Del 1: Cistanoside af Cistanche Herba ameliater hypoxi-induceret mandlig reproduktiv skade via undertrykkelse af oxidativ stress
Mar 26, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, He Wang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Abstrakt:Stigende beviser viser, at hypoxi er en årsag til mandlig infertilitet, og hypoxi kan være relateret til oxidativ stress (OS). Cistanosid (Cis) er en phenylethanoid glycosidforbindelse, der kan ekstraheres fra Cistanches Herba og besidder forskellige biologiske funktioner. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge de beskyttende virkninger af Cis påreproduktiv skade induceret af hypoxi og udforske de specifikke underliggende mekanismer. Celle- og dyrehypoxi eksperimentelle modeller blev konstrueret, og de beskyttende virkninger af forskellige undertyper af Cis på det mandlige reproduktive system blev vurderet både in vitro og in vivo. Resultaterne viste, at hypoxi signifikant reducerede levedygtigheden af GC-1-celler gennem cellecyklusarrestop og apoptoseaktivering, som var forbundet med øget OS. Desuden viste Cis stærke antioxidative virkninger både in vitro og in vivo, hvilket signifikant genoprettede antioxidantenzymaktiviteter og nedregulerede reaktive iltarter (ROS) niveauer, samtidig med at cellelevedygtigheden øges og falder apoptose. Det er vigtigt, at Cis-undertyperne (Cis-A, Cis-B, Cis-C og Cis-H), der blev undersøgt heri, alle viste visse antioxidantvirkninger, blandt hvilke virkningerne af Cis-B var de mest signifikante. Denne undersøgelse viser, at Cis markant dæmper de skadelige virkninger af hypoxi-induceret OS ved at påvirke antioxidantenzymaktiviteter i testikler og GC-1 Celler.
Nøgleord: Cistanosid, hypobar hypoxi, mandlig infertilitet, oxidativ stress, reproduktiv beskyttelse
frisk cistanche plante
Indførelsen
I øjeblikket ca. 48,5 millioner (15%) par af reproduktiv alder over hele verden er ramt af infertilitet [1], blandt hvilke 40-50% af tilfældene tilskrives mandlig infertilitet [2], en tilstand, der er stærkt forbundet med miljø- og livsstilsfaktorer. Bevis antyder, at pattedyrets modtagelighed testiklerne til lavt ilttryk er en årsagsfaktor til nogle former for mandlig infertilitet [3]. Som påvist i tidligere undersøgelser svækkes spermatogenese og reduceres ved eksponering for hypobar hypoxi [4-7].
For at udforske den underliggende mekanisme, undersøgelser har vist, at eksponering for hypobar hypoxi øger produktionen af reaktive iltarter (ROS) [8, 9]. ROS spiller en vigtig rolle i mandligt reproduktionssystem. På lave niveauer er de er nødvendige for sædkaditansation, akrosomreaktionen og spermatozoer-oocytfusion [10]. Imidlertid kan overdreven ROS fremkalde sædceller nuklear / mitokondriel DNA-skade og plasmamembranperoxidativ skade, som i tur er vigtige etiologiske faktorer for den øgede risiko for mandlig infertilitet [11, 12]. Således akkumuleringen af hypoxi-induceret ROS kan være en årsag til mandlig infertilitet.
Cistanches Herba, en flerårig parasitisk lægeplante, er bredt udbredt i tørre områder [13] og anvendes bredt på grund af dets farmakologiske Aktiviteter [14-17]. Blandt alt det effektive indhold af Cistanches Herba har phg'er været betragtes som den vigtigste aktive komponent. Til dato er 34 phg'er blevet isoleret fraCistanches planter [13]. Cistanoside (Cis), en aktiv PhG isoleret fra Cistanches Herba, har fået opmærksomhed for sin antioxidant effekter.
I betragtning af antioxidantvirkningerne af Cis og ROS's rolle i hypoxi-induceret mandlig infertilitet, Cis betragtes som en potentiel lægemiddelkandidat til behandling af hypoxi-induceret mand infertilitet. Få rapporter har dog behandlet antioxidantvirkningerne af Cis ekstraheret fraCistanches Herba i behandlingen af hypoxi-induceret mandlig infertilitet eller de involverede signalveje. I denne undersøgelse blev in vitro- og in vivo-hypoxi-eksperimentelle modeller konstrueret og effektkomponenterne i forskellige Cis blev vurderet.
