Abstrakt

Cistanche tubulosaer en dyrebar tonic urt, der er vidt anvendt i traditionel kinesisk medicin. Phenylethanoidglycosider repræsenteret ved echinacosid og acteosid er dets bioaktive kernestoffer. Denne forskning har til formål at optimere moderne behandlingsparametre tilCistanche tubulosaafkogsstykker for at forbedre udbyttet af echinacosid og acteosid og yderligere udforske dets antioxidative stress og anti-inflammatoriske mekanisme på cellulært niveau.

Enkeltfaktoreksperimenter blev udført efterfulgt af Box-Behnken respons-overfladeoptimering med skivetykkelse, dampningstid og tørretemperatur som indflydelsesfaktorer. Højtydende væskekromatografi (HPLC) blev brugt til at detektere indholdet af to markørforbindelser. Den LPS-inducerede RAW264.7 makrofagskadesmodel blev konstrueret til at vurdere farmakologiske aktiviteter. Reaktive oxygenarter (ROS), nitrogenoxid (NO), malondialdehyd (MDA), aktiviteter af antioxidantenzymer inklusive SOD, CAT, LDH og glutathion (GSH) indhold blev bestemt. ELISA blev brugt til at teste sekretionsniveauet af pro-inflammatoriske cytokiner TNF‑, IL‑1 og IL‑6. Western blot-assay blev udført for at analysere phosphoryleringsstatus for nøgleproteiner i p38/AKT/JNK/NF-κB-signalvejen.

De optimale forarbejdningsbetingelser var skivetykkelse på 0,6 cm, damptid på 6 minutter og tørretemperatur på 57 grader. Under denne betingelse nåede indholdet af acteosid 7,25 % og echinacosid nåede 31,62 %. Ekstrakter fra optimerede afkogsstykker kan signifikant reducere overproduktionen af ​​intracellulær ROS, NO og MDA i LPS-stimulerede RAW264.7-celler. Det øgede aktiviteterne af SOD, CAT, LDH og øgede det intracellulære GSH-niveau, i mellemtiden hæmmede frigivelsen af ​​TNF-, IL-1 og IL-6 markant. Western-blot-resultater indikerede, at ekstraktet nedregulerede phosphoryleringsforholdet af p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK og p-NF-κB/NF-κB.

Den optimerede dampende-tørrende procesteknologi kan effektivt øge genvindingshastigheden af ​​hovedphenylethanoidglykosider afCistanche tubulosa. Afkogsstykker udøver antioxidative og anti-inflammatoriske virkninger mod LPS-udløst celleskade gennem inhibering af p38/AKT/JNK/NF-κB signalvejen. Denne undersøgelse giver praktiske tekniske parametre til standardiseret industriel behandling afCistanche tubulosa, og tilbyder eksperimentel dokumentation for udviklingen af ​​funktionel mad og nutraceutiske produkter afledt af denne urteressource.

Nøgleord: Cistanche tubulosa; teknologi til behandling af afkogsstykker; akteosid; echinacoside; antioxidativt stress; RAW264.7 makrofag; p38/AKT/JNK/NF‑κB pathway

1. Introduktion

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight tilhører Orobanchaceae-familien, og dens medicinske del er den tørrede kødfulde stilk med skælblade. I Kina er denne plante hovedsageligt plantet i tørre områder i nordvest, med det største planteområde i det sydlige Xinjiang. Som en velkendt styrkende urtemedicin fungerer den til at tonificere nyre-yang, genopfylde essens og blod og fugte tarme for at lindre forstoppelse. Klinisk bruges det til behandling af nyre-yang-mangel, insufficiens af essens-blod, infertilitet, ømhed og svaghed i talje og knæ samt tørhed i tarmen forstoppelse.

Phenylethanoidglykosider, hovedsageligt echinacosid og acteosid, er de primære aktive komponenter iCistanche tubulosa. Ifølge kravene i den kinesiske farmakopé må det samlede indhold af echinacosid og acteosid i kvalificerede medicinske råvarer ikke være lavere end 1,50 %, hvilket tjener som den kritiske kvalitetsevalueringsindikator. Traditionelle behandlingsmetoder tilCistanche tubulosaanvender for det meste iblødsætnings-befugtning, skæring-tørring eller vindampning. Masser af undersøgelser fokuserer på at forbedre udbyttet af aktive komponenter, mens forskning, der kombinerer procesteknologioptimering med verifikation af biologisk aktivitet, fortsat er utilstrækkelig.

