Abstrakt

D-serin, der kun findes i spormængder hos mennesker, betragtes nu som en biomarkør for kronisk nyresygdom (CKD). den primære nyresygdom ved CKD er heterogen, og dens diagnose kræver en nyrebiopsi. I denne undersøgelse undersøgte vi, om in vivo-dynamikken af ​​D-serin (som angivet ved dets blod- og urinniveauer) afspejler oprindelsen af ​​nyresygdom. Nyrebiopsier blev udført på patienter med seks nyresygdomme i samme center. Niveauerne af D-serin og L-serin blev bestemt ved todimensionel højtydende væskekromatografi. Forbindelsen mellem oprindelsen af ​​nyresygdom og in vivo-dynamikken af ​​d-serin blev undersøgt ved hjælp af multivariat klyngeanalyse. I modsætning til ikke-CKD-patienter var D-serin-dynamikken bredt udbredt i CKD-patienter. Plasma D-serin niveauer spiller en nøglerolle i påvisningen af ​​nyresygdom, mens kombinationen af ​​plasma og urin D-serin niveauer kan skelne oprindelsen af ​​CKD, især i lupus nefritis. in vivo-dynamikken af ​​D-serin er vigtig for at forudsige udviklingen af ​​nyresygdom. Monitorering af D-serin kan vejlede den specifikke behandling af årsagen til nyresygdom.

Nøgleord:D-Serine ;Nyrebiopsi ; Diagnose ;Lupus nefritis; Kronisk nyresygdom; Biomarkør;Cistanche tubulosa

Klik her for at fåhvilke fordele Cistanche-ekstrakt har for nyrerne

Introduktion

Kronisk nyresygdom (CKD) er et globalt problem med over 10 millioner patienter i Japan og 850 millioner på verdensplan. CKD defineres ofte som en kronisk abnormitet i nyrernes struktur eller funktion, herunder glomerulær filtrationshastighed (GFR), og er af heterogen oprindelse. Oprindelsen af ​​CKD omfatter immun, diabetiker, ældningsrelateret, sjælden refraktær og af ukendt ætiologi. Prognosen og behandlingen af ​​CKD varierer afhængigt af oprindelsen varierer, og patologisk undersøgelse af nyrebiopsiprøver giver ofte nøgleoplysninger til diagnosticering og vurdering af sygdomsaktivitet. Selvom nyrebiopsi er en vigtig procedure, er den forbundet med risici og udføres kun, når dens fordele opvejer risiciene. Derfor er biomarkører, der kan hjælpe med at diagnosticere nyresygdom, under undersøgelse.

D-serin dukker nu op som en biomarkør for nyresygdom. d-serin er en af ​​d-aminosyrerne, spejlenantiomeren (chiral) af serin, som i modsætning til den rigelige mængde l-serin kun er til stede i spormængder i naturen. For nøjagtigt at måle mængden af ​​d-serin i humane prøver blev der brugt et todimensionelt højtydende væskekromatografi (2D-HPLC) system. 2D-HPLC-systemet forbedrer den nøjagtige måling af spormængder af d-serin i humant blod. Niveauet af D-serin i blodet giver kritisk klinisk information, fordi det korrelerer med GFR, en af ​​nyrefunktionerne, og afspejler også nyreprognosen for CKD-patienter. Derudover giver urinudskillelse af D-serin yderligere information til påvisning af nyresygdom. Derfor er vurdering af in vivo-kinetikken af ​​D-serin ved at måle niveauet af D-serin i blod- og urinudskillelse nyttig til overvågning af nyrefunktion og sygdoms levedygtighed.

Disse fakta rejser hypotesen om, hvorvidt nyresygdomme kan påvirke denne dynamik forskelligt afhængigt af deres oprindelse. Hvis det er tilfældet, kan overvågning af dynamikken af ​​D-serin in vivo være nyttig til at diagnosticere oprindelsen af ​​CKD. Denne undersøgelse evaluerede d-serin-dynamikken hos CKD-patienter, der gennemgår nyrebiopsi, og undersøgte potentialet af D-serin til at bestemme oprindelsen af ​​nyresygdom.

