Del 2: Epigenetisk regulering af det cirkadiske gen Per1 bidrager til aldersrelaterede ændringer i hippocampus hukommelse

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Venligst klik her til del 1

Knockdown af Per1 forringer langsigtethukommelsehos unge mus.Dernæst for at teste, om opregulering af Per1 i den dorsale hippocampus er nødvendig på lang sigthukommelsedannelse infunderede vi siRNA målrettet Per1 i den dorsale hippocampus af unge mus 48 timer før 10-min. OLM-træning. Infusion af Per1 siRNA producerede en signifikant reduktion af PER1-protein i den dorsale hippocampus, som målt 2 timer efter den sidste testsession (fig. 4d, supplerende fig. 5). Denne relativt beskedne nedbrydning af PER1-protein (~30 procent) producerede alvorligt svækkethukommelsedannelse til OLM; mus infunderet med Per1 siRNA viste ingen signifikant stigning i DI mellem træning og testning og viste signifikant mindre præference for det bevægelige objekt under test end kontrolmus (fig. 4e) uden effekt på den samlede genstandsudforskning ved test (fig. 4f) og ingen forskel i bevægelse under tilvænningssessionerne før træning (Supplerende Fig. 8c). Dette demonstrerer for første gang, at lokal forstyrrelse af et kerne circadian clock-gen selektivt i hippocampus kan forringehukommelsedannelse.

Per1 overekspression forbedreshukommelsehos aldrende mus. Langt om længe,at bestemme, om overekspression af Per1 i dorsale hippocampus er tilstrækkelig til at lindre aldersrelaterethukommelsesvækkelse, opregulerede vi lokalt Per1 ved hjælp af to komplementære metoder. Først brugte vi et lentivirus, der udtrykker vildtype Per1 med et v5-epitopmærke (pLVX-v5Per1) (fig. 5a, supplerende fig. 6a). For at bekræfte, at dette plasmid overudtrykker Per1, transficerede vi HT22-celler med pLVX-v5Per1 eller pLVX-EV og målte Per1 mRNA-ekspression. Både 24 og 48 timer efter transfektion var Per1 mRNA signifikant forøget i celler transficeret med pLVX-v5Per1 i forhold til celler transficeret med kontrolplasmidet (fig. 5b). Transfektion af pLVX-v5Per1 førte også til en signifikant stigning i mRNA for Per2 (et periodeur-familiemedlem, der interagerer med Per1) efter 24 timer (Supplerende Fig. 6b), selvom denne stigning var langt mindre end den observerede stigning i Per1 (kl. 24 h, Per1: 466-fold stigning i forhold til EV, Per2: 1.6- fold stigning i forhold til EV). Per1-overekspression påvirkede imidlertid ikke transkriptionen af ​​det nærmeste nedstrømsgen Hes7 (Supplerende Fig. 6c).

For at bestemme, om Per1-overekspression forbedreshukommelsepræstation i aldrende mus, blev pLVX-v5Per1 infunderet i den dorsale hippocampus på 18-mo mus 2 uger før adfærden. pLVX-v5Per1 mus viste sig signifikant forbedrethukommelsefor OLM ved test i forhold til pLVX-EV (tom vektor) kontroller (fig. 5c). Kun pLVX-v5Per1 mus viste en signifikant stigning i præference for det bevægelige objekt i hvile i forhold til træning uden observerede gruppeforskelle i total udforskning ved test (fig. 5d) eller i bevægelse under tilvænning (supplerende fig. 8d).

Efter adfærd blev hippocampusvæv fra en undergruppe af dyr behandlet til RNA-sekventering for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​pLVX-EV- og pLVX-v5Per1-transkripterne i de passende grupper in vivo (Supplerende Fig. 7a, b, f, g).

For at komplementere denne tilgang brugte vi også CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) system33 til at drive transkriptionel aktivering af Per1 i den dorsale hippocampus. Dette system består af tre lentivirale komponenter: en katalytiskinaktiv Cas9 (dCas9) fusioneret til et VP64-transskriptionelt aktiveringsdomæne med et GFP-tag (dCas9-VP64-GFP), et modificeret enkelt-guide RNA (sgRNA) målrettet Per1 med to MS2 RNA aptamerer, der kan rekruttere den tredje komponent, et MS2- dobbelt transkriptionel aktivator (MS2-p65-HSF1) fusionsprotein(Fig. 5e). Kontroldyr modtog et kontrol-sgRNA, der manglede den 20 nukleotidsekvens, der kræves for at målrette SAM-systemet til Per1 (benævnt ctrl-sgRNA). Samling af disse komponenter ved Per1-promotoren gør det muligt for de tre effektordomæner (VP64, p65 og HSF1) at drive Per1-transkription. For at bekræfte, forbedrer effektiviteten af ​​Fig. 5 Overekspression af Per1 i den dorsale hippocampus aldersrelaterede svækkelser i objektets placeringhukommelse. en skematisk af lentiviruskonstruktion, der bruges til at overudtrykke v{{0}}tagget Per1 (pLVX-v5Per1) sammenlignet med den tomme vektorkontrol (pLVX-EV). b Per1 mRNA var signifikant forøget 24 og 48 timer efter transfektion af pLVX-v5Per1 i HT22-celler sammenlignet med celler transficeret med EV (Tovejs ANOVA: Gruppe x Tidspunkt interaktion (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" sidaks="" post="" hoc-tests,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-mo="" mus,="" der="" fik="" hippocampus="" infusioner="" af="" plvx-v5per1,="" viste="" signifikant="" bedre="" hukommelse="" for="" olm="" end="" mus,="" der="" fik="" plvx-ev="" kontrolvirus="" (tovejs="" anova:="" virus="" x="" session="" interaktion,="" (f(1,29)="" {{34="" }}.15,="" p="">< 0,05),="" sidaks="" post="" hoc-tests,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" n="16," 15,="" alle="" mænd).="" d="" den="" samlede="" udforskning="" var="" ens="" for="" begge="" grupper="" ved="" testen="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" skematisk="" over="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)-system,="" der="" bruges="" til="" at="" drive="" per1-transskription.="" øverst:="" individuelle="" komponenter="" af="" sam.="" nederst:="" komponenter="" samlet="" ved="" per1-promotoren,="" der="" driver="" per1-transskription.="" f="" per1="" mrna="" var="" signifikant="" forøget="" 48="" timer="" efter="" transfektion="" af="" crispr-sam-komponenter="" i="" ht22-celler="" sammenlignet="" med="" celler="" transficeret="" med="" kontrol-sgrna="" (tovejs="" anova:="" gruppe="" x="" tidspunkt="" interaktion="" (f(1,8)="14.77" ,="" p="">< 0,01),="" sidaks="" post="" hoc-test,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" mus,="" der="" fik="" hippocampale="" infusioner="" af="" crispr-sam-systemet="" med="" sgrna="" målrettet="" per1,="" viste="" sig="" signifikant="">hukommelsefor OLM sammenlignet med EV kontrolmus med kontrol sgRNA (Tovejs ANOVA: Virus x Session interaktion (F(1,30)=5.83, p < 0.05)="" ,="" sidaks="" post="" hoc-test,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" alle="" mænd).="" h="" den="" samlede="" udforskning="" var="" ens="" for="" begge="" grupper="" ved="" testen="" (t(30)="0.41," p="0.68)." data="" præsenteres="" som="" middel="" ±="" sem="" i="" crispr-sam-systemet,="" vi="" transficerede="" ht22-celler="" med="" alle="" tre="" plasmider,="" høstede="" cellerne="" 24="" eller="" 48="" timer="" senere="" og="" målte="" per1="" mrna-ekspression.="" 48="" timer="" efter="" transfektion="" var="" per1-mrna="" signifikant="" forøget="" i="" gruppen,="" der="" fik="" per1-sgrna="" sammenlignet="" med="" kontroller="" (fig.="" 5f),="" hvilket="" bekræftede,="" at="" crispr-sam-systemet="" effektivt="" driver="" per1-mrna-ekspression.="" vi="" observerede="" ingen="" ændring="" i="" ekspression="" for="" hverken="" per2-mrna="" (supplerende="" fig.="" 6e)="" eller="" hes7-mrna="" (supplerende="" fig.="" 6f),="" hvilket="" indikerer,="" at="" crispr-sam-systemet="" driver="" selektiv="" overekspression="" af="" målgenet="">