Oxidativ stress fungerer som det fælles patologiske grundlag for flere metaboliske og inflammatoriske sygdomme. Eksisterende forskning har bevist, at samlede glykosider udvundet fraCistanche tubulosakan undertrykke inflammatorisk respons og aktivere Nrf2/HO‑1-vejen for at lindre leverskade hos sepsisdyr. Lignanglycosidfraktioner fra denne urt kan afbøde makrofagbetændelse ved at regulere PI3K/AKT-signalering. Ikke desto mindre kræver den farmakologiske egenskab ved moderne forarbejdede afkogsstykker og dens underliggende molekylære mekanisme stadig yderligere udforskning.

I denne undersøgelse blev Box-Behnken respons-overfladedesign anvendt baseret på enkeltfaktortests, hvor skivetykkelse, damptid og tørretemperatur blev taget som variabler for at optimere bearbejdningsarbejdsgangen. Efter opnåelse af optimale tekniske parametre blev LPS-induceret RAW264.7 oxidativ-skade cellemodel etableret for at evaluere anti-oxidativ stress og anti-inflammatorisk kapacitet og dissekere relevant signalmekanisme. Dette arbejde har til formål at tilvejebringe stabile og funktionsdygtige behandlingsparametre til produktion i pilotskala og lægge eksperimentelt grundlag for en omfattende udnyttelse afCistanche tubulosaressourcer.

2. Materialer og metoder

2.1 Plantemateriale, reagenser og instrumenter

Friske kødfulde stængler afCistanche tubulosablev høstet i efteråret fra Hotan, Xinjiang. RAW264.7 musemonocyt-makrofag leukæmiceller blev købt fra Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Kina).

Acetonitril og methanol af HPLC-kvalitet blev opnået fra Merck Company. Echinacoside (Større end eller lig med 98 %) og acteosid (Større end eller lig med 98 %) referencestandarder blev leveret af Beijing North Weiye Metrology Institute. Dimethylsulfoxid (DMSO) blev købt fra Sigma-Aldrich. DMEM-højglukosemedium, føtalt bovint serum (FBS), penicillin-streptomycin-dobbeltantistofopløsning, BCA-proteinkvantificeringskit, assaysæt til NO, MDA, SOD, CAT, GSH og LDH, lipopolysaccharid (LPS), MTT-reagens- og ELISA-produkters cytokines til alle kommercielle produkter.

Eksperimentelle instrumenter inkluderede Shimadzu højtydende væskekromatograf, rotationsfordamper, pulverisering af kinesiske urter, termostatisk blæsttørreovn, dampkoger, fuldbølgelængde mikropladelæser, elektronisk analytisk balance, nedkølet centrifuge, biosikkerhedsmikroskopskab og inverteret optisk mikroskop.

2.2 Enkeltfaktorbehandlingseksperiment

FriskCistanche tubulosakødfulde stængler blev skåret i skiver med tykkelser på 0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm og 1,2 cm. Skiverne blev dampet i henholdsvis 3 minutter, 6 minutter, 9 minutter, 12 minutter, 15 minutter, 18 minutter og 21 minutter og tørret under forskellige temperaturgradienter, herunder stuetemperatur (25 grader), 40 grader, 50 grader, 60 grader, 70 grader og 80 grader. Tørrede prøver af afkogsstykker blev knust og sigtet gennem en 40-mesh sigte til efterfølgende påvisning. Sammensat scoreformel blev vedtaget til omfattende vurdering: Sammensat score=echinacosidindhold × 50 % + akteosidindhold × 50 %.

2.3 HPLC-bestemmelse af acteosid og echinacosid

Forberedelse af prøveopløsning: Vej nøjagtigt 1,0 g pulverprøve, tilsæt 100 ml 50 % methanolopløsning. Efter 30 min iblødsætning blev der udført ultralydsekstraktion i 40 min. Vægttabet blev suppleret med 50 % methanol efter afkøling. Supernatanten blev filtreret med 0,22 μm mikroporøs membran før HPLC-injektion.

