Abstrakt

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight, en værdifuld fødevare-medicinsk homolog urt fra Orobanchaceae-familien, dyrkes bredt i det sydlige Xinjiang i Kina. Dets vigtigste bioaktive phenylethanoid glycosid-bestanddele,echinacosideogakteosid (verbascosid), leverer flere farmakologiske aktiviteter, herunder antioxidation, anti-inflammation og immunregulering. Ustandardiserede traditionelle forarbejdningsprocedurer forårsager ofte betydelige tab af disse kerneaktive forbindelser, hvilket begrænser den medicinske og funktionelle fødevareanvendelse afCistanche tubulosaafkogsstykker. Denne forskning havde til formål at optimere moderne behandlingsparametre til ferskCistanche tubulosaskiver for at maksimere genvindingen af ​​acteosid og echinacosid og yderligere tydeliggøre den antioxidative stress og anti-inflammatoriske bioaktivitet samt den underliggende molekylære mekanisme for optimalt behandlede afkogsstykker på cellulært niveau.

Enkeltfaktoreksperimenter blev udført for at screene passende områder for skivetykkelse, dampningsvarighed og ovntørringstemperatur. En tre-faktor tre-niveau Box-Behnken respons-overflade-metode blev vedtaget for at etablere multi-faktor interaktionsmodeller ved at bruge acteosid og echinacoside indhold som dobbelte evalueringsindikatorer. Efterfølgende blev lipopolysaccharid (LPS)-stimuleret RAW264.7 musemakrofagcellemodel bygget til at simulere lipidperoxidation og akut inflammatorisk skade. En række biokemiske assays inklusive MTT, ROS fluorescensdetektion, ELISA og Western blot blev implementeret for at vurdere antioxidativ stressstyrke og udforske signaltransduktionsveje.

Ifølge eksperimentelle resultater blev de optimale forarbejdningsparametre bestemt som skivetykkelse på 0,6 cm, dampbehandling i 6 minutter og tørretemperatur sat til 57 grader. Under denne praktiske bearbejdningstilstand nåede det målte indhold af acteosid og echinacosid henholdsvis 7,25 % og 31,62 %, hvilket viste god overensstemmelse med teoretiske forudsigelsesværdier. Cell‑based assays revealed that optimally‑processedCistanche tubulosaekstrakter af afkogsstykker reducerede signifikant nitrogenoxid (NO) og malondialdehyd (MDA) koncentrationer i LPS-udfordrede RAW264.7 makrofager. I mellemtiden forhøjede det markant intracellulære antioxidantenzymaktiviteter af superoxiddismutase (SOD), katalase (CAT), lactatdehydrogenase (LDH) sammen med øget indhold af glutathion (GSH). Sekretionsniveauerne af pro-inflammatoriske mediatorer inklusive TNF‑, IL‑1 og IL‑6 blev også undertrykt på en dosisafhængig måde. Western-blot-detektion bekræftede detCistanche tubulosaekstrakter begrænsede overdreven phosphorylering af nøgleproteiner inden for p38/AKT/JNK/NF‑κB signaleringskaskader.

Sammenfattende forbedrer denne optimerede moderne behandlingsprotokol effektivt udbyttet af karakteristiske phenylethanoidglycosider (acteosid og echinacosid) iCistanche tubulosaafkogsstykker. Forarbejdet urtemateriale udøver fremtrædende antioxidativ-stress og anti-inflammatoriske virkninger i LPS-induceret makrofagskadesmodel, hvis farmakologiske mekanisme delvist realiseres via inhibering af overaktivering af p38/AKT/JNK/NF-κB inflammatorisk signalakse. Dette arbejde giver pålidelige tekniske parametre for standardiseret industriel fremstilling og leverer eksperimentel støtte til udvikling af antioxidant funktionel mad afledt afCistanche tubulosa.