Cistanche tubulosa ekstrakt

Materialer og metoder

Studiepopulation

Vi rekrutterede prospektivt på hinanden følgende patienter, som gennemgik deres første nyrebiopsi til diagnostiske og/eller terapeutiske formål på Department of Kidney Diseases and Hypertension, Osaka General Medical Center fra 2006 til 2016. Biopsiprøver blev rutinemæssigt analyseret ved hjælp af lys, immunfluorescens og elektronmikroskopi. Kliniske og patologiske diagnoser blev etableret ved konsensus blandt erfarne nefrologer og patologer. Vi udtog almindelige årsager til nyresygdom ved at henvise til det histologiske klassifikationsskema for glomerulære sygdomme offentliggjort af Verdenssundhedsorganisationen i 1995. Oprindelsen af ​​nyresygdomme omfatter IgA nefritis (IgAN), mikroskopisk forandringssygdom (MCD), membranøs nefropati (MN) , diabetisk nefropati (DN), hypertensiv nefropati (HT) og lupus nefritis (LN). Ti patienter fra undersøgelseskohorten blev inkluderet i denne undersøgelse for hver nyresygdomsoprindelse. Inklusionskriterierne for hver sygdom var som følger: IgAN, urinproteinområde 0.5 - 1,5 g/gCre og eGFR >60 mL/min/1,73 m2; MCD, MN, opfylder kriterierne for nefrotisk syndrom; DN, historie med diabetes mellitus, urin albumin/kreatinin-forhold 30 mg/gCre, eGFR 30ml/min/1,73 m2; HN, hypertensionshistorie, eGFR > 30 mL/min/1,73 m2. eGFR> 60; LN, der opfylder 2003 International Society of Nephrology (ISN) / Renal Pathology Society (RPS) klassifikationskriterier for SLE. Eksklusionskriterier omfattede (i) tilfælde, hvor prednisolon og/eller immunsuppressive lægemidler var blevet påbegyndt, (ii) tilfælde, hvor nyrebiopsi viste mindre end 10 glomeruli, (iii) tilfælde af akut nyreskade (AKI) og (iv) tilfælde af sekundær MN. Klinisk demografi, laboratoriedata, SLE-sygdomsaktivitetsindeks på tidspunktet for LN (SLE-dai) og plasma- og urinprøver blev indsamlet på tidspunktet for nyrebiopsi. Plasma og urin d-serin niveauer blev målt før nyrebiopsi. Referencedata for ikke-CKD blev hentet fra en tidligere rapport. Studieprotokollen blev godkendt af den etiske komité for Osaka General Medical Center (#29- S0606) og NIBIOHN (#236). Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med de etiske principper i Helsinki-erklæringen, og alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke.

standardiseret Cistanche

GFR-ligninger og beregning af nyreclearance

Estimeret GFR (eGFR) blev beregnet ved hjælp af den japanske GFR-ligning baseret på serumkreatinin (eGFRcreat):

eGFRcreat(mL∕min∕1,73 m2)= 194 × Cr−1.094× alder−0,287× 0,739 (hvis kvinde)

Serum og urin kreatinin blev bestemt enzymatisk. Urinernes fikspunktsniveauer af chirale aminosyrer blev justeret med kreatinin. Udskillelsesfraktionen (FE, procent) blev beregnet ved at dividere substratclearancen med kreatininclearance som følger:

Hvor Us og Ps repræsenterer henholdsvis urin- og plasmasubstratniveauer. FE er forholdet mellem substrat, der udskilles i urinen efter glomerulær filtration. FE lav og høj angiver henholdsvis tubulær reabsorption og udskillelse.

Prøveforberedelse

Prøvepræparation fra humant plasma og urin blev udført og modificeret som beskrevet tidligere. Tyve gange volumenet af methanol blev tilsat til prøven, og det (10 μL af supernatanten opnået fra methanolhomogenatet) blev anbragt i et skraveret brunt rør til NBD-derivatisering (1,0 μL af plasma blev brugt til reaktionen). Efter tørring under reduceret tryk, 20 μL 200 mM natriumboratbuffer (pH 8,0) og 5 μL fluorescerende mærkningsreagens [40 mM 4-fuoro-7-nitro-2 ,1,3-benzoxadiazol (nnd -f) i vandfrit MeCN] blev tilsat og opvarmet ved 60 grader i 2 min. 2 μL af reaktionsblandingen blev taget ved at tilsætte 0,1 procent (v/v) vandig TFA-opløsning (75 μL) til 2D-HPLC.