Derefter fik 18-mo mus intra-hippocampale infusioner af CRISPR-SAM lentivirus (Supplerende Fig. 6d) og trænet i OLM 2 uger senere. Som observeret med vores pLVX-v5Per1-overekspression blev CRISPR-SAM-medieret Per1-overekspression væsentligt forbedrethukommelsepræstation i Per1 sgRNA-infunderede mus i forhold til kontroldyr (fig. 5g) uden at påvirke total udforskning (fig. 5h) eller bevægelse under tilvænning (supplerende fig. 8e). Kun mus givet Per1 sgRNA viste en signifikant stigning i præference for det bevægelige objekt i hvile i forhold til træning, hvilket indikerer intakthukommelsefor objektplaceringerne (fig. 5g). Efter adfærd blev hippocampusvæv fra en undergruppe af dyr behandlet til RNA-sekventering for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​CRISPR-transkripterne i de passende grupper in vivo (Supplerende Fig. 7c-g). Tilsammen viser disse resultater, at overekspression af Per1 i den dorsale hippocampus er tilstrækkelig til at lindre aldersrelaterede svækkelser i langsigtet objektlokationshukommelse. Per1 er derfor et nøglegen, der er kritisk for langtidshukommelsesdannelse, er reguleret af HDAC3 og er svækket i den aldrende hjerne.

Diskussion

Vores resultater viser, at sletning eller afbrydelse af den repressive histon deacetylase HDAC3 kan forbedre aldersrelaterede svækkelser på både lang sigthukommelseog synaptisk plasticitet. Yderligere genopretter deletion af HDAC3 oplevelsesinduceret ekspression af det cirkadiske gen Per1 i den dorsale hippocampus. Da hippocampus PER1-ekspression er kritisk for langtidshukommelsesdannelse (fig. 4), og overekspression af Per1 i hippocampus forbedrer aldersrelaterede hukommelsessvækkelser (fig. 5), er PER1 en potentiel mekanisme, hvorved deletion af HDAC3 forbedreshukommelseog synaptisk plasticitet hos aldrende mus. Mere generelt kan aldersrelateret forstyrrelse af Per1 forbinde aldersrelaterede svækkelser i både langtidshukommelsen og døgnrytme, afhængigt af strukturen.

Et nøgleresultat fra den aktuelle undersøgelse var, at aldersrelaterede svækkelser i hippocampus LTP kunne forbedres med HDAC3-deletion eller forstyrrelse. Dette er i overensstemmelse med nyligt arbejde fra Sajikumar-laboratoriet, der viser, at farmakologisk blokade af HDAC3 også kan lindre aldersrelaterede svækkelser i associativ hippocampus LTP34. Interessant nok fandt vi ud af, at skiver fra gamle HDAC3flox/flox og HDAC3(Y298H) dyr ikke nåede det samme niveau af potensering som skiver fra unge HDAC3ox/flox eller HDAC3(Y298H) dyr (fig. 2c, f), hvilket tyder på, at aldrende hjerner kan have et lavere plasticitetsloft end unge hjerner. En mulig forklaring på denne forskel i potensering er, at aldersrelateret tab af synaptiske kontakter i CA122 kunne sænke plasticitetsloftet i den aldrende hippocampus, da de færre tilgængelige synapser ville blive mættet hurtigere end de relativt rigelige synapser i den unge DH. Hvis dette er tilfældet, bør styrkelse af stimuleringsprotokollen eller tilvejebringelse af stimuleringsanfald35 ikke yderligere forbedre LTP i den aldrende hippocampus, da ingen yderligere synapser er tilgængelige. Yderligere arbejde vil være nødvendigt for at bestemme den mekanisme, der ligger til grund for denne forskel.

Vores RNA-sekventeringsresultater viste, at kun en lille undergruppe af gener passer til kriterierne for at blive genoprettet i den aldrende hjerne ved HDAC3-deletion (fig. 3e). I stedet for at rekapitulere genekspressionsprofilen for den unge hjerne, genoprettede sletning af HDAC3 i den aldrende hjerne oplevelsesinduceret ekspression af nogle få nøglegener, der er kritisk vigtige for langtidshukommelsesdannelse, inklusive Per1. Per1 ser ud til at være direkte reguleret af HDAC3, da fokal deletion af HDAC3-gendannet erfaringsinduceret Per1-ekspression og HDAC3 fjernes fysisk fra Per1-promotoren som svar på OLM-træning. Ydermere er Per1 udtryk nødvendig forhukommelse, som siRNA-medieret knock-down af PER1-protein i DH svækket på lang sigthukommelsedannelse hos unge mus, og overekspression forbedrethukommelsefor OLM i aldrende mus. Navnlig transficerede begge lentivirale systemer, der blev brugt til at overudtrykke Per1, kun et lille antal celler i CA1b-området af den dorsale hippocampus (Supplerende Fig. 6a, d), hvilket gør det nødvendigt at bekræfte tilstedeværelsen af ​​disse konstruktioner med RNA-sekventering (se metoder). ). Da tidligere arbejde har vist, at denne præcise region af den dorsale hippocampus er kritisk for OLM36, viser dette, at selv en lille fokal ændring af Per1 inden for en hukommelsesrelevant struktur kan påvirke langtidshukommelsesdannelsen. Dette udvider tidligere forskning, der viser, at ikke-specifik sletning af Per1 i hele hjernen kan svække hukommelsesdannelsen hos unge mus6,28,29. Unormal HDAC3-medieret undertrykkelse af Per1 i den aldrende hjerne er derfor en nøglebegivenhed, der kan føre til aldersrelaterede svækkelser i både langtidshukommelsesdannelse og døgnrytme. Selvom denne undersøgelse tydeligt viser, at Per1 er et vigtigt gen, hvorigennem HDAC3 regulerer langtidshukommelsen i den aldrende hjerne, bidrager andre gener højst sandsynligt til de hukommelsesfremmende virkninger af HDAC3-deletion. Andre gener foreslået til at mediere virkningerne af HDAC3 på synaptisk plasticitet og hukommelse inkluderer NF-κB34, FMRP37 og Nr4a226. I den aktuelle undersøgelse identificerede vi yderligere tre gener (fig. 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3), der ligesom Per1 viser nedsat udtryk i den aldrende hjerne, der forbedres ved HDAC3-deletion. Hvordan disse forskellige gener unikt bidrager til de hukommelsesfremmende virkninger af HDAC3-sletning er i øjeblikket uklart. Navnlig er alle disse gener grænseflader med CBP/CREB-vejen, som er kritisk for langtidshukommelsesdannelse38,39 og er både op- og nedstrøms for PER16,28. Da PER1 er opstrøms for CREB-phosphorylation6, er det muligt, at HDAC3--medieret undertrykkelse af Per1 reducerer CREB-phosphorylering, hvilket i sidste ende forringer transkriptionen af ​​CREB-medierede gener som Fmrp40,41 og Nr4a-genfamiliemedlemmerne Nr4a1 og Nr4a. At forstå den komplekse dynamik mellem HDAC3, PER1 og disse andre molekylære spillere vil være et vigtigt mål for fremtidig forskning.