Nøgleord: Cistanche tubulosa; teknologi til behandling af afkogsstykker; akteosid; echinacoside; antioxidativt stress; RAW264.7 makrofag; p38/AKT/JNK/NF‑κB signalvej

1. Introduktion

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight tilhører Orobanchaceae-familien, og dens kødfulde skællede stilk er den officielle medicinske del. Denne ørkenmedicinske plante er stort set plantet i det tørre sydlige Xinjiang, Kina. I traditionel kinesisk urtepraksis,Cistanche tubulosafungerer som en klassisk styrkende urt med dokumenterede terapeutiske funktioner som tonificering af nyre-yang, genopfyldning af essens-blod og afslappende afføring. Klinisk anvendes det til at lindre ømhed-svaghed i lumbus og knæ, infertilitet forårsaget af nyremangel og tarmtørhed-induceret forstoppelse维普期刊.

Phenylethanoid glycosider står for de mest kritiske bioaktive markører afCistanche tubulosa. Den kinesiske farmakopé foreskriver, at det samlede indhold af echinacosid plus acteosid ikke bør være mindre end 1,50 % for kvalificerede medicinske materialer. Ikke desto mindre, nuværende mainstream fremstilling afCistanche tubulosaafkogsstykker følger stadig for det meste ældgamle manuelle arbejdsgange: iblødsætning af friske rå urter, fugtning grundigt, udskæring og naturlig tørring eller vindampning. Disse konventionelle tilgange mangler præcise kvantitative tekniske specifikationer. Termisk ustabilitet af phenylethanoidglycosider fører ofte til alvorlig nedbrydning af aktive ingredienser under forarbejdning, hvilket sænker slutproduktets kvalitet og begrænser produktion af høj kvalitet i stor skala. På nuværende tidspunkt kombinerer kun begrænset forskning samtidig optimering af procesteknologi med validering af biologisk aktivitet; de fleste undersøgelser detekterer blot indhold af kemiske bestanddele uden cellulær funktionel verifikation, hvilket skaber huller til industriel transformationGoogle for....

Oxidativ stress fungerer som kernepatologisk trigger for flere kroniske metaboliske og inflammatoriske sygdomme. Overdreven akkumulering af reaktive-ilt-arter (ROS) forstyrrer redox-homeostase, hvilket yderligere fremkalder makrofagoveraktivering og massiv pro-inflammatorisk-cytokinfrigivelse, hvilket danner en ond cirkel mellem oxidation og inflammation. Eksisterende farmakologiske undersøgelser har bevist detCistanchePhenylethanoidglycosider, der stammer fra, har antioxidante og antiinflammatoriske egenskaber. Det har tidligere dyreforsøg vistCistanche tubulosatotale glykosider forbedrede leverskade i sepsis-gnavermodeller ved at aktivere Nrf2/HO-1 antioxidantsignalering. Lignan-glycosidkomponenter isoleret fraCistanche tubulosakunne afbøde LPS-fremkaldte inflammatoriske responser via modulerende PI3K/AKT-vej i RAW264.7-makrofager. Hvorvidt afkogsstykker, der er fremstillet under nyligt optimerede forarbejdningsbetingelser, bevarer potent antioxidativ stressbioaktivitet, er imidlertid ikke blevet systematisk evalueret. Den konkrete molekylære reguleringsmekanisme kræver stadig dybere udforskning.

