Abstrakt

Regenerativ medicin har fået stigende opmærksomhed som en ny terapeutisk tilgang på grund af mangel på behandlinger for nyresygdomme. Nylige fremskridt inden for nyregenerering ved hjælp af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) er bemærkelsesværdige. Baseret på viden om nyreudvikling differentierer hiPSC'er retningsmæssigt til to typer embryonale nyre-stamceller, nefronmetaboliske progenitorceller (NPC'er) og ureterale knopper (UB), der er i stand til at generere nefroner og opsamle kanallignende organer. Derudover kan humant nyrevæv genereres fra disse hiPSC-afledte progenitorceller, hvori NPC-afledte glomeruli og tubuli og UB-afledte opsamlingskanaler er indbyrdes forbundet. Det inducerede nyrevæv vaskulariseres yderligere efter transplantation i immundefekte mus. Ud over nyrekonstruktion til transplantation har celleterapi med hiPSC-afledt NPC vist sig at lindre akut nyreskade (AKI) hos mus. Sygdomsmodellering og lægemiddelopdagelsesundersøgelser ved hjælp af sygdomsspecifikke hiPSC'er er også blevet stærkt brugt i refraktære nyresygdomme såsom autosomal dominant polycystisk nyresygdom (ADPKD). For at løse de komplikationer, der er forbundet med nyresygdomme, er hiPSC-afledte erythropoietin (EPO)-producerende celler med succes blevet genereret til lægemiddelopdagelse og udvikling af cellulære terapier til nyreanæmi. Denne artikel gennemgår de nuværende og fremtidige perspektiver for nyreudviklingsbiologi og regenerativ medicin til nyresygdomme baseret på iPSC-teknologi.

Nøgleord

iPSC ;Nyreregenerering ;Nephron progenitor celle;Ureteric knop;Celleterapi ; Sygdomsmodellering;Cistanche tubulosa

Introduktion

Nyresygdom udgør et stort medicinsk problem og økonomisk byrde på verdensplan, men på grund af den alvorlige mangel på donororganer er der få andre behandlingsmuligheder end nyretransplantation. En løsning er at udvikle regenerative medicinstrategier ved hjælp af humane pluripotente stamceller (hPSC'er), såsom embryonale stamceller (hESC'er) og inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er). Da hPSC'er har potentialet til at formere sig på ubestemt tid og differentiere til enhver celletype, inklusive nyreceller, forventes de at tjene som en kilde til celler til regenerativ medicin, såsom nyrekonstruktion og celleterapi. Derudover kan sygdomsspecifikke hPSC'er med genetisk modtagelighed for at forårsage specifikke sygdomme bruges til at udvikle patologiske analyser og lægemiddelopdagelsesmodeller, hvor beskadigede celletyper differentieret fra hPSC'er replikerer sygdomsfænotyper in vitro. I denne artikel opsummerer jeg de seneste fremskridt inden for udviklingsbiologi-baseret nyregenereringsforskning og beskriver fremtidige udsigter for regenerativ medicin og sygdomsmodellering ved nyresygdom.

Klik her for at købeCistanche tubulosa ekstrakt

Nyre udvikling

Nyren er afledt af den tidlige embryonale blastoderm, den mellemliggende mesoderm (IM) (figur 1a). Hos hvirveldyr giver IM tre nyrer i rækkefølge, de primære, mellemliggende og posteriore nyrer (figur 1b). Den midterste nyre er den voksne nyre hos fisk og padder, og den bagerste nyre er den voksne nyre hos krybdyr, fugle og pattedyr. Selvom disse tre nyrer ligner hinanden, fordi de består af nefroner, som er de funktionelle enheder i nyren, har de forskellige antal nefroner. Den voksne pattedyrs nyre post-nephron er sammensat af to embryonale væv, det post-nephric mesenchyme (MM) og den ureterale knopp (UB; figur 1 c). MM danner nefron og mesenchym i den voksne nyre, og UB differentierer for at danne de nedre urinveje fra opsamlingskanalen til en del af blæren.