Cistanche har enreproduktiv produktionseffekt.
Materialer og metoder
Cellekultur og reagens
Musen spermatogonia cellelinje GC-1spg (GC-1) blev købt af den amerikanske type Kultursamling (ATCC) og dyrket i DMEM (Invitrogen, USA) suppleret med 10% foster kvægserum, 1% L-glutamin (100 mM), penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 μg/ ml) ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5 % CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) blev købt fra Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Kina).
Celle levedygtighed assay
Cellelevedygtighed blev testet ved celletælling kit-8assay (CCK-8). Kort fortalt blev GC-1-celler podet i plader med 96 brønde ved 1,5×103 pr. brønd og dyrket ved 37 °C i 24 timer. Derefter var cellerne behandlet med forskellige koncentrationer (20% 15%, 10%, 5%) ilt eller forskellige koncentrationer (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) af Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C, Cis-H) i den krævede tid. Derpå supernatanten blev kasseret, og cellelevedygtigheder blev påvist ved hjælp af et CCK-8-sæt (DojindoJapan). Absorbansen af hver brønd blev målt til 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser (BioRad USA). Endelig var cellelevedygtighederne beregnet efter følgende formel:
Cellelevedygtighed = (ODexperimental gruppe - ODblank gruppe)/ (ODcontrol gruppe - ODblank gruppe) × 100%.
Western blot analyse
Høstede celler eller væv blev homogeniseret i RIPA-buffer til ekstraktion af proteiner (RIPA BeyotimeKina; Cocktail Roche Schweiz). Supernatanter blev indsamlet, og koncentrationen af proteiner blev testet ved BCA-metoden (Beyotime). Ca. 40 μg af de ekstraherede proteiner fra hver prøve blev adskilt af SDS-PAGE og elektrooverført til nitrocellulose (NC) filtermembran (Beyotime Kina). NC filtermembraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk i 1,5 time og inkuberet med specifikke antistoffer (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1:1000, anti-GAPDH 1:1000; alle antistoffer blev købt fra Cell Signaling Technology, USA) natten over ved 4 ° C. Derefter alle NC-membraner blev inkuberet med det tilsvarende peberrodsperoxidasekonjugerede sekundære antistof i 1,5 time ved stuetemperatur og afbildet med et billedbehandlingssystem (Tannon, Kina).
cistanche ekstrakt pulver kosttilskud
Registrering af cellecyklus
Et flowcytometrisk assay (FCM) blev udført for at analysere cellecyklussen. Celler blev behandlet under forskellige betingelser i 72 timer og høstet. Cellerne blev derefter vasket med PBS, fikseret i 75% ethanol og farvet med propidium iodid (PI). For hver prøve blev 1×104 celler indsamlet og analyseret ved flowcytometri (FACSCalibur, BD Biosciences). Derefter andelen af G1/S/G2-faseceller og spredning indeks [Fase(S+G2)/Fase(G1+S+G2) × 100 %] var Beregnet.
Ki-67 farvning
Celler blev dyrket i en konfokal skål og behandlet med hypoxi eller forskellige undertyper af Cis i 72 timer. Efter at have fikseret alle celler med 4% paraformaldehyd blev de inkuberet med anti-Ki-67 anti-body (1:200, Cell Signaling Technology). Derpå alle cellerne blev inkuberet med et tilsvarende CY-3-konjugeret anti-kanin IgG-antistof (1:200, Boster, Kina) og DAPI-opløsning (1,0 μg/ml, Beyotime). Fluorescens blev observeret med et Fluoview FV1000 konfokalmikroskop (Olympus, Japan).
Påvisning af ROS
FCM blev introduceret for at måle intracellulær ROS-niveauer ved hjælp af DCFH-DA. Suspenderede celler blev sået i 6-brønds plader og udsat for forskellige behandlinger. Efter 72 timers behandling, celler blev suspenderet i serumfri DMEM med10 μM DCFH-DA (Beyotime). ROS-indholdet var derefter bestemt ved fluorescensaktiveret cellesortering på et Beckman Coulter Flow CytometrySystem med en excitationsbølgelængde på 488 nm og emissionsbølgelængde på 525 nm [18].