Den LPS-stimulerede RAW264.7-makrofag er en velaccepteret in-vitro-inflammations-oxidativ-skade-model, som er bredt anvendt til vurdering af naturlige produkters antioxidante og anti-inflammatoriske virkninger. I denne undersøgelse udfører vi først single-factor screening efterfulgt af Box-Behnken respons-overfladeoptimering for at opnå standardiserede udskærings-dampende-tørrende tekniske parametre rettet mod høje acteosid- og echinacoside-udbytter. Efter at have opnået optimerede afkogsprodukter, forbereder vi urteekstrakter og anvender LPS-induceret RAW264.7 cellulær skadesmodel. Flere eksperimentelle platforme, herunder oxidativ-stress-biokemisk-markørmåling, cytokin-ELISA-kvantificering og Western-blot-pathway-analyse bruges til at afklare antioxidativ stress-effektivitet og signaltransduktionsmekanisme. Denne forskning leverer praktiske procesparametre til pilotskalaproduktion af høj kvalitetCistanche tubulosaafkogsstykker med stabil antioxidativ-stress-aktivitet og lægger eksperimentelt grundlag for efterfølgende udvikling af funktionelle fødevarer og kosttilskudsprodukter fra XinjiangCistanche tubulosaressourcer.

2. Materialer og metoder

2.1 Råmaterialer, reagenser og instrumenter

FriskCistanche tubulosakødfulde stængler blev høstet i efteråret fra Hotan, Xinjiang Uyghur Autonome Region, Kina. RAW264.7 musemonocyt-makrofag leukæmi-cellelinje blev købt fra Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Kina). Acetonitril og methanol af kromatografisk kvalitet blev leveret af Merck (Tyskland). Referencestandardstoffer echinacosid og acteosid (renhed større end eller lig med 98 %) blev opnået fra Beijing North Weiye Metrology Technology Research Institute. Dimethylsulfoxid (DMSO) blev købt fra Sigma-VETEC (USA). DMEM-højglukosemedium, BCA totalprotein-assaykit var produkter fra Thermo Fisher Scientific (USA). Føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra BI (Israel). Penicillin-streptomycin-dobbelt-antistofopløsning kom fra HyClone (USA). Kommercielle assaysæt til NO, MDA, SOD, CAT, GSH blev erhvervet fra Beyotime Biotechnology (Shanghai, Kina). LDH-detektionskit og lipopolysaccharid (LPS,E. coli055:B5) blev opnået fra Solarbio (Beijing, Kina).

Nøglelaboratorieinstrumenter omfattede Shimadzu højtydende væskekromatografi (HPLC) system, LabTech rotationsfordamper, swing-type højhastigheds pulverisering af kinesiske urter, termostatisk blæsetørreovn, dampgrydeudstyr, BioTek SYNERGY-HFA multiplate-læser, 1-mode-1 mikroplade HFA-læser elektronisk analytisk vægt, CF1524R kølecentrifuge, BSC-1300IIA2 biosikkerhedsskab og BDS200-PH inverteret optisk mikroskop.

2.2 Single-Factor Processing Eksperimenter

FriskCistanche tubulosakødfulde stængler blev skåret i skiver af forskellig tykkelse (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Skiverne blev dampet i varieret varighed (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Bagefter blev materialer tørret under forskellige temperaturgradienter (omgivelsestemperatur 25 grader, 40 grader, 50 grader, 60 grader, 70 grader, 80 grader). Fuldt tørrede afkogsprøver blev pulveriseret og sigtet gennem en 40-mesh sigte til efterfølgende HPLC-komponentkvantificering.

2.3 Bestemmelse af indhold af akteosid og echinacosid

Sample‑solution preparation: Accurately weigh 1.0 g pulverized decoction‑piece powder into stoppered conical flask. Add 100 mL 50 % methanol solution precisely. Perform 30‑min soaking followed by 40‑min ultrasonic extraction. After cooling down, replenish solvent weight loss with 50 % methanol, mix evenly and allow static settlement. Supernatant was filtered through 0.22 μm microporous membrane for HPLC injection.

Tilberedning af referencestandardopløsning: Afvej nøjagtigt passende mængder af acteosid- og echinacosid-referencestoffer, opløs med 50 % methanol i målekolber, klargør seriel-gradient-standardopløsninger, filtrer med 0,22 μm filtermembran.