Figur 1: Styret differentiering af celler i nyreafstamning. ac Skematiske tegninger, der viser mesoderm specifikation (a), dannelsen af ​​tre nyrer (b) metanephros udvikling (c). IM: mellemliggende mesoderm; MM: metanephrisk mesenchym; UB: ureterisk knop.

Ved at generere et nyt klonogent assay demonstrerede vi for første gang, at MM indeholder multipotente progenitorceller, der kan differentiere til de flere epitelcelletyper, der udgør nefronet, såsom glomerulære fodceller og tubulære epitelceller. Senere afslørede genealogiske sporingseksperimenter, at disse progenitorceller er mærket af transkriptionsfaktoren Six2. Disse progenitorceller omtales nu som nyremetaboliske progenitorceller (NPC). Taguchi et al. påvist, at IM er opdelt i anteriore og posteriore domæner, hvilket giver anledning til henholdsvis UB og MM. baseret på disse fund i nyreudviklingen, er der blevet iværksat bestræbelser på at regenerere renale genealogiske celler fra hPSC'er.

Direkte differentiering af hPSC'er til nyrelinjer

Som en foreløbig foranstaltning til at differentiere hiPSC'er direkte til nyrelinjer ved at efterligne nyreudvikling, fokuserede vores gruppe på generering af IM-celler og genererede reporter-hiPSC-linjer med OSR1-genet, en specifik markør for IM, ved genredigering. Ved hjælp af et kvantitativt vurderingssystem og reporter hiPSC-linjer udviklede vi et effektivt differentieringsskema til at inducere hiPSC'er i IM-celler, der udtrykker osr1. Disse inducerede IM-celler viste udviklingspotentiale for yderligere differentiering til voksne nyrecelletyper, såsom glomerulære podocytter og tubulære celler, og dannede tredimensionelle (3D) rørformede strukturer ved co-kultur med muse bageste nyreceller.

Cistanche ekstrakt fordele

Taguchi et al. udviklede den første metode til selektiv differentiering af muse-ESC'er (mESC'er) og hiPSC'er via posterior IM for at inducere NPC'er og genererede nyreenhedslignende organer indeholdende glomeruli og tubuli fra inducerede NPC'er in vitro. Takasato et al. rapporterede dannelsen af ​​nyrelignende organer indeholdende flere nyrecelletyper, såsom glomeruli, tubuli, opsamlingskanaler, interstitielle celler og vaskulære celler. Ved at udvikle et 2D-kultursystem har Morizane et al. effektivt genereret NPC fra hiPSC'er og derefter genereret nyremetaboliske organoider fra NPC. For nylig udviklede vores gruppe en trinvis differentieringsmetode, der effektivt inducerer hiPSC'er til NPC med differentieringspotentiale til at danne nyreenhedslignende organer (figur 2 d, e). Vores differentieringsmetode består af seks trin og opsummerer bedre den naturlige udviklingsproces af NPC end metoderne rapporteret af Takasato et al. og Morizane et al. og genererer NPC i 2D-differentieringsformat mere effektivt end metoden, der anvender 3D-kultur af Taguchi et al.

Med hensyn til den rettede differentiering af UB-afstamning, differentierede Taguchi og Nishinakamura mESC'er og hiPSC'er til UB-lignende strukturer gennem de forreste IM og renale tubuli (ND). Imidlertid blev ND-epitelceller induceret med lav effektivitet, og efterfølgende analyse krævede oprensning af ND-celler ved flowcytometri. Vi udviklede en mere effektiv 2D-differentieringsmetode, der genererer ND-epitelceller fra hiPSC'er ved præ-IM og inkluderer et efterfølgende differentieringstrin uden oprensning (figur 2 f, g). I 3D-kultur dannede inducerede ND-celler UB-lignende strukturer med RET(plus)-spidser og CK8(plus)-stammestrukturelle domæner. Imidlertid viste de genererede UB-lignende strukturer fra begge grupper begrænset forgreningspotentiale.