Blandet reference-standardopløsning af acteosid og echinacosid blev fremstillet med 50 % methanol og fortyndet i serielle koncentrationer til standardkurveafbildning. Kromatografiske betingelser: COSMOSIL C18 kromatografisøjle; mobilfasesystemet bestod af 0,1 % phosphorsyre vandig opløsning (A) og acetonitril (B); detektionsbølgelængden blev sat til 330 nm; kolonnetemperatur 35 grader; flowhastighed 1 ml/min. Ekstern standardmetode blev brugt til kvantitativ beregning af målforbindelser.

2.4 Box-Behnken Response-surface Experimental Design

Ifølge enkeltfaktoreksperimentelle resultater blev skivetykkelse (X₁), damptid (X₂) og tørretemperatur (X₃) valgt som uafhængige variabler. Acteosidindhold (Y1, %) og echinacosidindhold (Y2, %) tjente som responsværdier. Design-Expert 13.0-software blev brugt til at etablere en tre-faktor tre-niveau Box-Behnken eksperimentel ordning med i alt 17 grupper af test. Modeltilpasning, variansanalyse og parameterforudsigelse blev fuldført af software. Praktiske verifikationsforsøg blev udført i tre eksemplarer efter justering af teoretiske optimale parametre for at passe til den faktiske produktionsdrift.

2.5 Cellekultur og prøveforberedelse

Prøve af afkogsstykke, der blev opnået under optimerede forarbejdningsbetingelser, blev fremstillet til ekstraktpulver. Pulveret blev opløst i DMSO og yderligere fortyndet med komplet DMEM-medium indeholdende 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin til celleforsøg. RAW264.7-celler blev dyrket i befugtet inkubator ved 37 grader med 5 % CO2.

2.6 MTT-assay for cellelevedygtighed

Cellesuspension blev inokuleret i plader med 96 brønde ved celletæthed på 8 x 104 celler/ml. Grupper blev sat som opløsningsmiddelkontrolgruppe (0,1 % DMSO), LPS-modelgruppe (1 ug/ml LPS) og flere koncentrationsgrupper afCistanche tubulosaekstrakt (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). Efter 2 timers præinkubation af prøver blev LPS med en slutkoncentration på 1 ug/ml tilsat undtagen opløsningsmiddelkontrolbrønde og inkuberet i yderligere 24 timer. MTT-opløsning (5 mg/ml) blev tilsat i 4 timers reaktion. Efter fjernelse af supernatanten blev DMSO tilsat for at opløse formazankrystal. Absorbansværdi ved 490 nm blev detekteret af mikropladelæser for at beregne cellelevedygtighed. Sikkert koncentrationsområde blev valgt til opfølgende funktionstest.

2.7 Intracellulær ROS-måling

RAW264.7-celler blev podet i 6-brøndsplader ved en tæthed på 4 × 10⁵ celler pr. brønd. Efter at have klæbet til væggen blev cellerne forbehandlet med gradientkoncentrationCistanche tubulosaekstrakt (12,5, 25, 50, 100 ug/mL) i 2 timer, derefter stimuleret med 1 ug/mL LPS i 24 timer. Intracellulært ROS-niveau blev detekteret med fluorescerende probereagenskit. Fluorescensintensitet blev registreret under excitationsbølgelængde 488 nm og emissionsbølgelængde 525 nm.

2.8 Påvisning af NO, MDA, SOD, CAT, LDH og GSH

Cellekultursupernatant blev opsamlet for at påvise NO-indhold via Griess-metoden. Celler blev vasket med forafkølet PBS og lyseret på is. Cellelysat blev centrifugeret ved 10 000 rpm under 4 grader i 5 minutter for at erhverve intracellulær supernatant. MDA-indhold, enzymaktiviteter for SOD, CAT, LDH og GSH-niveau blev målt strengt i overensstemmelse med kitspecifikationerne. BCA-metoden blev anvendt til total-protein-normalisering.