Kromatografisk opsætning: COSMOSIL C₁₈ analytisk kolonne; mobilfasesystem: mobilfase A: 0,1 % phosphorsyre vandig opløsning; mobil fase B: acetonitril. Detektionsbølgelængden blev sat til 330 nm; kolonnetemperatur 35 grader; flowhastighed 1 ml/min. Ekstern standardmetode blev anvendt til kvantitativ beregning af indholdet af acteosid og echinacosid. Omfattende evalueringsscore=(echinacosideindhold × 50 %) + (acteosidindhold × 50 %). Omfattende scores tjente som sammensat vurderingsindikator for præstationer i behandlingstilstand.

2.4 Box-Behnken Response-Surface Experimental Design

Baseret på en-faktor eksperimentelle resultater blev Design-Expert 13.0-software brugt til at implementere Box-Behnken tre-faktor tre-niveau eksperimentelt arrangement. Skivetykkelse (X₁, cm), dampbehandlingstid (X₂, min), tørretemperatur (X₃, grad ) blev valgt som uafhængige variabler. Acteosidindhold (Y1, %) og echinacosidindhold (Y2, %) var responsværdier. Sytten grupper af eksperimenter blev udført. Nulniveau for hver faktor blev valgt i henhold til optimal parameter opnået i enkeltfaktortests. Efter at have afsluttet respons-overfladeforsøg blev modelvariansanalyse, 3D-respons-overfladeplotning og tilstandsforudsigelse afsluttet. Praktiske verifikationsforsøg blev udført efter justering af teoretiske forudsagte parametre til operationelle faktiske produktionsværdier.

2.5 Cellekultur og prøveforberedelse

Råmateriale af afkogsstykker blev fremstillet under optimerede forarbejdningsbetingelser. Urtepulver blev ekstraheret efter den ovennævnte prøveforberedelsesprotokol, koncentreret ved rotationsfordampning og vakuumtørret for at opnå fast ekstraktpulver. Stamopløsning blev fremstillet ved at opløse ekstraktpulver i DMSO, yderligere fortyndet med komplet DMEM-medium (indeholdende 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin) til cellulære eksperimenter; den endelige DMSO-arbejdskoncentration blev kontrolleret til under 0,1 % (v/v). RAW264.7 makrofager blev dyrket i DMEM komplet medium under 37 grader, 5 % CO2 befugtet inkubatormiljø.

2.6 MTT Cytotoksicitetsanalyse

RAW264.7-celler blev podet på 96-brønds mikroplader ved celletæthed på 8 × 10⁴ celler/ml. Eksperimentelle grupper inkluderede opløsningsmiddelkontrolgruppe (0,1 % DMSO-medium), LPS-modelgruppe (endelig LPS-koncentration 1 ug/ml) og flereCistanche tubulosaekstraktkoncentrationsgrupper (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). Efter 2 timers præinkubation med urteprøve blev LPS (1 ug/ml slutkoncentration) suppleret til hver gruppe undtagen opløsningsmiddelkontrolgruppen. Inkubation fortsatte i 24 timer. Derefter blev MTT-reagens (5 mg/ml) tilsat og inkuberet i 4 timer. Kassér supernatanten, tilsæt 150 μL DMSO pr. brønd, ryst ved 37 grader i 15 min. Absorbansværdi ved 490 nm bølgelængde blev aflæst på mikropladelæser, og celleoverlevelseshastighed blev beregnet. Sikkert arbejde-koncentrationsområde blev bestemt til opfølgende funktionstest.

2.7 Intracellulær ROS-måling

RAW264.7-makrofager blev inokuleret på plader med seks brønde ved en tæthed på 4 × 10⁵ celler pr. brønd. Efter celleadhærens blev der udført grupperingsbehandling: opløsningsmiddelkontrolgruppe, LPS-modelgruppe og CT-ekstraktbehandlingsgrupper (12,5, 25, 50, 100 ug/mL). Efter 2 timers forbehandling med prøve blev LPS 1 ug/mL tilsat undtagen opløsningsmiddelkontrolgruppe, inkuber 24 timer. Intracellulært ROS-niveau blev detekteret ved hjælp af fluorescerende probe-indlæsningsmetode i henhold til kitinstruktionerne. Fluorescensintensitet blev målt med fluorescens mikropladelæser (excitation 488 nm, emission 525 nm).