Figur 2: d: Immunfarvning af hiPSC-afledte nefron-progenitorceller (NPC'er) for OSR1, SIX2 og HOXD11.e: Immunfarvning af et nefronorganoid dannet fra hiPSC-afledte NPC'er efter 10 dages luft-væske-grænsefladekultur. PODXL: Podocalyxin (podocytmarkør; hvid); LTL: Lotus tetragonolobus lectin (proksimal tubulimarkør; rød); CDH1: CADHERIN 1 (distal tubulimarkør; grøn).f, g: Immunfarvning af anteriore IM-celler for OSR1 (grøn) og GATA3 (rød; f) og et nefrisk kanalcelleaggregat for E-CADHERIN (grøn), GATA3 (rød) og kerner (blå; g).h: Morfologisk ændring under rekonstruktionen af ​​forgrenede iUB-organoider i 7 dage.

For nylig, ved at ændre vores UB-differentieringsmetode, har vi med succes genereret inducerede UB (iUB)-lignende organer med epitelpolaritet, tubulær lumen og gentagen forgreningsmorfogenese (Figur 2,3 hj). Desuden inducerede vi med succes differentieringen af ​​disse iUB-lignende organer til deres in vivo-modstykker ved at indsamle kanallignende organer i menneskelige embryoner ved 7. svangerskabsuge (figur 3k).

Figur 3:i: Immunfarvning af en iUB-organoid for RET (grøn), CK8 (rød) og PAX2 (blå).j Toluidinblå farvning af en iUB-organoid, der viser rørformede lumen.k: Bright-field (venstre) og immunfarvningsbilleder (midten og højre) af samlende kanallignende rørformede strukturer afledt af en iUB organoid for FOXA1 (hvid), AQP2 (rød) og GATA3 (grøn). Skala barer, 100 μm. (d) og (e) er tilpasset fra Tsujimoto et al. [12], (f) og (g)-(k) er tilpasset fra Mae et al. henholdsvis

Udvidelse af nyreforfædre

For at tilvejebringe et stort antal nyreceller til grundlæggende og klinisk forskning, blev metoder til in vitro ekspansion af embryonale nyre-stamceller i kultur undersøgt. Brown et al. og Tanigawa et al. rapporteret in vitro-udvidelse af NPC i museembryoner. NPC fra muse- og humane embryoner blev ekspanderet og opretholdt in vitro i henholdsvis 17 og 7 måneder under anvendelse af 3D-celleaggregeringskultur af Li et al. Gruppen brugte også den samme metode til at udvide NPC differentieret fra hiPSC'er in vitro i 2 måneder. Selvom alle tre metoder bruger knoglemorfogenetisk protein (BMP), forbliver BMP7's rolle i udvidelsen af ​​NPC'er ukendt. Gennem forbindelsesscreening identificerede vi en JAK3-hæmmer, TCS21311, som et alternativ til BMP7 i bb0-ekspansionskulturen udviklet af Li et al. og afslørede den hæmmende effekt af BMP7 på nasopharyngeal carcinomudvidelse i JAK3- stat3-signalvejen. Derudover forbedrede tilføjelsen af ​​TCS21311 til ekspansionskulturen spredningshastigheden af ​​museembryoner og hiPSC-afledt NPC.