I den aktuelle undersøgelse brugte vi to komplementære metoder til at overudtrykke Per1 i den aldrende hjerne: overekspression af en Per1 cDNA-konstruktion i fuld længde ved hjælp af pLVX-v5Per1 og transkriptionel aktivering af endogen Per1 ved hjælp af CRISPR-SAM-systemet. Selvom pLVX-medieret overekspression drev en stor stigning i Per1 mRNA (fig. 5b), blev dette ledsaget af en stigning i Per2, et andet periodefamiliemedlem (supplerende fig. 6b). Ekspressionen af ​​nedstrømsgenet Hes7 var imidlertid uændret af pLVX-v5Per1 (Supplerende Fig. 6c). CRISPR-SAM-systemet producerede på den anden side en mere subtil stigning i Per1-mRNA, der undgik off-target-forbedringer af enten Per2- eller Hes7-ekspression (Supplerende Fig. 6e-f). Da begge tilgange ligeledes forbedredes på lang sigthukommelsehos aldrende mus er det usandsynligt, at den off-target-stigning i Per2 observeret med pLVX-v5Per1 var årsagen til den observerede forbedring i langtidshukommelsen.

Circadian effekter på lang sigthukommelsetraditionelt menes at stamme fra dysregulering inden for SCN, som derefter driver ændringer i perifere strukturer involveret i hukommelsesdannelse, som den dorsale hippocampus. Lidt er kendt om rollen af ​​individuelle cirkadiske ur-gener i DH, på trods af en klar sammenhæng mellem cirkadisk rytme og langtidshukommelsesdannelse. Hukommelse er tæt forbundet med tidspunktet på dagen, da plasticitetsrelaterede genkaskader viser cirkadiske svingninger3,6 oghukommelsekan lettere erhverves i visse perioder af døgncyklussen. For eksempel erhverves kontekstfrygt-konditionering stærkere i løbet af dagen, når MAPK-phosphoryleringsniveauer topper3. Yderligere er det veldokumenteret, at aldring er ledsaget af en nedbrydning af døgnrytmer, formentlig på grund af ændringer i det centrale døgnur, den suprachiasmatiske kerne (SCN) (til gennemgang1). Hvordan denne forstyrrelse i døgnuret relaterer sig til de aldersrelaterede svækkelser ihukommelseer et åbent spørgsmål. Vores resultater tyder på, at HDAC3 begrænser erfaringsinduceret Per1 i den aldrende hippocampus, hvilket muligvis bidrager til de observerede svækkelser i langtidshukommelsen. Epigenetisk undertrykkelse af Per1 kan derfor repræsentere en vigtig grænseflade mellem aldersrelaterede svækkelser i både døgnrytme og langtidshukommelsesdannelse.

Af de kerne kanoniske circadian clock-gener er Per1 unikt klar til dramatisk at påvirke hippocampus på lang sigthukommelse. Per1 ser ud til at være overvejende involveret i SCN output pathways og spiller en nøglerolle i perifere ure nedstrøms for SCN, såsom hippocampus42. Yderligere tyder nyere arbejde på, at Per1 kan "gate" rumlig hukommelsesdannelse gennem hele dag/nat-cyklussen ved at kontrollere CREB-phosphorylering6,28,29. Faktisk er hippocampus Per1 mRNA-opregulering blevet observeret efter kontekst eller rumlig læring i mindst tre andre RNA-seq-undersøgelser, herunder arbejde i rotter, hvilket indikerer, at Per1 typisk er opreguleret efter læring på tværs af arter20,43,44. Sammen med resultaterne af den aktuelle undersøgelse indikerer dette arbejde, at PER1-ekspression er kritisk vigtig for hippocampus langtidshukommelsesdannelse; reduktioner i PER1, der opstår om natten29 eller med aldring, kan svække hippocampushukommelse. Til dato,

forskning, der involverer Per1 inhukommelsedannelsen har udelukkende været afhængig af globale knockouts, der forstyrrer Per1-ekspression i det centrale døgnrytmeur og andre regioner ud over hukommelsesrelevante strukturer som hippocampus6,28,29,45,46, hvilket gør det umuligt at afgøre, om hippocampus PER1 er specifikt påkrævet for hukommelsesdannelse. Faktisk påvirker global Per1-sletning døgnrytme i nogle rapporter42. Her viser vi for første gang, at reduktion af PER1-ekspression direkte i dorsale hippocampus kan svækkehukommelsehos unge mus, hvorimod lokal overekspression af Per1 i den dorsale hippocampus kan forbedre hukommelsen hos aldrende mus. Da selektiv deletion HDAC3 (som regulerer Per1) i den dorsale hippocampus ikke havde nogen effekt på circadian aktivitetsmønstre i den aktuelle undersøgelse (Supplerende Fig. 4), og selv elektrolytiske læsioner af dorsale hippocampus er utilstrækkelige til at påvirke døgnrytmen47, forekommer det usandsynligt, at manipulation af Per1 i dorsale hippocampus påvirker funktionen af ​​det centrale døgnur. Ikke desto mindre er det muligt, at erfaringsinducerede stigninger i Per1 eller virus-medieret overekspression af Per1 kan påvirke den cirkadiske oscillation af andre molekylære spillere, såsom andre urgener, inden for hippocampale neuroner, selv uden at påvirke cirkadiske aktivitetsmønstre. At forstå, hvordan Per1 fungerer til at ændre hukommelsesdannelse, herunder at identificere disse potentielle interagerende partnere, vil være målet for fremtidigt arbejde.

Tilsammen viser disse resultater, at det centrale døgnrytme-ur-gen Per1 spiller en nøglerolle inden for lokalehukommelsestrukturer til at ændre hukommelsesdannelse, en rolle, der er uafhængig af dens funktion i SCN. Mere generelt udfordrer dette den traditionelle hypotese om, at døgnrytmen ændrer sighukommelsedannelsen er drevet af ændringer i det centrale døgnur og understøtter i stedet hypotesen om, at generne for døgnrytmen spiller en mere autonom rolle i hippocampus celler og muligvis porterer hukommelsesdannelse baseret på tidspunktet på dagen6.