2.8 Påvisning af NO, MDA, SOD, CAT, LDH og GSH

Efter tilsvarende cellebehandling blev cellekultursupernatant opsamlet til NO-måling ved anvendelse af Griess-reaktion. Vedhæftede celler blev vasket med forafkølet PBS, lyseret på is, cellelysatsupernatanten blev høstet efter centrifugering (10 000 r/min, 4 grader, 5 min). BCA-sættet bestemte den samlede proteinkoncentration af hver prøve. Indholdet af MDA-, GSH- og enzymaktivitetsindikatorer SOD, CAT, LDH blev analyseret nøje efter brugsvejledninger til kit.

2.9 ELISA-bestemmelse af pro-inflammatoriske cytokiner

RAW264.7-celler modtog prøveforbehandling og LPS-stimulering i i alt 16 timer. Cellekultursupernatant blev opsamlet og centrifugeret. Koncentrationer af TNF-, IL-1, IL-6 i supernatanten blev kvantificeret ved kommercielle ELISA-kits.

2.10 Western-blot-analyse

Efter 45 minutters LPS og prøve-co-inkubation blev RAW264.7-celler lyseret ved hjælp af RIPA-lysebuffer suppleret med protease-phosphatase-hæmmercocktail. Cellelysat blev centrifugeret ved 10 000 r/min under 4 grader i 5 minutter. BCA-kit kvantificeret total-proteinkoncentration. Prøveproteiner (50 ug pr. bane) blev denatureret ved 100 graders metalbad i 5 min. SDS-PAGE gelelektroforese separerede målproteiner, som derefter blev overført til PVDF-membraner. Membraner blev blokeret i 1 time med 5 % skummetmælks-TBST-opløsning. Primære antistoffer rettet mod p38, p-p38, AKT, p-AKT, JNK, p-JNK, NF-κB p65, p-NF-κB p65 og GAPDH blev inkuberet natten over ved 4 grader. Efter TBST-vask blev tilsvarende sekundære antistoffer inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Efter gentagen vask blev ECL ultrafølsomt kemiluminescerende reagens påført til billeddannelse af proteinbånd. Kvantitativ båndgråskalaanalyse blev implementeret til evaluering af det relative phosphoryleringsproteinekspressionsniveau.

2.11 Statistisk analyse

GraphPad Prism 8.0.2 software blev brugt til statistisk beregning og grafplotning. Eksperimentelle kvantitative dataresultater blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Envejs ANOVA efterfulgt af post-hoc multiple-sammenligningstest blev anvendt til sammenligning mellem grupper. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Eksperimentelle resultater

3.1 Resultater af enkeltfaktoreksperimenter

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) hindret intern frigivelse af stoffer, hvilket sænker indholdet af endeligt påviselig komponent. Under fast dampningstid (10 min) og tørretemperatur (60 grader) opnåede 0,4 cm skivetykkelse den højeste omfattende evalueringsscore.

Resultater af dampbehandlingens varighed: Når skivetykkelsen blev fastsat til 0,4 cm og tørretemperaturen holdt på 60 grader, kunne utilstrækkelig dampningstid ikke i tilstrækkelig grad ødelægge plantecellestrukturen, så aktive forbindelser var svære at opløse ud. Når dampningstiden oversteg 6 minutter, beskadigede overdampning urtevæv og inducerede nedbrydning af echinacosid og acteosid. Derfor blev 6 minutter foreløbigt identificeret som en foretrukken dampbehandlingsvarighed.

