DEL Ⅱ: Metformin-prækonditionering og postkonditionering for at reducere Lskemi-reperfusionsskade i en Lisoleret Ex Vivo-rotte og Normotermisk maskinperfusionsmodel af svinenyre
Mar 26, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Tobias M.Huink, Leonie H.Venemal, Rene A.Posma, Nyke J.de Vries, Andrie C.Westerkampl, & et al.
INTRODUKTION
Nyretransplantation er den foretrukne behandling for patienter med nyresygdom i slutstadiet. Desværre er efterspørgslen højere end tilgængeligheden af organer.2 Denne mangel har resulteret i øget brug af organer af suboptimal kvalitet fra donorer efter cirkulationsdød (DCD).5 Nyrer fra DCD-donorer er mere modtagelige for iskæmi-reperfusionsskade (IRl), som er forbundet med signifikant højere forekomster af forsinket graftfunktion, hvilket påvirker både kortsigtede og langsigtede resultater.45 IRI er forårsaget af svækkelse af blodgennemstrømningen og efterfølgende reoxygenering, hvilket resulterer i dannelsen af reaktive oxygenarter (ROS), initiering af en kaskade af skadelige cellulære responser.67 Sværhedsgraden af iskæmi korrelerer stærkt med tidlig nyretransplantationssvigt efter nyretransplantation og bidrager til øget morbiditet. Derfor bør varm iskæmi (W) under organudtagning og implantation, og kold iskæmisk tid under konservering, holdes på et minimum. Maskinperfusionsstrategier kan spille en central rolle i at reducere IRI ved at tilføre ilt under iskæmiske faser i organdonation. Desuden giver det en platform til at tilføje mulige beskyttelsesmidler før reperfusion (prækonditionering) eller under reperfusion (postkonditionering) og er en egnet metode til at vurdere kortsigtet nyrefunktion og skade.9-11
Biguanidenmetforminer det mest anvendte orale antihyperglykæmiske lægemiddel til behandling af patienter med type 2-diabetes. Virkningsmekanismen og de pleiotrope virkninger afmetforminprimært skyldes inhiberingen af kompleks 1 i den mitokondrielle respirationskæde.12-14 Derfor,metforminkan svække IRI ud over dets glukosesænkende virkning og er blevet foreslået som et organbeskyttende middel under omstændigheder, hvor IRI forekommer, såsom transplantation.15,16
Formålet med denne undersøgelse var at evaluere de potentielle gavnlige effekter af prækonditionering og postkonditionering medmetforminpå IRI i to forskellige isolerede ex vivo normothermic machine perfusion (NMP) modeller ved hjælp af rotte- og svinenyrer.
NÆR NYRE:DRAGEURT CISTANCHE
METODER
Rottestudie
Dyr.Lewis-hanrotter, der vejede 270-300 g, blev anvendt (Harlan Laboratories, Boxmeer, Holland). Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Groningen godkendte undersøgelsesprotokollen (DEC6708C). Dyrene modtog pleje i henhold til den hollandske lov om dyreforsøg i overensstemmelse med National Institute of Health's principper for laboratoriedyrspleje.
Eksperimentelt design, organhentning og konservering.I alt 31 rotter blev opdelt i 6 grupper (n=5-6 pr. gruppe; figur 1). I alle grupper blev 15 minutter W og 24 timers koldkonservering brugt til at inducere iskæmisk skade. Forkonditionering blev udført ved at administrere 300 mg/kgmetformin(1,1-dimethylbiguanidhydrochlorid; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) opløst i saltvand (0,9 procent NaCl) eller saltvand alene gennem oral sondeernæring 12 og 2 timer før nefrektomi. Saltvand, 30 mg/Lmetformineller 300 mg/Lmetforminblev tilsat til perfusatet som efterkonditioneringsmiddel. Koncentrationen på 300 mg/kg legemsvægt blev valgt, da denne dosis resulterede i serummetforminkoncentrationer, der svarer til dem, der findes hos mennesker under vedligeholdelsemetforminterapi.17
Anskaffelsen af nyrer blev udført med mindre ændringer i DCD-proceduren, som beskrevet tidligere.18 Kort sagt blev rotter bedøvet med 2-5 procent isofluran, og laparotomi blev udført via et midtlinjesnit. Antikoagulation under anvendelse af 500 IE heparin (Leo Pharma, Ballerup, Danmark), blev administreret via den dorsale penisvene. Efter 15 minutters WI blev nefrektomi af venstre nyre udført. Nyrearterien og urinlederen blev kanyleret. Nyren blev skyllet in situ med 10 ml saltvand (37 grader) og 5 ml 4 graders University of Wisconsin (UW) kold opbevaringsopløsning (Bridge to Life, Columbia, SC). Efter fjernelse blev nyrerne skyllet med 5 ml UW igen og opbevaret i UW i 24 timer ved 4 grader.