2.9 ELISA-påvisning af pro-inflammatoriske cytokiner

RAW264.7-celler blev behandlet med prøve og LPS i 16 timer. Kultursupernatanten blev opsamlet og centrifugeret ved 10 000 rpm i 10 min. Sekretionskoncentrationerne af TNF‑, IL‑1 og IL‑6 blev kvantificeret ved hjælp af ELISA-kits.

2.10 Western blot-analyse

Efter 45-minutters intervention af prøver og LPS blev det totale cellulære protein ekstraheret ved hjælp af RIPA-lysebuffer. Proteinkoncentration blev kvantificeret ved BCA-kit. Lige meget proteinprøve (50 ug for hver bane) blev denatureret, adskilt ved SDS-PAGE-elektroforese og overført til PVDF-membran. Membranen blev blokeret med 5 % skummetmælks-TBST-opløsning i 1 time, derefter inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 grader. Efter gentagen vask med TBST blev sekundært antistof inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Målproteinbånd blev visualiseret med ECL-kemiluminescensreagens. Båndgråskalaanalyse blev udført for at beregne forholdet mellem phosphorylering og protein i alt.

2.11 Statistisk analyse

GraphPad Prism 8.0.2 software blev brugt til grafplotning og statistisk analyse. Envejs ANOVA og t-test blev brugt til datasammenligning.P < 0.05 represented statistically significant difference; P < 0.01 and P < 0.001 stood for higher significance. All experimental data were expressed as mean ± standard deviation (\(\bar{x}\pm s\)).

3. Resultater

3.1 Enkeltfaktoreksperimentelle resultater

Skivetykkelsen havde en fremtrædende indflydelse på indholdet af målglykosid. Skiver med en tykkelse på 0,2 cm var lette at blive overdampede, hvilket forårsagede termisk nedbrydning af aktive ingredienser. For tykke skiver forhindrede frigivelsen af ​​indre aktive stoffer. Når dampningstiden var fastsat til 10 minutter og tørretemperaturen på 60 grader, var 0,4 cm den optimale skivetykkelsesparameter i enkeltfaktor-screening.

Utilstrækkelig dampningstid kunne ikke fuldstændig ødelægge plantecellestrukturen og førte til lavt glykosidudbytte. Når dampningstiden overskred 6 minutter, opstod vævsdesintegration, og echinacosid såvel som acteosid blev nedbrudt. Under fast skivetykkelse på 0,4 cm og tørretemperatur på 60 grader var 6 minutter den bedste damptid.

Inden for et vist område steg indholdet af phenylethanoidglycosider sammen med tørretemperaturstigningen, men nedbrydningen fandt sted, når temperaturen oversteg 60 grader. Med skivetykkelse på 0,4 cm og damptid på 6 minutter viste 60 grader den bedste omfattende ydeevne inden for enkeltfaktor-screening.

3.2 Respons-overfladeoptimerings- og verifikationstest

Variansanalyse viste, at regressionsmodeller for indhold af acteosid og echinacosid var signifikante (P < 0.05, P < 0.01). The lack‑of‑fit term was non‑significant (P >0,05), hvilket indikerer god modeltilpasningsgrad. Bestemmelseskoefficienten R² var tæt på 1, hvilket viste høj korrelation mellem forudsagt værdi og faktiske eksperimentelle data.

Den indflydelsesrige rækkefølge af faktorer for indhold af akteosid var skivetykkelse > tørretemperatur > dampningstid. For echinacosidindhold var rækkefølgen damptid > tørretemperatur > skivetykkelse.

Teoretiske optimale parametre beregnet af software var skivetykkelse 0,600 cm, damptid 5,685 min og tørretemperatur 57,009 grader. I betragtning af praktiske produktionsforhold blev parametrene justeret til skivetykkelse 0,6 cm, damptid 6 min og tørretemperatur 57 grader. Tre grupper af parallelle verifikationsforsøg opnåede et acteosidindhold på 7,25 % og et echinacosidindhold på 31,62 %. Afvigelsen mellem praktisk værdi og teoretisk forudsagt værdi var henholdsvis 3,89 % og 4,92 %, hvilket demonstrerede pålideligheden af ​​denne respons-overflademodel.