For ovntørrende temperaturgradienteksperimenter: Skivetykkelse 0,4 cm og dampningstid 6 minutter blev fastsat. Komponentindholdet steg med stigende tørretemperatur inden for et vist område. Når først tørretemperaturen oversteg 60 grader, forårsagede termisk nedbrydning ved høj temperatur et bemærkelsesværdigt fald i indholdet af målstof. Derfor blev 60 grader valgt som indledende optimale tørretemperaturbetingelser for efterfølgende respons-overfladeoptimering.

3.2 Box-Behnken Response-Surface Optimization and Verification

Sytten grupper af Box-Behnken-eksperimentelle kørsler blev afsluttet i henhold til designmatrix. Resultater fra variansanalyse indikerede, at regressionsmodeller for både acteosid- og echinacosidindhold opnåede statistisk signifikans (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >skive tykkelse.

Gennem matematisk modelberegning var teoretiske optimale behandlingsparametre: skivetykkelse 0,600 cm, dampbehandlingstid 5,685 min, tørretemperatur 57,009 grader. I betragtning af den faktiske gennemførlighed af industriel drift blev parametrene justeret til skivetykkelse 0,6 cm, dampningstid 6 minutter, tørretemperatur 57 grader. Tre parallelle valideringseksperimenter blev udført. Under denne praktiske betingelse var det målte acteosidindhold 7,25 %, echinacosidindholdet nåede 31,62 %. Afvigelsen mellem målte værdier og teoretisk forudsigelse forblev under 5 %, hvilket beviser, at denne respons-overflademodel var pålidelig og anvendelig til at styre produktionen af ​​afkogsstykker i den virkelige verden.

3.3 Cytotoksicitetsscreening af optimeret-behandletCistanche tubulosaUdtræk i RAW264.7-celler

MTT-cytotoksicitetsresultater afslørede, at ekstraktkoncentrationer i området 0-100 ug/mL ikke udøvede nogen åbenlys toksisk effekt på RAW264.7-makrofager og udviste endda mild celleproliferation-fremmende tendens. Når behandlingskoncentrationen steg til 200 ug/mL og 400 ug/mL, faldt celleoverlevelsesraten signifikant sammenlignet med opløsningsmiddelkontrolgruppen, hvilket viste koncentrationsafhængig cytotoksicitet. Derfor blev koncentrationsgradienter på 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL valgt som sikre arbejdskoncentrationer til efterfølgende oxidativt stress og inflammationsrelaterede cellulære assays.

3.4 Cistanche tubulosaEkstraher reduceret intracellulært ROS-niveau i LPS-stimulerede makrofager

Sammenlignet med opløsningsmiddelkontrolgruppe steg den intracellulære ROS-fluorescerende intensitet af LPS-modelgruppen ekstremt signifikant (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaekstrakt faldt intracellulær ROS-akkumulering på dosisafhængig måde. Hver lægemiddelbehandlingsgruppe viste statistisk signifikant reduktion af ROS versus LPS-modelgruppe (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Effekter på NO- og MDA-indhold

NO fungerer som klassisk inflammatorisk mediator frigivet af aktiverede makrofager. MDA er en guldstandard biomarkør, der afspejler lipid-peroxidation oxidativ skade. Sammenlignet med opløsningsmiddelkontrolgruppe forhøjede LPS-stimulering markant NO- og MDA-indhold i RAW264.7-celler (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosaekstraktbehandling kunne sænke NO-koncentrationen betydeligt. For MDA-indikator: 12,5 ug/ml gruppe gav ikke statistisk signifikant forbedring; 25-100 ug/mL koncentrationsgrupper reducerede observerbart MDA-niveau (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Indvirkning på antioxidant-relaterede biokemiske indikatorer SOD, CAT, LDH, GSH

Efter LPS-challenge faldt intracellulær SOD, CAT, LDH enzymatisk aktivitet samt GSH-indhold kraftigt i forhold til opløsningsmiddelkontrolgruppen (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaekstrakter af afkogsstykker kan genoprette cellulær endogene antioxidantforsvarskapacitet mod oxidative fornærmelser induceret af LPS.

