Oligosaccharider forbedrer akut nyreskade ved at lindre klynge af differentiering 44-medierede immunresponser i nyrerørceller

Abstrakt:Akut nyreskade (AKI)er en pludselig episode afnyreskadesom ofte forekommer hos patienter indlagt på hospitaler. Til dato er der ikke udviklet nogen ideel behandling til at reducereAKI sværhedsgrad. Oligo-fucoidan(FC) interfererer med den renale tubulære celleoverfladeproteinklynge af differentiering 44 (CD44) for at forhindre renal interstitiel fibrose; dog forbliver oligosacchariders indflydelse på AKI ukendt. I denne undersøgelse blev FC, galacto-oligosaccharid (GOS) og fructo-oligosaccharid (FOS) udvalgt til at undersøge oligosacchariders indflydelse på AKI. Alle tre oligosaccharider har vist sig at blive delvist absorberet af tarmen. Vi fandt ud af, at oligosacchariderne dosisafhængigt reducerede CD44-antigenicitet og undertrykte den hypoxi-inducerede ekspression af CD44, phospho-JNK, MCP-1, IL-1 og TNF- i NRK-52E renale tubulære celler. I mellemtiden reducerede CD44 siRNA-transfektion og JNK-hæmmer SP600125 den hypoxi-inducerede ekspression af phospho-JNK og cytokiner. Liganden af ​​CD44, hyaluronan, modvirkede indflydelsen af ​​oligosaccharider på CD44 og phospho-JNK. 2 dage efter operationen for iskæmi-reperfusionsskade reducerede oligosaccharider nyrebetændelse, serumkreatin, MCP-1, IL-1 og TNF- i AKI-mus. 7 dage efter operationen blev nyrernes genopretning fremmet. Disse resultater indikerer, at FC, GOS og FOS hæmmer den hypoxi-inducerede CD44/JNK-kaskade og cytokiner i renale tubulære celler, hvorved AKI og nyrebetændelse i AKI-mus forbedres. Derfor,tilskud af oligosacchariderer en potentiel sundhedsstrategi for patienter med AKI.

Nøgleord: akut nyreskade; klynge af differentiering 44; fructo-oligosaccharid; galactooligosaccharid; oligo-fucoidan; betændelse

1. Introduktion

Akut nyreskade(AKI) er karakteriseret ved et pludseligt fald i glomerulær filtrationshastighed og en deraf følgende stigning i serumkreatinin. Denne skade er almindelig hos patienter indlagt på hospitaler og intensivafdelinger, især ældre. Iskæmi, sepsis og nefrotoksicitet er hovedårsagerne til AKI, der ofte eksisterer side om side og dermed komplicerer diagnose og behandling [1]. Alvorlig AKI placerer udskrevne patienter i risiko for bivirkninger, såsom kronisk nyresygdom, kardiovaskulære hændelser, cancer og infektioner [2]. AKI har en rivende udvikling, og der er ingen effektiv behandling tilgængelig for at undgå eller reducere dens sværhedsgrad. Indtagelse af specifikke næringsstoffer kan reducere renal tubulær skade i AKI [3]. Derfor vil undersøgelse af specifik ernærings indflydelse på AKI hjælpe med at forbedre AKI og medfølgende risici, som udskrevne patienter står over for.

Inflammation og leukocytrekrutteringer vigtige formidlere af AKI. Nyrer, især renale tubulære celler, generererinflammatoriske cytokinerunder AKI, såsom IL-1, IL-6, monocyt kemoattraktant protein-1 (MCP-1) og tumornekrosefaktor- (TNF-) [4,5] . Disse cytokiner inducerer yderligere systemisk inflammation og leukocytrekruttering. Selvom adskillige leukocytundergrupper udøver beskyttende virkning på AKI (såsom T-regulatoriske celler), er de fleste neutrofiler, monocytter og dendritiske celler skadelige for gendannelse af AKI [6]. Systemisk inflammation er også skadelig for restitution fra AKI på grund af de høje cytokinniveauer [7]. Blandt de cytokiner, der udskilles af nyren, er MCP-1 hovedsageligt ansvarlig for leukocytrekruttering, reagerer på forskellige cytokiner, herunder IL-1 og TNF- [8,9], og spiller en vigtig rolle i patogenesen af forskellige nyreskader [10]. I humane proksimale tubulære celler HK-2 medieres hypoxi-induceret MCP-1-ekspression af c-Jun NH2--terminalkinase (JNK)-vejen [11]. p38-vejen er også involveret i albumin-induceret MCP-1-ekspression i renale tubulære epitelceller [12]. Derfor kan reguleringen af ​​JNK- og p38-veje påvirke inflammation og leukocytrekruttering i AKI.