3.3 Cellelevedygtighedsscreeningsresultat

Inden for 0-100 ug/mL koncentrationsområde,Cistanche tubulosaekstrakt af afkogsstykke havde ingen tydelig cytotoksicitet på RAW264.7-celler og udviste en let spredningsfremmende effekt. Når koncentrationen nåede 200 ug/ml og derover, faldt cellelevedygtigheden signifikant. Derfor blev 12,5 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/mL og 100 ug/ml udvalgt som arbejdskoncentrationer til efterfølgende celleforsøg.

3.4 Effekt på intracellulært ROS-niveau

Sammenlignet med opløsningsmiddelkontrolgruppe udviste LPS-modelgruppen bemærkelsesværdigt forhøjet intracellulær ROS-fluorescensintensitet (P < 0.001), proving the successful establishment of oxidative‑stress injury model. Pretreatment of Cistanche tubulosaekstraher reduceret overdreven ROS-akkumulering på en dosisafhængig måde (P < 0.001 versus model group).

3.5 Forordning om NO-, MDA- og antioxidantrelaterede indikatorer

LPS-stimulering inducerede skarp stigning i NO- og MDA-indhold i RAW264.7-celler. Sammenlignet med LPS-modelgruppen sænkede ekstraktintervention signifikant NO-niveauet med dosisafhængig tendens . 12.5 ug/mL ekstrakt gav ikke tydelig effekt på MDA-indholdet, mens 25-100 ug/mL ekstrakt observerbart nedsatte MDA-koncentrationen (P < 0.001).

Efter LPS-behandling faldt aktiviteterne af SOD, CAT, LDH og intracellulært GSH-indhold markant . 12.5 ug/mL ekstrakt kunne øge SOD-aktiviteten uden at forbedre CAT- og LDH-aktiviteterne. Ekstraher ved en koncentration på 25-100 ug/mL signifikant forhøjede SOD, CAT, LDH enzymaktiviteter og GSH indhold på en koncentrationsafhængig måde.

3.6 Inhiberende effekt på pro-inflammatorisk cytokinsekretion

LPS-stimulering udløste massiv frigivelse af TNF‑, IL‑1 og IL‑6 i RAW264.7 makrofager.Cistanche tubulosaForbehandling af afkogsekstrakt undertrykte bemærkelsesværdigt sekretionen af ​​ovennævnte tre pro-inflammatoriske cytokiner (P < 0.001), presenting prominent dose‑dependent anti‑inflammatory property.

3.7 Modulation på p38/AKT/JNK/NF‑κB Signaling Pathway

Sammenlignet med opløsningsmiddelkontrolgruppe øgede LPS-intervention phosphoryleringsforholdet af p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK og p-NF-κB/NF-κB. Mellem- og højdosisekstraktgrupper reducerede signifikant p-p38/p38- og p-JNK/JNK-forholdet. Alle koncentrationsgrupper nedregulerede p‑AKT/AKT og p‑NF‑κB/NF‑κB niveau (P < 0.05 or P < 0.001). Results illustrated that optimized Cistanche tubulosaekstrakt af afkogsstykker begrænsede aktiveringen af ​​p38/AKT/JNK/NF-κB-signalvejen ved at hæmme proteinphosphorylering.

4. Diskussion

Nuværende behandlingskrav vedrCistanche tubulosaoptaget i kinesisk farmakopé beskriver kun kvalitative operationstrin uden præcise kvantitative parametre. Tidligere undersøgelser viste, at forskellige forarbejdningsmetoder ville forårsage store forskelle i kemisk sammensætning og farmakologisk aktivitet mellem rå og forarbejdetCistanche tubulosaprøver. Forarbejdede produkter viser bedre antioxidant- og immunregulerende ydeevne sammenlignet med råvarer.

I denne forskning opnåede den moderne damp-tørringsproces optimeret via respons-overflademetodologi et meget højere udbytte af echinacosid og acteosid end mange traditionelle behandlingsteknikker. Det tyder på, at præcis kontrol over skivetykkelse, dampningsvarighed og tørretemperatur effektivt kan bevare og forbedre indholdet af phenylethanoid-glycosid iCistanche tubulosa.