Normotermisk maskinperfusion.Rotte-NMP-metoden er blevet beskrevet grundigt tidligere.18 Kort fortalt blev NMP udført i 90 minutter ved hjælp af en rullepumpe (Ismatec ISM404, Zürich, Schweiz). Perfusionstrykket blev indstillet til 102 mmHg, kontrolleret ved nyrearterien. I kontrolgruppen bestod perfusionsvæsken af 100 ml William's Medium E suppleret med 30 mmol/L HEPES, 50 g/L albumin og 7 mmol/L kreatinin (alle Sigma-Aldrich). I forsøgsgrupperne, enten 30 eller 300 mg/Lmetforminblev tilsat perfusatet. Perfusionsvæsken blev oxygeneret med 95 procent oxygen og 5 procent kuldioxid med en strøm på 0,5 L/min. Temperaturen af perfusionsvæsken blev holdt på 37 grader ved anvendelse af et vandbad og varmeveksler (Julabo, Seelbach, Tyskland). Strømningen blev registreret hvert 10. minut ved anvendelse af en kalibreret flowsensor (ME1PXN Inline, Transonic Systems, Ithaca, NY). Efter NMP blev biopsier af nyrerne straks nedsænket i 4 procent formaldehyd eller lynfrosset i flydende nitrogen og efterfølgende opbevaret ved -80 grader.
figur 1Skematisk fremstilling af forsøgsgrupperne. Grupper indeholder 5-7 nyrer. HMP, hypotermisk maskine perfusion; NMP, normotermisk maskine perfusion; WIT, varm iskæmi tid.
Svin undersøgelse
Dyr.Nyrer fra hun hollandske landrace-grise blev indsamlet fra et slagteri. Dyrene blev bedøvet og afblødt i overensstemmelse med lokale standardprocedurer. Under blødning blev ca. 1 L blod opsamlet i en beholder indeholdende 25,000 IE ufraktioneret heparin (Leo Pharma). Fordi der blev brugt slagteriaffaldsmateriale, var der ikke behov for godkendelse af dyreetisk komité.
Eksperimentelt design, organhentning og konservering.For at inducere iskæmisk skade blev der anvendt 30 minutters WI. Efter denne periode blev nyren skyllet med 180 ml saltvand ved 4 grader. Umiddelbart efter skylningen blev der taget en kortikal biopsi (Invivo, Best, Holland) og opbevaret i 4 procent bufret formaldehyd. For at rumme transport fra slagteriet til laboratoriet og som en konserveringsteknik blev nyrearterien kanyleret, og nyrerne blev knyttet til en pulserende trykkontrolleret hypotermisk maskinperfusion (HMP) opsætning (Nyreassistent Transport; Organ Assist, Groningen, Holland ). Nyrerne blev perfunderet ved 4 grader under anvendelse af 500 ml UW Machine Perfusion Solution i 3 timer (Bridge to Life, London, UK) med eller uden tilsætning af 2 mgmetformin, med et gennemsnitligt arterielt tryk på 25 mmHg. Oxygen (100 procent) blev leveret til oxygenatoren (Hilite LT1000; Medos Medizintechnik AG, Stolberg, Tyskland) med en fast flowhastighed på 0,1 l/min.
