel AKT1 blev også vurderet i hun KMDAKT mus. serum BUN/Cr og renal histologi var relativt højere i TAM-KMDAKT hunmus 45 dage efter IRI. Der blev ikke observeret nogen signifikant kønseffekt.

Urte Cistanche

REFERENCER

1. Yang JY, Deng W, Chen Y, et al. Forringet translokation og aktivering af mitokondriel Akt1 mildnet mitokondriel oxidativ phosphorylering Kompleks V-aktivitet i diabetisk myokardium. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:167-175.

2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A, et al. Specifikke metaboliske hastigheder af større organer og væv på tværs af voksenalderen: evaluering ved den mekanistiske model for hvileenergiforbrug. Am J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.

3. Li SY, Susztak K. Rollen af ​​peroxisomproliferator-aktiveret receptor gamma-coactivator 1alpha (PGC-1alpha) i nyresygdom. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.

4. Portilla D, Dai G, McClure T, et al. Ændringer af PPARalpha og dets coaktivator PGC-1 i cisplatin-induceret akut nyresvigt. Nyre Int. 2002;62(4):1208-18.

5. Forbes JM. Mitokondrier-Power Players i nyrefunktion? Trends Endocrinol Metab. 2016;27(7):441-4425.

6. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. Forbedring af mitokondriel bioenergetik under iskæmiske forhold øger varm iskæmi-tolerance i nyrerne. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308(1):F11– F21.6.

7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, et al. Cellebiologi af iskæmi/reperfusionsskade. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229-317.

8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Molekulære veje til at beskytte leveren mod iskæmi/reperfusionsskade: en opdatering fra 2015. Clin Sci (Lond). 2015;129(4):345–62.

9. Se EJ, Jayasinghe K, Glassford N, et al. Langsigtet risiko for uønskede resultater efter akut nyreskade: en systematisk gennemgang og meta-analyse af kohortestudier ved hjælp af konsensusdefinitioner af eksponering. Nyre Int. 2019;95(1):160–72.

10. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. Mitokondrierbeskyttelse efter akut iskæmi forhindrer langvarig opregulering af IL-1beta og IL-18 og standser CKD. J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1437–49.

11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH, et al. PGC1alpha driver NAD-biosyntese, der forbinder oxidativ metabolisme med nyrebeskyttelse. Natur. 2016;531(7595):528–32.

12. Tait SW, Grøn DR. Mitokondrier og cellesignalering. J Cell Sci. 2012;125(Pt 4):807-815.

13. Deng W, Leu HB, Chen Y, et al. Proteinkinase B (PKB/AKT1) dannede signalkomplekser med mitokondrielle proteiner og forhindrede glykolytisk energidysfunktion i dyrkede kardiomyocytter under iskæmi-reperfusionsskade. Endokrinologi. 2014;155(5):1618–28.

14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y, et al. Effektiv genaktivering i pattedyrsceller ved at bruge rekombinant adenovirus, der udtrykker stedspecifik Cre-rekombinase. Nucleic Acids Res. 1995;23(19):3816-21.

15. Matsuda T, Cepko CL. Kontrolleret ekspression af transgener introduceret ved in vivo elektroporation. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.

16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL, et al. Fjern organdysfunktion ved akut nyreskade: en gennemgang. Am J Nyre Dis. 2018;72(6):846–856.

Hugo YH Lin^1,2,3,4, lækker Chen¹, Yu-Han Chen¹, Albert P. Ta^1,2, Hsiao-Chen Lee^1,5, Grant R. MacGregor⁶, Nosratola D. Vaziri^1,2, Ping H. Wang^1,2,7

1. UC Irvine Diabetes Center og Department of Medicine, University of California, Irvine, Californien

2. Institut for Fysiologi og Biofysik, University of California, Irvine, Californien

3. Institut for Medicin, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan

4. Institut for Intern Medicin, Kaohsiung Municipal Ta-Tung Hospital, Taiwan

5. Afdeling for plastikkirurgi, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan

6. Institut for udviklings- og cellebiologi, University of California, Irvine, Californien

7. Institut for Diabetes, Endokrinologi og Metabolisme, City of Hope National Medical Center, Duarte, Californien