Metoder

Mus. Unge voksne mus var mellem 2 og 4 måneder gamle på testtidspunktet, og aldrende mus var mellem 18 og 20 måneder gamle. Alle mus var C57BL/6J eller holdt på en C57BL/6 baggrund (HDAC3 plus/plus og HDAC3flox/flox mus). Mus havde fri adgang til mad og vand, og lys blev holdt på en 12 timers lys/mørke cyklus. Al adfærdstest blev udført under lyscyklussen. Alle eksperimenter blev udført i henhold til US National Institutes of Healths retningslinjer for dyrepleje og brug og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Irvine.

Kirurgi. Mus blev bedøvet med isofluran (induceret, 4 procent; opretholdt 1,5-2.0 procent) og anbragt i stereotaksik. Injektionsnåle blev sænket til den dorsale hippocampus med en hastighed på 0,2 mm/15 s (AP, −2,0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, − 1,5 mm i forhold til Bregma ). To minutter efter at have nået måldybden, blev 1,0 ul virus eller siRNA infunderet bilateralt i DH med en hastighed på 6 ul/time. Til CRISPR-SAM lentivirale infusioner blev en cocktail af de tre vira infunderet til et slutvolumen på 1,5 μL pr. halvkugle med samme hastighed. Injektionsnåle forblev på plads i to minutter efter injektion for at tillade virussen at diffundere. Injektorerne blev derefter hævet 0,1 mm og fik lov til at sidde i endnu et minut, før de blev fjernet med en hastighed på 0,1 mm pr. 15 s. Virale infusioner blev udført 2 uger før adfærdsanalyse, hvorimod siRNA knockdown blev udført 2 dage før træning13. For alle injektionseksperimenter blev dyr tilfældigt tildelt de forskellige injektionsbetingelser (med undtagelse af HDAC3 plus/plus og HDAC3flox/flox mus, som alle blev injiceret med AAV-CaMKII-Cre). For alle adfærdsmæssige eksperimenter blev dyr inden for hver viral tilstand tilfældigt tildelt til hjemmebur/trænede grupper, og alle forhold (objekter, kasser osv.) blev udlignet mellem grupperne.

AAV produktion. AAV2.1-CaMKII-Cre blev købt fra Penn Vector Core (titer: 1,81 × 1013 GC/ml). For AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5 amplificerede vi vildtype HDAC3 fra hippocampus cDNA og klonede produktet ind i en modificeret pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) under kontrol af CMV-promotoren og -globin-intron. 3x-FLAG-mærket, IRES-elementet og hrGFP blev fjernet fra vektoren og erstattet med et V5-mærke, hvilket muliggjorde en C-terminal fusion til HDAC3 (plasmid MW91). For at skabe punktmutationen ændrede vi nukleotiderne til at kode for en histidinrest i stedet for tyrosin ved aminosyre 298 (plasmid MW92). For den tomme vektorkontrol var HDAC3-kodende sekvens ikke til stede, men alle andre elementer forbliver (plasmid MW87). AAV blev lavet af Penn Vector Core, og de endelige titere blev bestemt ved qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6,48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1,35 × 1013 GC/ml).

Lentivirus produktion. Til CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM)-systemet blev lentivirale plasmider købt fra Addgene til dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) og MS2- P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) konstruktioner (titere større end eller lig med 8× 106 TU/ml). For Per1 sgRNA'et klonede og indsatte vi en antisense-guidesekvens svarende til CRE-elementet i Per1-promotoren (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) i Addgene sgRNA(MS2) kloningsrygraden (#61427). Kontrol-sgRNA'et var identisk, bortset fra at ingen guidesekvens blev klonet ind i plasmidet. Lentivira for både Per1 sgRNA (titer: 6,8 × 107 IFU/ml) og kontrol sgRNA (3,5 × 107 IFU/ml) blev produceret af USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory.

Til pLVX-V5Per1-overekspressionskonstruktionen amplificerede vi fuldlængde vildtype Per1 fra Addgene pCMV-Sport2-mPer1-plasmidet (#16203) og klonede produktet ind i en modificeret pLVX-EF1 -IRES-mCherry rygrad (Takara, #631987). IRES- og mCherry-elementerne blev fjernet og blev erstattet med et V5-mærke, hvilket muliggjorde en N-terminal fusion til PER1 (plasmid MW206). For den tomme vektor (EV) kontrol var PER1-kodende sekvens ikke til stede, men alle andre elementer forblev (plasmid MW93). Lentivira til pLVX-v5Per1 (titer: 1,3 × 108 IFU/ml) og pLVX-EV (titer: 1,5 × 108 IFU/ml) blev produceret af USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory. Alle lentivirale konstruktioner blev udtrykt under EF1-promotoren.

Cellekulturverifikation af pLVX-v5Per1 og CRISPR-SAM. For at verificere, at pLVX-v5Per1 producerer overekspression af Per1-mRNA, blev muse-HT22-celler (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) transficeret med pLVX-v5Per1 eller pLVX-EV (fig. 5a) under anvendelse af Lipofectaine LTX (Invitrogen). For at verificere, at CRISPR-SAM-systemet effektivt kan drive Per1-transkription, blev HT22-celler transficeret med dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast var en gave fra Feng Zhang Addgene plasmid #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast var en gave fra Feng Zhang, Addgene plasmid #61426), og enten Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) eller det ikke-målrettede kontrol sgRNA (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2) _zeo rygrad var en gave fra Feng Zhang, Addgene plasmid #61427) under anvendelse af Lipofectamine LTX (Invitrogen). Celler blev høstet efter 24 eller 48 timer, lyseret, og mRNA blev isoleret som beskrevet ovenfor. qRT-PCR blev udført som beskrevet ovenfor ved hjælp af Per1, Per2 og Hes7 primere og probe, der er anført i tabel S4.

siRNA. Til Per1 knockdown-eksperimentet blev Accell SMARTpool små interfererende RNA'er (siRNA'er; Dharmacon, GE) rettet mod Per1 fortyndet til en endelig totalkoncentration på 1 0 μM i ddH20 og infunderet i DH (1,0 ul/side). Accell non-targeting pool siRNA blev brugt som kontrol (total koncentration, 10 μM) og blev infunderet på samme måde. Til siRNA-eksperimenter blev mus håndteret og tilvænnet som beskrevet ovenfor, og kirurgi blev udført dagen efter den sidste tilvænningsdag. Mus fik en hel dag med restitution efter operationen og blev trænet den følgende dag (~ 48 timer efter operationen) for at sikre maksimal målnedbrydning. For at sikre knockdown blev mus aflivet ~ 1 time efter test, og slag fra den dorsale hippocampus blev behandlet med western blots for at sikre knockdown af PER1-protein.