Bestemmelse af serin-enantiomerer ved 2D-HPLC

Enantiomererne af serin blev kvantificeret under anvendelse af en 2D-HPLC-platform. Kort fortalt blev NBD-derivaterne af aminosyrer underkastet omvendt-fase-kromatografi (Singularity RP-søjle, 1.0 mm id × 50 mm; KAGAMI Inc., Osaka, Japan) under anvendelse af en vandig mobil fase indeholdende MeCN og myresyre syre til gradienteluering. Til den separate bestemmelse af d-serin og l-serin blev serinfraktionen automatisk opsamlet ved hjælp af en multi-loop ventil og overført til en p-anti-selektiv kolonne (Singularity CSP-001S, 1,5 mm id × 75) mm; KAGAMI Inc.). D-serinen og l-serinen blev derefter adskilt på en todimensionel basis under anvendelse af en enantioselektiv søjle. Den mobile fase var en MeOH-MeCN-blanding indeholdende myresyre, og NBD-aminosyrerne blev påvist fluorescerende med to fotomultiplikatorrør under 530 nm excitation. Måltoppen blev kvantificeret ved at skalere standardtopformen.

Cistanche tillæg

Databehandling og multivariat analyse

Data blev centreret om medianen og log-transformeret til multivariat analyse. Ikke-overvåget principal komponentanalyse (PCA) eller overvåget ortogonal partiel mindste kvadraters analyse (OPLS) blev brugt til at analysere forholdet mellem chirale aminosyrer og kliniske parametre. Hovedkomponentanalyse projicerer geometrisk komplekse højdimensionelle data på lavdimensionelle data kaldet principalkomponenter. Loading plots visualiserer graden af ​​indflydelse af hver variabel på hovedkomponenten, såvel som korrelationen mellem hver variabel. Scoreværdien for hver observation er plottet på scoreplottet for at demonstrere klyngingen af ​​observationer. OPLS-DA-metoden blev anvendt til at teste den diskriminerbare fordeling af variablerne baseret på prædiktorvariablerne. OPLS-modellernes ft-optimalitet blev vurderet ved hjælp af R²Y og Q²Y-værdier. R²Y angiver variansprocenten i de undersøgte variabler forklaret af modellen, mens Q²Y angiver modellens prædiktive ydeevne. R²Y og Q²Y større end 0.5 indikerer god fodoptimalitet, og der blev udført mere end 20 erstatningsforsøg for hver OPLS-model for at validere modellen internt. I udviklingen af ​​LN-modellen valgte vi en uforanderlig faktor, køn, og fjernede den fra korrelationsanalysen.

Diskussion

I denne undersøgelse demonstrerer vi nytten af ​​d-serin-overvågning til diagnosticering af oprindelsen af ​​nyresygdom. d-serin dynamik in vivo afhænger af de forskellige oprindelser af nyresygdom og har potentiale til at differentiere oprindelsen af ​​nyresygdom. Resultaterne af denne undersøgelse bidrager til den nøjagtige diagnose af oprindelsen af ​​nyresygdom og til den korrekte diagnose af tilfælde, der kræver nyrebiopsi. D-Serin differentiel ekspression i forskellige nyresygdomme har vigtige implikationer, fordi de kan bidrage til opdagelsen af ​​ny patofysiologi af nyresygdom.

Den aktuelle undersøgelse har flere begrænsninger, der skal erkendes for at kunne fortolke resultaterne. Det begrænsede antal patienter med hver sygdom, prognosen for disse patienter er ikke blevet undersøgt, og disse karakteristika kan tilsløre yderligere forhold mellem d-serin og nyresygdom. På grund af det begrænsede antal deltagere er undergruppeanalyse nødvendig for sygdomme med et bredt spektrum af sygdom, såsom IgAN og DN. Selv med disse begrænsninger identificerer denne undersøgelse klart oprindelsen af ​​nyresygdom, og patienter vil have gavn af at overvåge d-serin til diagnose.

Sammenfattende er vurdering af in vivo-dynamikken af ​​d-serin nyttig til diagnosticering af primær nyresygdom. Monitorering af d-serin kan vejlede specifik behandling af nyresygdom, især af LN-oprindelse. Denne undersøgelse åbner en ny retning for præcisionsmedicin ved hjælp af d-serin-målinger.

REFERENCER

1. Imai E, Horio M, Iseki K, Yamagata K, Watanabe T, Hara S, et al. Forekomsten af ​​kronisk nyresygdom (CKD) i den generelle japanske befolkning forudsiges af MDRD-ligningen modificeret af en japansk koefficient. Clin Exp Nephrol. 2007;11:156-63.