For nylig udviklede vi en ekspansionskultur af hiPSC-afledte UB-celler, hvor enkelte celler isoleret fra iUB-lignende organer prolifererede for at danne kolonier, der udtrykker UB-spidsmarkører. Disse spidskolonier kan rekonstituere iUB-lignende organer i et gentaget forgreningspotentiale, og denne rekonstitutionsproces kan gentages mindst tre gange.

standardiseret Cistanche

Nyrekonstruktion

Tidligt arbejde med at rekonstruere nyrestrukturer brugte den formodede amfibie befrugtede æg ektodermale region, kaldet dyrehætten, som er en pluripotent cellemasse (figur 4a). Moriya et al. rapporterede, at en kombination af activin A og retinsyre (RA) behandling inducerede differentieringen af ​​dyrehætten til prorenale tubuli in vitro. Brennan et al. inducerede også prorenale angiospermer i exosomer. Vi demonstrerede, at de inducerede exosomer indeholder prærenale tubuli og kan regenerere prærenalt væv fra amfibie pluripotente celler in vitro (figur 4 bd). Selvom in vitro regenereringssystem af præ-renal ikke direkte kan oversættes til kliniske undersøgelser, kan det tjene som et enkelt og nyttigt system til at studere nyreudvikling.

Figur 4: Rekonstruktion af nyrestrukturer. a: Et skema, der viser genereringen af ​​pronephros-strukturer fra dyrehætten på Xenopus-embryoner. b–d: Hele mount (b) og sektion dobbelt immunfarvning billeder (c, d): af fase 42 ækvivalent Xenopus eksplantat (b, c) og en fase 40 larver (d) ved hjælp af et pronephric tubuli-specifikt antistof (3G8, rød) ) og et pronephrisk kanalspecifikt antistof (4A6, blå).

I modsætning til generering af nyreenhedslignende organer fra mESC- og hPSC-afledt NPC og indsamling af kanallignende organer fra hPSC-afledte UB-celler, har Taguchi et al. genererede musenyrelignende organer ved at kombinere mESC-afledte NPC og UB'er og mesenkymale progenitorceller fjernet fra museembryoner, som indeholder glomeruli, tubuli og opsamlingskanaler, som beskrevet ovenfor. Vi genererede humane nyrelignende organer in vitro ved co-kultur af henholdsvis NPC- og UB-celler induceret af hiPSC'er, hvor NPC-afledte glomeruli og tubuli og UB-afledte opsamlingskanaler var indbyrdes forbundet (figur 5 e, f). Når de blev transplanteret ind i det subepitheliale rum af immundefekte mus, integrerede disse hiPSCs-afledte nyrelignende organer med værtsmusenes vaskulatur (Figur 5 gi).

Figur 5:e: Et skema, der viser in vitro-rekonstruktionen af ​​nyrestrukturer fra hiPSC'er. f: Tredobbelt immunfarvning af dag 20 nyreorganoider for markører for podocytter (PODXL), proksimale tubuli (LTL) og distale tubuli og opsamlingskanaler (CDH1; venstre), og for PODXL og markører for distale tubuli og opsamlingskanaler (AVPR2) og opsamling kun kanaler (CALB1; højre). Bemærk, at svage CDH1-signaler også blev fundet i dele af LTL plus proksimale tubuli i venstre panel. g: Et skematisk billede, der viser in vivo-rekonstruktionen af ​​nyrestrukturer fra hiPSC'er. h: Et billede med lavere forstørrelse, der viser hele værtsnyren og hiPSC-afledt nyretransplantat (grøn) efter administration af rhodamin B-konjugeret dextran gennem værtsmusens halevene. i: Et intravitalt multifotonmikroskopisk billede efter haleveneinjektion af rhodamin B-konjugeret dextran, der viser karlumenerne fra værtsmus trænge ind i den hiPSC-afledte glomerulus-lignende struktur (grøn). Skala søjler, 100 μm i (b)-(d) og (f), 500 μm i (h) og 40 μm i (i). (b)–(d) og (e)–(i) er tilpasset fra Osafune et al. og Tsujimoto et al., henholdsvis