Objektplacering og objektgenkendelsehukommelseopgaver. Til objektplacering og objektgenkendelseshukommelsesopgaver blev mus håndteret i 2 minutter/dag i 4 dage og derefter vænnet til konteksten i 5 minutter/dag i seks på hinanden følgende dage i fravær af objekter. Under træningen blev mus udsat for to identiske genstande (100 ml bægerglas, krydderi dåser eller glas lysestager) og fik lov til at udforske i 10 min. Under retentionstesten (24 timer senere for langvarighukommelseeller 60 m senere for korttidshukommelse), fik mus lov til at udforske i 5 min. Til objektplaceringhukommelse, blev et af de to kendte objekter flyttet til et nyt sted. Til genkendelse af objekterhukommelse, objektplaceringerne forblev konstante, men et af objekterne blev erstattet med et nyt element. Tilvænning til objektgenkendelseshukommelse begyndte mindst en uge efter afslutningen af ​​OLM-testning, og en ny kontekst og ukendte objekter blev brugt48. Udforskning blev scoret, når musehovedet orienterede mod objektet og kom inden for 1 cm, eller når næsen rørte ved objektet. Samlet udforskningstid blev registreret (t), og præference for det nye emne blev udtrykt som et diskriminationsindeks (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 procent ). Til træningssessioner blev det objekt, der var udpeget til at blive flyttet ved test, brugt som det nye objekt for at gøre det muligt at sammenligne trænings- og test-DI direkte. Mus, der udforskede begge objekter i mindre end 2 s under test eller 3 s under træning, blev fjernet fra yderligere analyse. Mus, der viste en præference for et objekt under træning (DI > ±20), blev også fjernet. Tilvænningssessioner blev analyseret (for at bestemme den tilbagelagte distance og hastighed) ved hjælp af ANY-labyrint adfærdsanalysesoftware (Stoelting Co). Al tilvænning, træning, test og scoring blev udført af forsøgsledere, der var blindet for forsøgsgrupperne.

Kontekst frygt til tilstand. Til kontekstuel frygtkonditionering blev mus først håndteret i 5 dage. Under erhvervelsen blev mus udsat for konteksten i 2 min og 28 s efterfulgt af et 2 s (0.75 mA) stød, en protokol, der typisk producerer robust langtidshukommelse12,20. Mus forblev i konteksten i yderligere 30 s, før de blev fjernet. Mus blev aflivet 60 m efter træning sammen med hjemmeburkontroller, der blev håndteret, men ikke trænet. Fryseadfærd blev målt ved hjælp af Ethovision 11 software (Noldus)12.

Forhøjet plus-labyrint. Plus-labyrinten blev udført af en forsøgsleder, der var blind for forsøgsgrupperne. En uge efter afslutningen af ​​ORM blev en undergruppe af mus testet på plus-labyrinten. To arme af labyrinten var åbne (30 × 5 cm), og to arme var lukket (30 × 5 × 15 cm), forbundet med en central platform (5 × 5 cm). Labyrinten var hævet 40 cm over gulvet. Mus blev testet i 5 minutter på apparatet, som bestod i at placere hver mus på den centrale platform vendt mod en af ​​de åbne arme. Mellem forsøgspersonerne blev labyrinten renset med 70 procent ethanol. Procentdelen af ​​tid brugt i de lukkede og åbne arme blev scoret ved hjælp af ANY-labyrint-software.

Døgnrytmeanalyse. Unge ({{0}}mnd) og aldrende (18-mnd.) HDAC3 plus/plus og HDAC3flox/flox mus blev opdrættet og anbragt under en 12 timers lys/mørke (LD) cyklus. To uger efter AAV-CaMKII-Cre-infusion (beskrevet ovenfor) blev mus overført til et isoleret 12 timers LD-medrivningsrum i 7 dage. Mus blev derefter overført til et lysbeskyttet aktivitetsanalyserum, hvor lokomotorisk aktivitet blev analyseret ved hjælp af optiske strålebevægelsesdetektorer (Philips Respironics). Aktiviteten blev overvåget under 2 ugers LD-cyklus-medrivning i det lysbeskyttede rum, før mus blev skiftet til konstant mørke (DD) i yderligere 3 uger. Aktivitetsovervågning fortsatte gennem DD-fasen for at bestemme, om HDAC3-deletion i DH påvirkede endogene døgnrytmer. Data blev indsamlet ved hjælp af Minimitter VitalView 5.0 og Clocklab-software (Actimetrics) blev brugt til at bestemme begyndelsen af ​​fri aktivitet. Tau-værdier blev beregnet ved at opnå hældningen af ​​denne begyndelse og beregne de mindste kvadraters tilpasning med Clocklab-software49,50.

Immunhistokemi. Efter afslutningen af ​​adfærden blev mus aflivet ved cervikal dislokation, og deres hjerner blev fjernet og flash-frosset i iskold isopentan. Tyve-mikrometer skiver blev samlet i hele den dorsale hip-campus, tø-monteret på objektglas og opbevaret ved -8 0 grader. Objektglassene blev fikset med 4 procent paraformaldehyd (10-min), permeabiliseret i 0.01 procent Triton X-100 i 0,1 M PBS (5-min) , og blokeret i 1 time med 8 procent normalt gedeserum (Jackson). Objektglassene blev inkuberet natten over (4 grader) i kaninantistof mod HDAC3 (1:250, Abcam, klon Y415, ab32369) eller V5 (1:1000, Abcam, ab9116) eller kyllingeantistof mod GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Den følgende dag blev objektglassene vasket og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med gede-anti-kanin Alexa 488 (HDAC3 og V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) eller gede-anti-kylling Alexa 488 (GFP) ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) i mørket. Objektglassene blev derefter vasket med PBST og inkuberet i 50 m i NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), en fluorescerende nissl-farve. For at standse ikke-specifik autofluorescens51 blev skiverne derefter vasket i PBS med 0,01 procent Triton, skyllet i vand og inkuberet i 10-min. i 10 mM CuSO4 i 50 mM ammoniumacetatbuffer. Skiverne blev igen skyllet i vand, vasket i PBS og dækglas med VectaShield Antifade monteringsmedium (Vector Laboratories).

Alle billeder blev optaget med en Olympus Scanner VS110 med et 20x apokromatisk objektiv (numerisk blænde 0,75) med VS110 scannersoftware. Alle behandlingsgrupper var repræsenteret på hvert objektglas, og alle billeder på et objektglas blev optaget med den samme eksponeringstid under ikke-mættende forhold. Immunmærkningsintensiteten blev kvantificeret med ImageJ ved at prøve den optiske tæthed af cellelaget i CA1 og trække en prøve af baggrundsfluorescens i det samme billede. For alle AAV-eksperimenter blev dyr, der ikke udtrykte virussen i område CA1 af den dorsale hippocampus, udelukket fra analyser. Billeddannelse og kvantificering blev udført af forsøgspersoner, der var blinde for de eksperimentelle forhold.