Normotermisk maskinperfusion.Nyrerne blev reperfunderet under anvendelse af en ex vivo NMP-opsætning i 4 timer, som blev beskrevet tidligere. I vores undersøgelse er stigende doser afmetformineller saltvand blev tilsat under anvendelse af en infusionspumpe. Kort sagt, efter HMP blev nyrearterien kanyleret og skyllet. Urinlederen blev kanyleret til urinopsamling. Bagefter blev nyren vejet, og en biopsi blev taget og opbevaret i 4 procent bufret formaldehyd til yderligere analyse. Efterfølgende blev nyrerne anbragt i et ex vivo trykstyret NMP-kredsløb. NMP blev udført med 500 ml leukocytdepleteret, (BioR 02 plus; Fresenius Kabi, Bad Homburg, Tyskland) autologt, oxygeneret (carbogen, flow 0,5 l/min) blod i 4 timer ved et gennemsnitligt arterielt tryk på 80 mmHg. Andre forbindelser tilsat til perfusionsvæsken er angivet i tabel S1. I forsøgsgruppen,metforminopløst i Ringers lactatopløsning (20 mg/ml; Baxter, Utrecht, Holland) blev infunderet ved hjælp af en infusionspumpe styret af specialfremstillet software, hvori infusionsprofiler kunne defineres (Alaris; CareFusion, Rolle, Schweiz). Hvert 30. minut under NMP , blev infusionshastigheden øget i henhold til en forudspecificeret tidsplan (tabel S2). Denne tidsplan var baseret på humane farmakokinetiske data, der indikerer, atmetforminclearance er fire gange højere end kreatininclearance.19 I kontrolgruppen blev nyrerne perfunderet uden tilsætning afmetformin. For hvert eksperiment blev flowet registreret ved hjælp af clampon flow probe (ME7PXL; Transonic Systems), som blev fastgjort til slangen tæt på nyrearterien. Denne flowprobe er blevet kalibreret til den anvendte slange. Hvert 15. minut under NMP blev urin opsamlet og erstattet med et tilsvarende volumen af Ringers lactatopløsning, som også blev registreret. Temperaturen af perfusionsvæsken blev holdt på 37 grader ved hjælp af en integreret varmeveksler, forbundet til et vandbad (Julabo). Blod- og urinprøver blev taget efter 15 og 60 minutter og hver efterfølgende time til biokemiske analyser. Når NMP var færdig, blev biopsier taget og opbevaret i 4 procent bufret formaldehyd eller lynfrosset og opbevaret ved -80 grad til yderligere analyse.
FORBEDR NYRE FUNKTION CISTANCHE SUPPLEMENT
Begge studier
Biokemiske analyser.Perfusat- og urinprøver blev centrifugeret (henholdsvis 1.300 g i 10 minutter i rottemodellen og 1,000 g i 12 minutter i svinemodellen, begge ved 4 grader), og supernatanten blev opbevaret ved {{7} } grad. Lactatdehydrogenase (LDH), aspartataminotransferase (ASAT) og kreatinin blev bestemt i henholdsvis perfusat og kreatinin i urin af Laboratory Center for University Medical Center Groningen ved hjælp af standard biokemiske analyser. Mængden af protein udskilt i rotteurin blev målt ved hjælp af en Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), hvorimod den totale proteinkoncentration i svineurin blev målt ved hjælp af standard biokemiske analyser på Laboratory Center.
Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid.Realtime polymerase-kædereaktion (PCR) blev udført i overensstemmelse med standardprocedurer på Tagman Applied Biosystems 7900HT RealTime PCR-systemet, som beskrevet tidligere.20Amplifikation af genfragmenter involveret i reguleringen af vaskulær tonus (endotelin 1 (EDN-1, koder for ET-1); endotelnitrogenoxidsyntase (eNOS); og Krüppel-lignende faktor 2 (KLF-2), endotelaktivering (Von Willebrand faktor (wWF); vaskulær celleadhæsionsmolekyle 1(VCAM) -1) og IL-6), og varmechokprotein 70(HSP-70) blev udført med primersæt anført i tabel S3. Kort sagt blev total-RNA ekstraheret fra nyresektioner ved hjælp af TRlzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD). cDNA'et opnået fra rotter blev brugt som en intern reference under PCR for at teste primers effektivitet. Genekspression blev normaliseret med gennemsnittet af -actin mRNA indhold. Resultater blev udtrykt som 2- △ACT, hvor CT-værdien repræsenterer forskellen mellem cyklustærskelværdier.
Figur 2Perfusions- og nyrefunktionsparametre vurderet under og efter normotermisk maskinperfusion af rotte- og svinenyrer. Total kreatininclearance af rotte (a) og porcine (b) nyrer. Total urinproduktion (c, d) og totalt protein udskilt i urinen (e, f) fra henholdsvis rotte- og svinenyrer. Data præsenteres som middelværdi ± standardfejl af middelværdien. Grupper indeholder 5-7 nyrer. *P < 0.05="" og="" **p=""><>
Morfologisk scoring.Biopsier opbevaret i 4 procent formaldehyd blev indlejret i paraffin og blev skåret i 4 μm skiver. Coupes blev efterfølgende farvet med periodic acid Schiff og scoret på proksimal tubulær celle-nekrose (spænder fra mild til svær: 1-5), ødem (spænder fra mild til svær:1-4) og proksimal tubulær cellevakuolation ( spænder fra mild til svær: 1-4).21 Histopatologisk vurdering blev udført blindet af to forskere. En uafhængig klinisk patolog med stor erfaring i at vurdere histopatologiske tegn på skade efter maskinel perfusion af rotte- og svineorganer validerede resultaterne.
Beregninger.Intrarenal vaskulær modstand (IVR) blev beregnet ved at dividere det gennemsnitlige arterielle tryk med flow (udtrykt i mmHg/ml min). Kreatininclearance blev beregnet for at estimere glomerulær filtrationshastighed ved hjælp af følgende ligning: [kreatinin i urin]* urinflow/[kreatinin i perfusat].
Statistisk analyse.Alle data er udtrykt som middelværdi ± standardfejl af middelværdien. Ved sammenligning af to grupper på et enkelt tidspunkt blev forskellene vurderet ved hjælp af en uparret Students t-test. Forskelle for total urinproduktion, morfologiske scores og genekspression blev testet ved hjælp af variansanalyse. Alle statistiske test er to-halede og P Mindre end eller lig med 0.05 blev betragtet som statistisk signifikant. SPSS Statistics version 23(IBM, Armonk, NY) blev brugt til alle analyser. Arealet under kurven (AUC) blev beregnet i henhold til trapezreglen og blev brugt til at tilnærme den totale kreatininclearance, den totale mængde protein udskilt i urinen og de totale niveauer af ASAT og LDH i perfusatet.
Bemærk: Den traditionelle kinesiske lægeurt cistanche (også kendt som "drageurten" og "ørkenginseng"), vokser kun i de tørre og varme ørkener. Som en af de ni udødelige urter indeholder Cistanche (cistanche tubulosa/cistanche deserticola/ørkenlevende cistanche/cistanche salsa) rige effektive ingredienser såsom echinacosid, acteosid, totale phenylethanoid glycosider, flavonoider, polysaccharider og effektive ingredienser fremstillet af disse cistaner osv. nærende urter og madmateriale til menneskers immunitet, indre organer og hjerneceller og neuroner osv. De moderne farmakologiske undersøgelser har bekræftet følgende virkninger af cistanche (fordele ved cistanche): forbedre immuniteten; forbedre seksuel funktion og nyrefunktion; anti-træthed; anti aldring; forbedre hukommelsen; anti-Parkinsons sygdom; anti-Alzheimers sygdom; antioxidation; let-forstoppelse; anti-inflammatorisk; fremme knoglevækst, blegning af hud; beskytte leveren; etc.