Til transplantation af nyreorganer med urinveje blev metoder, der anvender forsøgsdyrskroppe, såsom interspecies blastocystkomplementering og organøkotonmetoder, undersøgt. Goto et al. injiceret vildtype-mESC'er i blastocyster af anæmiske Sall1(-/-) rotter og med succes genererede musenyrer i værtsrotterne. Fujimoto et al. udviklet en celletransplantationsmetode, hvori hiPSC-afledte NPC'er blev transplanteret ind i den udviklende nyreregion (dvs. organøkotone) af muse uterine embryoner, og de transplanterede NPC'er co-formede kimærisk cap mesenchym med værts NPC'er knyttet til værtsmus UB. Selvom mm-afledte glomeruli og tubuli blev afledt af injicerede PSC'er eller NPC'er, blev de resterende nyrebestanddele celletyper, såsom UB-afledte opsamlingskanaler og inferior urethrale og vaskulære celler, afledt fra værtsdyret i begge strategier.

Urte Cistanche

REFERENCER

1. GBD Kronisk Nyresygdom Samarbejde. Global, regional og national byrde af kronisk nyresygdom, 1990-2017: en systematisk analyse til Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 2020;395(10225):709-33.

2. Karagiannis P, Takahashi K, Saito M, Yoshida Y, Okita K, Watanabe A, Inoue H, Yamashita JK, Todani M, Nakagawa M, Osawa M, Yashiro Y, Yamanaka S, Osafune K. Inducerede pluripotente stamceller og deres brug i menneskelige modeller for sygdom og udvikling. Physiol Rev. 2019;99(1):79–114.

3. Saxen L. Organogenese af nyren. Cambridge: Cambridge University Press; 1987.

4. Osafune K, Takahata M, Kispert A, Asashima M, Nishinakamura R. Identifikation af multipotente stamceller i den embryonale musenyre ved et nyt kolonidannende assay. Udvikling. 2006;133(1):151-61.

5. Kobayashi A, Valerius MT, Mugford JW, Carroll TJ, Self M, Oliver G, McMahon AP. Six2 definerer og regulerer en multipotent selvfornyende nefron-progenitor-population gennem pattedyrs nyreudvikling. Celle stamcelle. 2008;3(2):169-81.

6. Taguchi A, Kaku Y, Ohmori T, Sharmin S, Ogawa M, Sasaki H, Nishinakamura R. Omdefinering af in vivo-oprindelsen af ​​metanephric nefron-stamceller muliggør generering af komplekse nyrestrukturer fra pluripotente stamceller. Celle stamcelle. 2014;14(1):53–67.

7. Mugford JW, Sipilä P, McMahon JA, McMahon AP. Osr1-ekspression afgrænser en multi-potent population af intermediær mesoderm, der gennemgår progressiv begrænsning til et Osr1-afhængigt nefron-stamfaderrum i pattedyrets nyre. Dev Biol. 2008;324(1):88–98.

8. Mae S, Shono A, Shiota F, Yasuno T, Kajiwara M, Gotoda Nishimura N, Arai S, Sato-Otubo A, Toyoda T, Takahashi K, Nakayama N, Cowan CA, Aoi T, Ogawa S, McMahon AP, Yamanaka S, Osafune K. Overvågning og robust induktion af nefrogen mellemliggende mesoderm fra humane pluripotente stamceller. Nat Commun. 2013;4:1367.

9. Araoka T, Mae S, Kurose Y, Uesugi M, Ohta A, Yamanaka S, Osafune K. Effektiv og hurtig induktion af humane iPSC'er/ESC'er i nefrogen mellemliggende mesoderm ved hjælp af små molekyle-baserede differentieringsmetoder. PLoS ONE. 2014;9(1):e84881.

10. Takasato M, Er PX, Chiu HS, Maier B, Baillie GJ, Ferguson C, Parton RG, Wolvetang EJ, Roost MS, de Sousa C, Lopes SM, Little MH. Nyreorganoider fra humane iPS-celler indeholder flere afstamninger og modellerer human nefrogenese. Natur. 2015;526(7574):564–8.