Bestemmelse af lipidperoxidation (LPO)
De thiobarbitursyre reaktive stoffer (TBARS) assay blev udført for at detektere LPO. Al driftstrin blev udført i overensstemmelse her med instruktionerne (Sigma USA). Koncentrationerne blev beregnet ved hjælp af en molær udryddelseskoefficient på 1,56×105/(M·cm), som var opnået ved anvendelse af malondialdehyd som standard. Resultaterne udtrykkes som nmol af MDA-ækvivalenter/mg protein.
Bestemmelse af enzymaktiviteter
Enzymaktiviteterne blev testet ved hjælp af analysesæt, herunder glutathionreduktase (GR), glutathionperoxidase (GPx) og superoxiddistmutase (SOD). Alle betjeningstrin blev udført i overensstemmelse med instruktionerne leveret (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institut Kina).
Dyr og forsøgsprotokol
Modne mandlige Wistar-rotter (180-220 g, 8 w gamle) blev opnået fra dyrecentret i Fjerde militære medicinske universitet, Xi'an, Kina. Tilladelse til brug af dyrene er indhentet fra universitetets etiske komité (Referencenummer: 20190506). Dyret Forsøget blev udført i henhold til universitetets retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr.
Alle rotter fik lov til at tilpasse sig i cirka en uge, inden forsøget begyndte. Efter akklimatisering var rotterne tilfældigt fordelt i 6 grupper med 5 dyr i hver gruppe. Rotterne i kontrolgruppen blev opdrættet under normalt tryk (PO2: 20%; lufttryk:101,3 kPa), mens rotterne i modellen og cistrede grupper blev hævet i et lavtryks iltkammer (indre tryk på 61,6 kPa, svarende til en højde på 4000 meter over havets overflade; PO2: 14,55%) for at simulere et hypoxisk miljø i høj højde. Alle rotter havde fri adgang til mad og vand i plastikbure ved 22 ± 2 °C og fugtighedsforhold med en automatisk 12-timers lys/mørk cyklus. Rotterne i modellen og Cis-behandlede grupper forblev under hypobariske tilstande, men blev overført til normobariske forhold hver 96. time, hvor tid mad og vand blev leveret til dem og burene rengjort. Varigheden af overgangen fra hypobarisk til hypobarisk var omtrent 2 t. Alle behandlingsgrupper blev behandlet med det tilsvarende Cis (8 mg/kg/d) via oral gavage i 8 uger, mens kontrol- og modelrotterne blev behandlet med et lige stort volumen af Vand.
Efter 8 uger blev rotter ofret under anæstesi. Testikler, epididymis og sædbærer blev adskilt og vejet, og orglet indekset blev beregnet i henhold til følgende formel: (vægten af organets/dyrets vægt) × 100%. Derefter sæd i epididymis blev indsamlet, og deres bevægelighed og akrosom enzymaktivitet blev testet. Tilsvarende blev testikelvæv indsamlet til histopatologisk undersøgelser og ROS, LPO og antioxidantenzym registrering af aktivitet.
Evaluering af levende sædhastighed
Epididymis blev skåret med kirurgisk saks, og sædsuspensionen blev fremstillet i normal saltvand. For at evaluere den levende sædhastighed blev 5 μL af sædsuspensionen omhyggeligt blandet med et lige stort volumen eosin-Y plet. Sædcellerne blev derefter talt under en lysmikroskop. Levende sædceller var vurderet ved at beregne begge farvede (døde sæd) og ufarvet sæd (levende sæd).
Cistanche tubulosa pulverøgerlevende sædceller.
For mere information, klik her.
Bestemmelse af sæd akrosomenzym aktivitet
Sæd akrosomenzymaktivitetsassay blev brugt til at evaluere sæd akrosom enzymer [19]. Resultaterne i hver gruppe var beregnet ved hjælp af følgende formel: Akrosomenzymaktivitet (μIU) = (ODExperiment gruppe - ODBlank gruppe)/(247.5×10) × 106.
Statistisk analyse
Alle kvantitative data udtrykkes som middelværdien ± SD og blev analyseret ved hjælp af SPSS 22.0-software. Independent Student's t-test blev brugt til sammenligne dataene mellem to grupper. *P< 0.05="" and="" **p="">< 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