3.7 Inhiberende effekt på pro-inflammatorisk cytokin TNF-, IL-1, IL-6 frigivelse

ELISA-detektionsresultater viste, at LPS-stimulering stærkt fremmede sekretionen af ​​TNF-, IL-1, IL-6 fra RAW264.7-makrofager (\\(P)<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosaekstraktbehandlingskoncentration blev frigivelsesmængden af ​​disse tre pro-inflammatoriske nøglecytokiner progressivt undertrykt, hvilket viste en klar dosis-respons-korrelation. Det bekræftede, at urteekstrakt udøvede en potent anti-inflammatorisk funktion ved at begrænse pro-inflammatorisk-cytokinsekretion fra aktiverede makrofager.

3.8 Forordning om p38/AKT/JNK/NF‑κB Signaling-Pathway Phosphorylation

Western-blot eksperimentelle data viste, at forholdet mellem p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK og p-NF-κB/NF-κB var signifikant forhøjet i LPS-modelgruppen versus opløsningsmiddelkontrolgruppen (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaekstraktintervention reducerede markant p-p38/p38 og p-JNK/JNK-forhold (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaekstrakt af afkogsstykke lindrede oxidativ-inflammatorisk skade ved at undertrykke hyperphosphoryleringsaktivering af p38/AKT/JNK/NF-κB-signalnetværk.

4. Diskussion

Traditionelle behandlingskrav registreret i kinesisk farmakopé forCistanche tubulosaomfatter hovedsageligt fjernelse af urenheder, vask, befugtning, udskæring og tørring uden at specificere præcise numeriske parametre for skivetykkelse, dampningsvarighed og tørretemperatur. Ikke-standard manuel behandling medfører store kvalitetsudsving for kommercielle afkogsprodukter. Phenylethanoidglycosider (echinacosid og acteosid) er termisk labile bioaktive forbindelser. Forkert opvarmningstid eller temperatur vil udløse kemisk nedbrydning og reducere medicinsk værdi. Vores enkeltfaktoreksperimenter afslørede, at både utilstrækkelig og overdreven dampning såvel som for høj tørretemperatur ville forårsage tab af målglykosidkomponenter. Yderligere Box-Behnken multi-faktor optimering opnåede praktiske fremstillingsparametre: skivetykkelse 0,6 cm, dampning 6 min, tørring 57 grader. Under denne betingelse nåede indholdet af acteosid og echinacosid 7,25 % og 31,62 %, hvilket langt oversteg farmakopéens minimumskvalitetstærskel. Denne optimerede protokol giver mulige kvantitative tekniske referencer til standardiseret industriel behandling af Xinjiang-oprindelseCistanche tubulosa.

Oxidativt stress og betændelse er tæt forbundne patologiske processer. Overskydende ROS inducerer lipidperoxidation og genererer MDA, som yderligere aktiverer medfødte immunmakrofager. Aktiverede makrofager udskiller rigeligt NO og flere pro-inflammatoriske cytokiner, som omvendt forstærker intracellulær ROS-produktion og danner selvforstærkende oxidativ-inflammatorisk ond cirkel. Naturlige planteafledte antioxidantstoffer kan bryde denne patologiske sløjfe ved at hæve det endogene antioxidantenzymsystem og begrænse inflammatorisk signaltransduktion. I denne in-vitro undersøgelse, optimalt behandletCistanche tubulosaekstrakter fra afkogsstykker sænkede ROS-, NO- og MDA-niveauer, mens de forbedrede SOD, CAT, LDH-aktiviteter og GSH-indhold i LPS-stimulerede RAW264.7-makrofager. Samtidig hæmmede det TNF-, IL-1, IL-6 pro-inflammatorisk-cytokin-sekretion, hvilket demonstrerede integreret antioxidativ-stress og anti-inflammatorisk kapacitet.