Oxidativt stress og betændelse er tæt forbundne patologiske processer. Overdreven ROS giver anledning til lipidperoxidation og MDA-akkumulering; i mellemtiden aktiverer det nedstrøms inflammatoriske kaskader og fremmer dannelsen af ​​NO og flere pro-inflammatoriske cytokiner. Inflammatoriske mediatorer accelererer ROS-produktionen yderligere og danner en ond patologisk cyklus. Vores cellulære eksperimentelle resultater viste, at det var optimeretCistanche tubulosaekstrakt af afkogsstykker kunne eliminere overflødig ROS, reducere oxidative skadesmarkører NO og MDA, genoprette aktiviteten af ​​antioxidantenzymsystemet repræsenteret ved SOD, CAT, LDH og genopbygge intracellulært GSH, samt hæmme frigivelsen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner med tydeligt dosis-effekt forhold.

p38, JNK, der tilhører MAPK-familien og AKT-NF-κB-aksen, er kernesignaltransduktionshubs, der medierer makrofag oxidativ-inflammatorisk respons. LPS-stimulering fremmer phosphorylering af p38, JNK og AKT, aktiverer yderligere NF-κB og inducerer transkription af adskillige pro-inflammatoriske gener. Western-blot-data afslørede detCistanche tubulosaafkogningsstykkeekstrakt blokerede fosforyleringsaktivering af p38, JNK, AKT og NF-κB. Det udledes, at højindhold af echinacosid og acteosid fra optimeret behandling i fællesskab bidrager til at undertrykke p38/AKT/JNK/NF-κB signaleringskaskade for at lindre LPS-forårsaget oxidativ stress og inflammatorisk skade i RAW264.7 makrofager.

Der er stadig begrænsninger i denne undersøgelse. Alle farmakologiske evalueringer blev gennemført på in vitro cellemodel. Yderligere dyreforsøg er påkrævet for at verificere in vivo-effektiviteten og metaboliske egenskaber ved forarbejdetCistanche tubulosaafkogsstykker.

Som konklusion etablerede denne undersøgelse kvantificerbar og skalerbar moderne behandlingsteknologi tilCistanche tubulosaafkogsstykker. Under behandlingsparametre med skivetykkelse 0,6 cm, dampningstid 6 minutter og tørretemperatur 57 grader, er indholdet af hovedphenylethanoidglycosider væsentligt forbedret. Forarbejdede afkogsstykker kan lindre oxidativ stress og inflammatorisk skade i LPS-stimulerede RAW264.7-makrofager ved at hæmme p38/AKT/JNK/NF-κB-signalvejen. Denne forskning giver praktisk teknisk reference til industrialiseret produktion og tilbyder eksperimentelt grundlag for udvikling af funktionelle fødevarer og kosttilskudsprodukter af Xinjiang-oprindelseCistanche tubulosa.

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af Youth Science and Technology Backbone Innovation Capacity Cultivation Project fra Xinjiang Academy of Agricultural Sciences (xjnkq-2022022) og Xinjiang "Tianchi Doctor Program" (2021).

Referencer

[1] Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Udvinding af echinacosid fraCistanche tubulosaog undersøgelse af dets beskyttende effekt på leverskade hos sepsisrotter.Fødevarevidenskab og -teknologi. 2023;43:e010523.

[2] Guo J, Tang S, Miao Y, et al. De anti-inflammatoriske virkninger af lignanglycosider fraCistanche tubulosastammer på LPS/IFN-inducerede RAW264.7 makrofagceller via PI3K/AKT-vejen.Nuværende farmaceutisk bioteknologi. 2021;22(10):1380‑1391.

[3] Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Oxidativ stress og metaboliske lidelser: Patogenese og terapeutiske strategier.Livsvidenskab. 2016;148:183‑193.

[4] Martínez-de-Toda I, Ceprián N, Díaz-de-Castro E. Rollen af ​​oxi-inflammation-ældning i menneskelig patofysiologi.Celler. 2021;10(11):2974.

[5] Chung YC, Song SJ, Lee A, et al. Isobavachin lindrer lipopolysaccharid-inducerede inflammatoriske responser i makrofager og zebrafisk ved at undertrykke MAPK- og NF-κB-signalveje.Journal of Ethnopharmacology. 2024;321:117501.