Western blot. For at verificere PER1 knockdown blev Per1 siRNA og kontrol siRNA mus aflivet 2 timer efter testning, og hjerner blev flash-frosset. Hjerner blev koronalt sektioneret, og 1 mm DH-stanser blev indsamlet fra 5 00 μm skiver. Stanser blev homogeniseret i T-PER-buffer (Thermo Fisher) med Halt-protease og phosphatase-inhibitor (Thermo Fisher) under anvendelse af en Dounce-homogenisator. Proteinlysater blev kvantificeret ved hjælp af et modificeret Bradford-assay (BioRad), og 5 0 ug totalt proteinlysat blev indlæst i hver bane af en 7,5 procent NuPAGE Bis-Tris gel (Thermo Fisher). Geler kørte i 50 minutter ved 200 volt, og blots blev overført natten over ved 15 V ved 4 grader på nitrocellulosemembraner (Novexi, LC2001). Den følgende dag blev membraner inkuberet i blokerende buffer i 1 time (5 procent fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand med 0,01 procent Tween 20), vasket (0,1 procent Tween 20 i TBS) og derefter inkuberet i primært antistof (1:500, kanin anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) i primær antistofbuffer (3 procent BSA i TBS med 0,1 procent Tween) natten over ved 4 grader. Membranerne blev derefter vasket og inkuberet i HRP-konjugeret museantistof mod kanin (1:10,000, Jackson Laboratories, let kæde-specifik, #211-032-171) i 1 time. Membraner blev vasket og udviklet under anvendelse af Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, 34077). Flere filmeksponeringer blev brugt til at verificere linearitet. Blots blev vasket og strippet i 10 m med Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), vasket igen og derefter re-probed natten over (4 grader) med et kaninantistof mod GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778) ). Fuldlængde PER1 og GAPDH blots er vist i supplerende figur 5. Relative optiske tætheder blev beregnet ud fra scannet film ved hjælp af ImageJ (US National Institutes of Health) af en eksperimentator, der var blind for de eksperimentelle forhold. Alle værdier blev normaliseret til GAPDH-ekspressionsniveauer.

QRT-PCR. Væv blev opsamlet fra DH-stanser (beskrevet ovenfor) og frosset ved -80 grader indtil behandling. RNA blev isoleret under anvendelse af et RNeasy Minikit (Qiagen, #74104), og cDNA blev skabt ved anvendelse af Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, 04379012001). Primere og prober blev afledt af Roche Universal ProbeLibrary (tabel S4) og blev brugt til multipleksing i Roche Light-Cycle 480 II-maskinen (Roche). Alle værdier blev normaliseret til Gapdh. Analyser og statistik blev udført ved hjælp af Roches proprietære algoritmer og REST 2009-software baseret på Pfafffl-metoden52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 indgik i vores analyse. cDNA-biblioteker for hver gruppe blev fremstillet i henhold til TruSeq RNA Sample Preparation Guide (Illumina). To hundrede og halvtreds nanogram total RNA fra hver mus blev renset med poly-T oligo-vedhæftede magnetiske perler og varmefragmenteret. Den første og anden strengs cDNA blev derefter syntetiseret og oprenset. Efter at enderne var gjort stumpe, blev 3'-enden adenyleret for at forhindre sammenkædning af skabelonen under adapterligering. For hver gruppe blev et unikt adaptersæt tilføjet til enderne af cDNA'et, og bibliotekerne blev amplificeret ved PCR. Kvaliteten af ​​biblioteket blev vurderet af Bioanalyzer og kvantificeret ved hjælp af qRT-PCR med en standardkurve fremstillet fra et kommercielt sekventeringsbibliotek (Illumina). Prøver blev multiplekset med hver adfærdsgruppe repræsenteret i hver flowcelle i sequenceren. 10 nM af hvert bibliotek blev samlet i fire multiplex-biblioteker og sekventeret på et Illumina HiSeq 2500-instrument under en enkeltlæst 50 bp-sekventering, drevet af Genomic High-Throughput Facility ved University of California, Irvine. De resulterende sekventeringsdata for hvert bibliotek blev efterbehandlet for at producere FastQ-filer. Dataene blev derefter demultiplekset og filtreret ved hjælp af Illumina CASAVA 1.8.2-software såvel som intern software. Aflæsninger af dårlig kvalitet (som ikke svigter Illuminas standardkvalitetstest) og kontrolaflæsninger, der er afstemt med PhiX-kontrolgenomet, blev fjernet fra analyser. Kvaliteten af ​​de resterende sekvenser blev yderligere vurderet ved hjælp af PHRED-kvalitetsscorer produceret i realtid under basiskaldetrinnet af sekventeringskørslen (Supplerende Fig. 3a).

Tilpasning til referencegenomet og transkriptomet. Aflæsningerne fra hvert eksperiment blev separat justeret til referencegenomet og det tilsvarende transkriptom ved brug af kortlæste aligners ELAND v2e (Illumina) og Bowtie24. Aflæsninger unikt justeret af begge værktøjer til kendte exoner eller splejsningsforbindelser med ikke mere end to fejlparringer på et hvilket som helst 25 bp-fragment af aflæsningen blev inkluderet i transkriptomet. Aflæsninger entydigt justeret, men med mere end to uoverensstemmelser på ethvert 25 bp fragment af aflæsningen blev fjernet fra analyser. Tilsvarende blev læsninger, der matchede flere steder i referencegenomet, fjernet fra analysen. Procentdelen af ​​læsninger tildelt referencegenomet og transkriptomet ved hjælp af denne protokol er rapporteret for hver gruppe af replikater (Supplerende Fig. 3b). Dette resulterede i et gennemsnit på cirka 30 millioner aflæsninger pr. prøve.

For at verificere tilstedeværelsen af ​​pLVX- og CRISPR-SAM-plasmiderne efter lentiviral infusion kørte vi RNA-sekventering på hippocampale prøver fra en undergruppe af tre dyr pr. gruppe efter adfærd. Da antallet af celler inficeret med lentivira in vivo var for lille til pålideligt at detektere tilstedeværelsen af ​​de passende transkripter ved hjælp af RT-qPCR (Supplerende Fig. 6a, d), brugte vi RNA-seq som en mere følsom metode til at detektere tilstedeværelsen af disse afskrifter. En opdateret version af genomsamling og genomannotering blev bygget ved at tilføje sekvenserne og annoteringen af ​​plasmidkonstruktionerne til henholdsvis det originale mm10 musegenom og til mm10 musegenomannotationen. Ved at bruge læsejusteringsværktøjet TopHat i Tuxedo Suite54 blev læsninger kortlagt til genomet, og kun hits, der var unikke for plasmidtranskripterne i sammenligning med det endogene musereferencegenom, blev betragtet som "matchede læsninger" til plasmidkonstruktionerne. Antallet af disse matchede læsninger blev derefter kvantificeret for hver konstruktion for hver prøve.

Genekspression og differentiel analyse. Genekspressionsniveauer blev direkte beregnet ud fra de læste justeringsresultater for hver replikat. Standard RPKM-værdier55, læsninger pr. kilobase af exon-model pr. million kortlagte læsninger) blev ekstraheret for hvert gen dækket af sekventeringsdataene og hver replikat anvendt i denne undersøgelse.