11. Morizane R, Lam AQ, Freedman BS, Kishi S, Valeius MT, Bonventre JV. Nephron-organoider afledt af humane pluripotente stamceller modellerer nyreudvikling og -skade. Nat Biotechnol. 2015;33(11):1193-200.

12. Tsujimoto H, Kasahara T, Sueta S, Araoka T, Sakamoto S, Okada C, Mae SI, Nakajima T, Okamoto N, Taura D, Nasu M, Shimizu T, Ryosaka M, Li Z, Sone M, Ikeya M, Watanabe A, Osafune K. Et modulært differentieringssystem kortlægger flere humane nyrelinjer fra pluripotente stamceller. Cell Rep. 2020;31(1):107476.

13. Taguchi A, Nishinakamura R. Højere-ordens nyreorganogenese fra pluripotente stamceller. Celle stamcelle. 2017;21(6):730-46. e6.

14. Mae SI, Ryosaka M, Toyoda T, Matsuse K, Oshima Y, Tsujimoto H, Okumura S, Shibasaki A, Osafune K. Generering af forgrenede ureteriske knopper fra humane pluripotente stamceller. Biochem Biophys Res Commun. 2018;495(1):954–61.

15. Mae SI, Ryosaka M, Sakamoto S, Matsuse K, Nozaki A, Igami M, Kabai R, Watanabe A, Osafune K. Udvidelse af humane iPSC-afledte ureteriske knopperorganoider med gentaget forgreningspotentiale. Cell Rep. 2020;32(4):107963.

16. Brown AC, Muthukrishnan SD, Oxburgh L. En syntetisk niche for nefron-stamceller. Dev Cell. 2015;34(2):229–41.

17. Tanigawa S, Taguchi A, Sharma N, Perantoni AO, Nishinakamura R. Selektiv in vitro-formering af nefron-progenitorer afledt af embryoner og pluripotente stamceller. Cell Rep. 2016;15(4):801-13.

18. Li Z, Araoka T, Wu J, Liao H, Li M, Lazo M, Zhou B, Sui Y, Wu MZ, Tamura I, Xia Y, Beyret E, Matsusaka T, Pastan I, Rodriguez Esteban C, Guillen I , Guillen P, Campistol JM, Izpisua Belmonte JC. 3D-kultur understøtter den langsigtede udvidelse af mus og humane nefrogene stamceller. Celle stamcelle. 2016;19(4):516–29.

19. Tsujimoto H, Araoka T, Nishi Y, Ohta A, Nakahata T, Osafune K. Lille molekyle TCS21311 kan erstatte BMP7 og lette celleproliferation in vitro ekspansionskultur af nefronstamceller. Biochem Biophys Res Commun. 2020.

20. Moriya N, Uchiyama H, Asashima M. Induktion af pronephric tubuli ved activin og retinsyre i formodet ectoderm af Xenopus laevis. Dev Growth Forskel. 1993;35:123-8.

21. Brennan HC, Nijjar S, Jones EA. Specifikationen og vækstfaktorinducerbarheden af ​​den pronephric glomus i Xenopus laevis. Udvikling. 1999;126(24):5847-56.

22. Osafune K, Nishinakamura R, Komazaki S, Asashima M. In vitro-induktion af pronephric-kanalen i Xenopus-eksplantater. Dev Growth Forskel. 2002;44(2):161-7.

23. Goto T, Hara H, Sanbo M, Masaki H, Sato H, Yamaguchi T, Hochi S, Kobayashi T, Nakauchi H, Hirabayashi M. Generering af pluripotente stamcelle-afledte musenyrer i Sall1-målrettet anefri rotter. Nat Commun. 2019;10(1):451.

24. Fujimoto T, Yamanaka S, Tajiri S, Takamura T, Saito Y, Matsumoto N, Matsumoto K, Tachibana T, Okano HJ, Yokoo T. Generering af humane nyrevesikler i museorganniche ved hjælp af nefronstamcelleudskiftningssystem. Cell Rep. 2020;32(11):108130.