Mitogen-aktiveret-protein-kinase-familie molekyler p38, JNK sammen med AKT og NF-κB udgør central signal-transduktionshub, der medierer makrofag inflammatorisk-oxidative responser. Ved LPS-stimulering udløser opstrømssignal phosphoryleringsaktivering af p38, JNK og AKT, som sekventielt fremmer NF-κB p65 subunit-phosphorylering og nuklear translokation. Aktiveret NF-κB fungerer som transkriptionsfaktor og initierer transkription af store partier af pro-inflammatoriske-cytokin- og oxidativ-stress-relaterede gener. Vores Western-blot-resultater viste detCistanche tubulosaekstrakt kunne undertrykke phosphorylering af p38, JNK, AKT og NF‑κB p65. Derfor udleder vi, at dets antioxidative stress og anti-inflammatoriske bioaktivitet opnås, i det mindste delvist, via blokering af overaktivering af p38/AKT/JNK/NF-κB-signalaksen.

Der er flere begrænsninger inden for den nuværende forskning. Alle funktionelle verifikationer er begrænset til cellekulturniveau in vitro. Yderligere dyremodel-in-vivo-eksperimenter er nødvendige for at verificere in-vivo-farmakodynamiske ydeevne af optimerede afkogsstykker. Derudover vedtog denne undersøgelse totalt blandet ekstrakt fra afkogsstykker, så vi kan ikke skelne individuelt bidrag fra echinacosid, acteosid og andre mindre sekundære metabolitter. Opfølgningsforskning kan isolere monomerforbindelser for at sammenligne respektive antioxidativ-stress-styrke og udføre undersøgelse af kompatibilitetseffekt. Alligevel leverer vores nuværende arbejde stadig praktiske behandlingsteknologiske parametre og foreløbig mekanistisk bevis for udviklingCistanche tubulosa-relaterede sundhedsprodukter.

5. Konklusion

Som konklusion kan den moderniserede behandlingsarbejdsgang optimeret af Box-Behnkens respons-overflademetodologi (skivetykkelse 0,6 cm, dampning 6 minutter, tørretemperatur 57 grader) øge indholdet af acteosid og echinacosid markant.Cistanche tubulosaafkogsstykker. Ekstrakter fremstillet af disse optimalt forarbejdede urteskiver udøver fremtrædende antioxidativt stress og anti-inflammatoriske virkninger mod LPS-induceret RAW264.7 makrofagskade. Den underliggende mekanisme er korreleret med genoprettelse af det intracellulære antioxidant-forsvarssystem og hæmning af overdreven aktivering af p38/AKT/JNK/NF-κB inflammatorisk signalvej. Denne undersøgelse giver et solidt eksperimentelt grundlag for standardiseret industriel produktion og funktionel-fødevareudnyttelse afCistanche tubulosaressourcer.

Referencer

Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Udvinding af echinacosid fraCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight og undersøgelse af dets beskyttende effekt på leverskade hos sepsisrotter. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y, et al. De anti-inflammatoriske virkninger af lignanglycosider fraCistanche tubulosastammer på LPS/IFN-inducerede RAW264.7 makrofagceller via PI3K/AKT-vejen. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Oxidativ stress og metaboliske lidelser: Patogenese og terapeutiske strategier. Life Sciences, 2016,148:183-193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. Anti-inflammatorisk af dise-necionyl cis-khellacton i LPS-stimulerede RAW264.7-celler og dets hæmmende aktivitet på opløselig epoxidhydrolase. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin lindrer lipopolysaccharid-inducerede inflammatoriske reaktioner i makrofager ved at undertrykke MAPK og NF-κB signalveje. Journal of Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. PI3K/AKT-signalvejen ved inflammation, celledød og glia-ardannelse efter traumatisk rygmarvsskade. Cell Proliferation, 2022,55(9):e13275.