Differentielle transkriptionsanalyser blev udført ved hjælp af Cyber ​​T56,57 på tværs af hvert par af grupper (homecage versus 60 m efter træning) for at identificere gener op- eller nedreguleret efter OLM. Ud over de 18-måned gamle HDAC3 plus/plus- og HDAC3ox/flox-mus, der er trænet til det aktuelle studie, behandlede identisk RNA-sekventeringsdata fra {{10}}måned gamle C57-vildtypemus ( homecage og OLM-trænet på samme måde som det nuværende studie) fra en tidligere undersøgelse20 blev brugt til differentialanalyser. Antallet af dyr (biologiske replikater) for hver gruppe var: Young HDAC plus / plus HC: 6, Young HDAC3 plus / plus OLM: 6, Old HDAC3 plus / plus HC: 6, Old HDAC3 plus / plus OLM: 6, Old HDAC3flox/flox HC: 8, Gammel HDAC3flox/flox OLM: 8. Ingen tekniske replikater blev brugt. Tærsklen for p-værdi, der bruges til at bestemme differentialekspression, er 0,05 for alle grupper. Falsk Discovery Rate (FDR) målt ved Benjamini & Hochberg (BH) q-værdien blev brugt til at korrigere for multiple tests med en FDR-tærskel på 0,15. Sæt af gener opreguleret efter oplevelsen (sammenlignet med hjemmebur) for disse 3 grupper (ung vildtype, aldrende HDAC plus/plus eller aldrende HDAC3flox/flox) blev krydset for at bestemme gener, der er fælles for to eller flere grupper. Berigelse af hver gruppe for vævsspecifik ekspression, Gene Ontology termer58 og KEGG pathways59,60 blev vurderet ved hjælp af DAVID61, baseret på differentielt udtrykte gener efter adfærd. Datavisualisering blev udført ved hjælp af "matplotlib" for python og "ggplot" for R.

Chromatin immunpræcipitation. ChIP blev udført på DH-puncher baseret på protokollen fra Millipore ChIP kit11,12,62. Væv blev tværbundet med 1 procent formaldehyd (Sigma), lyseret og sonikeret, og kromatin blev immunpræcipiteret natten over med 2 ul anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) eller 4 ul anti-HDAC3 (Millipore #{{ 13}}) eller en tilsvarende mængde normalt kaninserum (H4K8Ac negativ kontrol, Millipore) eller anti-muse IgG (HDAC3 negativ kontrol, Millipore). Efter vask blev kromatin elueret fra perlerne og omvendt tværbundet i nærvær af proteinase K før søjleoprensning af DNA. Primersekvenser for promotorerne af hvert gen blev designet af Primer 3-programmet (tabel S4). Fem µl input, anti-H4K8Ac IgG/anti-HDAC3 IgG eller anti-kanin/muse IgG immunpræcipitat fra hvert dyr blev undersøgt i to eksemplarer. For at normalisere ChIP-qPCR-data brugte vi procentindtastningsmetoden. Inputprøven blev justeret til 100 procent, og både IP- og IgG-prøverne blev beregnet som en procentdel af dette input ved hjælp af formlen 100*AE^(justeret input – Ct(IP)). Foldberigelse blev derefter beregnet som et forhold mellem ChIP og den gennemsnitlige IgG. En standardkurve på en plade bestemt amplifikationseffektivitet (AE).

Forberedelse og optagelse af skiver. Unge (ca. 3-må) og aldrende (18-må) mus blev stereotaksisk infunderet med virussen. Til det første eksperiment blev unge og gamle HDAC3 plus/plus- og HDAC3ox/flox-mus infunderet med AAV-CaMKII-Cre bilateralt i DH. Til det andet eksperiment blev unge og gamle vildtype C57-mus infunderet med AAV-HDAC3(Y298H) i DH af den ene halvkugle og AAV-EV-kontrol i den anden halvkugle. To uger efter infusion (for at muliggøre optimal virusekspression)2 blev tværgående hippocampale skiver (320 μm) anbragt i et grænsefladeregistreringskammer med forvarmet (31 ± 1 grad) kunstig cerebrospinalvæske (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM) KH2P04, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 og 10 mM D-glucose). Skiverne blev kontinuerligt perfunderet med en hastighed på 1,75-2 ml pr. minut, mens overfladen af ​​skiverne blev udsat for varm, fugtet 95% O2/5% CO2. Optagelserne begyndte efter mindst 2 timers inkubation.

Felt excitatoriske postsynaptiske potentialer (fEPSP'er) blev registreret fra CA1b stratum radiatum ved hjælp af en enkelt glaspipette (2-3MΩ) fyldt med 2 M NaCl. Stimuleringsimpulser (0.05 Hz) blev leveret til Schaffer collateral-commissural projektioner ved hjælp af en bipolær stimulerende elektrode (snoet nichromtråd, 65 μm) placeret i CA1c. Strømintensiteten blev justeret for at opnå 50 procent af maksimal fEPSP-respons. Efter at en stabil basislinje var etableret, blev LTP induceret med et enkelt tog på fem theta-bursts, hvor hver burst (fire impulser ved 100 Hz) blev leveret med 200 ms fra hinanden (dvs. ved theta-frekvensen). Stimuleringsintensiteten blev ikke øget under TBS. Data blev indsamlet og digitaliseret af NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Statistisk analyse. Statistiske analyser blev udført som angivet i tekst- og figurforklaringerne ved hjælp af Prism 6 (GraphPad). Vores analytiske tilgange er baseret på tidligere offentliggjort arbejde12,20,63,64. Der blev ikke brugt statistiske metoder til at forudbestemme stikprøvestørrelser, men vores stikprøvestørrelser ligner dem, der generelt anvendes i feltet, inklusive dem, der er rapporteret i de tidligere publikationer12,20,64,65. Datafordelingen blev antaget at være normal, med lignende varians observeret blandt grupper, men dette blev ikke formelt testet. Når et eksperiment havde to grupper at sammenligne, blev der brugt to-halede Students t-test. Når to faktorer blev sammenlignet (såsom alder og genotype eller session og gruppe), blev data analyseret med to-vejs ANOVA'er efterfulgt af Sidaks multiple sammenligninger post hoc test. Alle analyser er to-halede, med en værdi på 0,05 påkrævet for signifikans. Fejlbjælker i alle figurer repræsenterer SEM. For alle eksperimenter blev værdier ± 2SD fra gruppegennemsnittet betragtet som outliers og blev fjernet fra analyser.

Datatilgængelighed. De data, der understøtter resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter rimelig anmodning. RNA-sekventeringsdata er blevet deponeret i NCBI's Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO Series accessionsnummer GSE94832.

Referencer

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Epigenetiske ændringer i den suprachiasmatiske kerne og hippocampus bidrager til aldersrelateret kognitiv tilbagegang. Oncotarget 6, 23181-23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Døgnrytme og hukommelsesdannelse. Nat. Rev. Neurosci. 11, 577-588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et al. Circadian oscillation af hippocampus MAPK-aktivitet og cAmp: implikationer for hukommelsesvedholdenhed. Nat. Neurosci. 11, 1074-1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Circadian modulering af indlæring og hukommelse i frygt-betingede mus. Opfør dig. Brain Res. 133, 95-108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV Den aldrende hjernes døgnrytme og patologi. Nat. Rev. Neurosci. 13, 325-335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Period1 porter den cirkadiske modulering af hukommelsesrelevant signalering i musehippocampus ved at regulere den nukleare shuttling af CREB-kinasen pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731-745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD En epigenetisk hypotese om aldringsrelateret kognitiv dysfunktion. Front Aging Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et al. Ændret histonacetylering er forbundet med aldersafhængig hukommelsessvækkelse hos mus. Science 328, 753-756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. H3K9me3-hæmning forbedrer hukommelsen, fremmer dannelsen af ​​rygsøjlen og øger BDNF-niveauer i den ælde hippocampus. J. Neurosci. 36, 3611-3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Epigenetiske bidrag til kognitiv aldring: disentangling mindspan and lifespan. Lær Mem. 21, 569-574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. HDAC3-selektiv hæmmer øger udryddelsen af ​​kokain-søgende adfærd på en vedvarende måde. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647-2652 (2013).