2. International Society of Nephrology. Den underanerkendte epidemi: På verdensplan lider over 850 millioner mennesker af nyresygdomme. 2018.

3. Levey AS, Atkins R, Coresh J, Cohen EP, Collins AJ, Eckardt KU, et al. Kronisk nyresygdom som et globalt folkesundhedsproblem: tilgange og initiativer - en holdningserklæring fra Kidney Disease Improving Global Outcomes. Nyre Int. 2007;72:247-59.

4. Hogan JJ, Mocanu M, Berns JS. Den indfødte nyrebiopsi: opdatering og bevis for bedste praksis. Clin J Am Soc Nephrol. 2016;11:354–62.

5. Srivastava A, Palsson R, Kaze AD, Chen ME, Palacios P, Sab bisetti V, et al. Den prognostiske værdi af histopatologiske læsioner i indfødte nyrebiopsiprøver: resultater fra Boston nyrebiopsi-kohorteundersøgelsen. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2213–24.

6. Kimura T, Hamase K, Miyoshi Y, Yamamoto R, Yasuda K, Mita M, et al. Chiral aminosyremetabolomik til ny biomarkørscreening i prognosen for kronisk nyresygdom. Sci Rep. 2016;6:26137.

7. Hesaka A, Sakai S, Hamase K, Ikeda T, Matsui R, Mita M, et al. d-Serine afspejler nyrefunktion og sygdomme. Sci Rep. 2019;9:5104.

8. Hesaka A, Yasuda K, Sakai S, Yonishi H, Namba-Hamano T, Takahashi A, et al. Dynamikken af ​​d-serin afspejlede genopretningsforløbet for en patient med hurtigt fremadskridende glomerulonefritis. CEN Case Rep. 2019;8:297–300.

9. Kimura T, Hesaka A, Isaka Y. d-Aminosyrer og nyresygdomme. Clin Exp Nephrol. 2020;24:404–10.

10. Krebs HA. Metabolisme af aminosyrer: deaminering af aminosyrer. Biochem J. 1935;29:1620-44.

11. Hashimoto A, Nishikawa T, Hayashi T, Fujii N, Harada K, Oka T, et al. Tilstedeværelsen af ​​fri d-serin i rottehjerne. FEBS Lett. 1992;296:33-6.

12. Miyoshi Y, Hamase K, Tojo Y, Mita M, Konno R, Zaitsu K. Bestemmelse af d-serin og d-alanin i væv og fysiologiske væsker hos mus med forskellige d-aminosyreoxidaseaktiviteter ved hjælp af todimensionelle højtydende væskekromatografi med fluorescensdetektion. J Chromatogr B. 2009;877:2506-12.

13. Hamase K, Miyoshi Y, Ueno K, Han H, Hirano J, Morikawa A, et al. Samtidig bestemmelse af hydrofile aminosyreenantiomerer i pattedyrsvæv og fysiologiske væsker ved anvendelse af et fuldt automatiseret mikro-todimensionalt højtydende væskekromatografisk koncept. J Chromatogr A. 2010;1217:1056-62.

14. Kimura T, Hesaka A, Isaka Y. Nytte af d-serin-overvågning ved nyresygdom. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2020;1868:140449.

15. Weening JJ, D'Agati VD, Schwartz MM, Seshan SV, Alpers CE, Appel GB, et al. Klassificeringen af ​​glomerulonephritis i systemisk lupus erythematosus revideret. Nyre Int. 2004;65:521-30.

16. Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, Caron D, Chang CH. Afledning af SLEDAI. Et sygdomsaktivitetsindeks for lupuspatienter. Udvalget for Prognoseundersøgelser i SLE. Gigt Rheum. 1992;35:630-40.

17. Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K, Nitta K, et al. Reviderede ligninger for estimeret GFR fra serumkreatinin i Japan. Am J Nyre Dis. 2009;53:982-92.

18. Hamase K, Ikeda T, Ishii C, Ishigo S, Masuyama K, Akita T, et al. Bestemmelse af spormængder af chirale aminosyrer i komplicerede biologiske prøver ved hjælp af todimensionel højtydende væskekromatografi med en innovativ "formtilpasning" peak identifikation/kvantificeringsmetode. Kromatografi. 2018;39:147–52.