12. Kwapis, JL et al. Kontekst og auditiv frygt er differentielt reguleret af HDAC3-aktivitet i de laterale og basale subkerner af amygdala. Neuropsychopharmacology 42, 1284- 1294 (2017).

13. McQuown, SC et al. HDAC3 er en kritisk negativ regulator af langtidshukommelsesdannelse. J. Neurosci. 31, 764-774 (2011).

14. Bieszczad, KM et al. Histon-deacetylase-hæmning via RGFP966 frigiver bremserne på sensorisk kortikal plasticitet og specificiteten af ​​hukommelsesdannelse.J. Neurosci. 35, 13124-13132 (2015).

15. Lahm, A. et al. Optrævling af den skjulte katalytiske aktivitet af hvirveldyr klasse IIa histon deacetylaser. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 17335-17340 (2007).

16. Sun, Z. et al. Deacetylase-uafhængig funktion af HDAC3 i transkription og metabolisme kræver nuklear receptor corepressor. Mol. Cell 52, 769-782 (2013).

17. Alaghband, Y. et al. Distinkte roller for deacetylase-domænet af HDAC3 i hippocampus og mediale præfrontale cortex i dannelsen og udryddelsen af ​​hukommelse. Neurobiol. Lære. Mem. 145, 94-104 (2017).

18. Nott, A. et al. Histon deacetylase 3 associerer med MeCP2 for at regulere FOXO og social adfærd. Nat. Neurosci. 19, 1497-1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR. Histondeacetylase 3 er nødvendig for korrekt hjerneudvikling. J. Biol. Chem. 289, 34569-34582(2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. Den neuron-specifikke kromatinregulatoriske underenhed BAF53b er nødvendig for synaptisk plasticitet og hukommelse. Nat. Neurosci. 16, 552-561 (2013).

21. Alberini, CM Transkriptionsfaktorer i langtidshukommelse og synaptisk plasticitet. Physiol. Rev. 89, 121-145 (2009).

22. Barnes, CA Langsigtet potensering og den aldrende hjerne. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 358, 765-772 (2003).

23. Speir, ML et al. UCSC Genome Browser-databasen: 2016-opdatering. Nucleic Acids Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Ultrahurtig og hukommelseseffektiv tilpasning af korte DNA-sekvenser til det humane genom. Genom Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Hippocampus-ekspressionsanalyser afslører selektiv association af øjeblikkelig-tidlige, neuroenergetiske og myelinogene veje med kognitiv svækkelse hos ældre rotter. J. Neurosci. 27, 3098-3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Differentielle roller for Nr4a1 og Nr4a2 i objektplacering vs. objektgenkendelse langtidshukommelse. Lær Mem. 19, 588-592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Effekter af søvnmangel og aldring på langtids- og fjernhukommelse hos mus. Lær Mem. 22, 197-202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. PERIOD1 koordinerer hippocampus rytmer og hukommelsesbehandling med dagtimerne. Hippocampus 24, 712-723 (2014).

29. Jilg, A. et al. Temporal dynamik af mus hippocampus ur-genekspression understøtter hukommelsesbehandling. Hippocampus 20, 377-388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Cirkadiske svingninger i hippocampus understøtter hukommelsesdannelse og vedholdenhed. Front Mol. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Erfaringsafhængig genekspression i rottehippocampus efter rumlig læring: en sammenligning af de umiddelbart-tidlige gener Arc, c-fos og zif268. J. Neurosci. 21, 5089-5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Chromatin-modifikationer og deres funktion. Cell 128, 693-705 (2007).

33. Konermann, S. et al. Genom-skala transkriptionel aktivering af et konstrueret CRISPR-Cas9 kompleks. Nature 517, 583-588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Histone deacetylase 3-hæmning genetablerer synaptisk tagging og indfangning i aldring gennem aktivering af nuklear faktor kappa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et al. Synaptisk bevis for effektiviteten af ​​afstandslæring. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121-5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. Hippocampus fokal knockout af CBP påvirker specifikke histonmodifikationer, langsigtet potensering og langtidshukommelse. Neuropsychopharmacology 36, 1545- 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Øget langsigtet potensering ved mediale-perforante path-dentate granula cellesynapser induceret af selektiv inhibering af histon deacetylase 3 kræver Fragilt X mental retardation protein. Neurobiol. Lære. Mem. 114, 193-197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB og hukommelse. Annu. Rev. Neurosci. 21, 127-148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Funktionelle roller af CREB som en positiv regulator i dannelsen og forbedringen af ​​hukommelsen. Brain Res. Tyr. 105, 17-24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Genet, der koder for det skrøbelige X RNA-bindende protein, styres af nuklear respiratorisk faktor 2 og CREB-familien af ​​transkriptionsfaktorer. Nucleic Acids Res. 34, 1205-1215 (2006).

41. Wang, H. et al. Roller af CREB i reguleringen af ​​FMRP af gruppe I metabotropiske glutamatreceptorer i cingulate cortex. Mol. Brain 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Ændrede adfærdsrytmer og clock-genekspression hos mus med en målrettet mutation i Period1-genet. EMBO J. 20, 3967-3974 (2001).

43. Halder, R. et al. DNA-methyleringsændringer i plasticitetsgener ledsager dannelsen og vedligeholdelsen af ​​hukommelse. Nat. Neurosci. 19, 102-110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Erfaringsafhængig epigenomisk reorganisering i hippocampus. Lær Mem. 24, 278-288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Et urgen, punktum, spiller en nøglerolle i dannelsen af ​​langtidshukommelse hos Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058-16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Kokainsensibilisering og belønning er under indflydelse af døgnrytmegener og rytme. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026-9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Den daglige oscillation af MAP (mitogen-aktiveret protein) kinase og adenylyl cyclase aktiviteter i hippocampus afhænger af den suprachiasmatiske kerne. J. Neurosci. 31, 10640-10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Undersøgelse af objektplacering og objektgenkendelseshukommelse hos mus. Curr. Protoc. Neurosci. 69, 1-17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. Det cirkadiske ur i den ventromediale hypothalamus styrer cyklisk energiforbrug. Celle Metab. 23, 467-478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Fænotyping af døgnrytmer hos mus. Curr. Protoc. Mus Biol. 5, 271-281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Reduktion af lipofuscin-lignende autofluorescens i fluorescensmærket væv. J. Histochem. Cytochem. 47, 719-730 (1999).

52. Pfafffl, MW En ny matematisk model for relativ kvantificering i real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).

53. Pfafffl, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Relativt udtrykssoftwareværktøj (REST) ​​til gruppevis sammenligning og statistisk analyse af relative udtryksresultater i real-time PCR. Nucleic Acids Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et al. Differentiel gen- og transkriptekspressionsanalyse af RNA-seq-eksperimenter med TopHat og Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Kortlægning og kvantificering af pattedyrs transkriptomer ved RNA-Seq. Nat. Methods 5, 621-628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T-webserver: differentiel analyse af data med høj kapacitet. Nucleic Acids Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD En Bayesiansk ramme til analyse af mikroarray-ekspressionsdata: regulariseret t-test og statistiske inferenser af genændringer. Bioinformatics 17, 509-519 (2001).