Oligosaccharider er saccharidpolymerer, der indeholder 3-10 monosaccharider, som er ufordøjelige og udgør en vigtig bestanddel af de samlede tilgængelige præbiotika som kosttilsætningsstoffer [13]. De fleste fructo-oligosaccharider (FOS'er), der indtages i den menneskelige krop, fermenteres fuldstændigt af tyktarmsfloraen, og en lille del genfindes i urinen [14]. Galacto-oligosaccharider (GOS'er) kan absorberes i blodet og efterfølgende udskilles i urinen [15]. Den samme situation gør sig gældende for fucoidan i brune marinealger [16]. Absorberede oligosaccharider kan påvirke biokemiske reaktioner og cellegenkendelse [17]. Vores tidligere undersøgelse afslører, at oligo-fucoidan (FC) interfererer med interaktionen mellem det renale tubulære celleoverfladeprotein CD44 og dets ekstracellulære ligander og derved forhindrer nyre interstitiel fibrose [18]. Interaktionen mellem CD44 og dens ekstracellulære ligander fremmer JNK-signalvejen [19]. Derfor kan den daglige indtagelse af oligosaccharider reducere nyrebetændelse hos patienter med AKI. Imidlertid forbliver indflydelsen af ​​disse polymerer på AKI ukendt. Denne undersøgelse undersøgte effekten af ​​FC, FOS og GOS på hypoxi-behandlede renale tubulære celler og AKI-mus med iskæmi-reperfusionsskade (IRI). Resultaterne viste, at de tre oligosaccharider undertrykte CD44-medierede nyreimmunresponser og reducerede post-AKI sværhedsgrad. Derfor præsenterer brugen af ​​disse polymerer som et kosttilskud en ny AKI-behandlingsstrategi

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer

FOS (gennemsnitlig polymerisationsgrad < 10), GOS (gennemsnitlig polymerisationsgrad < 8) og FC (gennemsnitlig polymerisationsgrad < 5) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA, Kat. nr. F8052), henholdsvis Carbosynth (Berkshire, UK, Kat. nr. OG32134) og Hi-Q Marine Biotech International (Taipei, Taiwan). Oligosaccharider blev opløst i dobbeltdestilleret H2O og filtreret under anvendelse af 0,22 µm sterile filtre (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland). Hyaluronan (HA) og alle andre kemikalier af reagenskvalitet blev opnået fra Sigma. Antistoffer mod JNK (sc-7345), phospho-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}), og TNF- (sc-52746) blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Antistoffer mod p38 (9212) og phospho-p38 (9211) blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Antistoffer mod Ly6G (ab25377) og F4/80 (ab100790) blev købt fra Abcam (Cambridge, UK). Antistoffer mod HIF-1 (NB100-105) blev købt fra Novus Biologicals (Centennial, CO, USA).

2.2. Cellekultur

Rotteproksimale renale tubulære celler (NRK-52E) og musemakrofaglinje RAW264.7 blev købt fra Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan); dyrket i DMEM suppleret med antibiotika/svampehæmmende opløsning og 10 % føtalt kalveserum; og holdes ved 37 ◦C og 95 % luftfugtighed i en CO2-inkubator. Efter at have nået 70 % konfluens blev cellerne dyrket i et serumfrit medium og inkuberet natten over før eksperimentet. Til hypoxieksperimentet blev NRK-52E-celler og Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, New York, NY, USA) deponeret i rektangulære krukker (Mitsubishi Gas Chemical America), og hele opsætningen blev placeret i en 37 ◦C inkubator i 4 timer. Cellerne blev derefter dyrket natten over under normale betingelser.

2.3. Western Blot Analyse

Kort fortalt blev 15 µg NRK-52E proteinlysat påført hver bane, og resultaterne blev analyseret ved Western blot. Relative proteinbåndniveauer blev kvantificeret fra fem uafhængige eksperimenter med Quantiscan-software fra Biosoft (Cambridge, UK).

2.4. Kort interfererende (si)RNA-transfektion af CD44

Rotte CD44 siRNA (4390771) blev købt fra Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Efter vækst til 70 % konfluens blev cellerne transficeret med siRNA under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Thermo Scientific) efter producentens instruktioner.

2.5. Celleproliferationsassay

Efter at hypoxiske NRK-52E-celler var blevet dyrket i 24 timer, blev det samme medium brugt til at dyrke RAW264.7-celler i en 96-brøndsplade (2000 celler/brønd). Efter 24 timers inkubation blev proliferationen af ​​RAW264.7-celler analyseret ved at anvende et SRB-assaykit (Abcam, kat.nr. ab235935) i henhold til producentens instruktioner.

2.6. CD44 antigenicitetstest

Rekombinant rotte CD44 blev opnået fra R&D Systems (Minneapolis, MN, USA, Kat. nr. 6577-CD) og anvendt til at producere en bindingsreaktion med HA i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev 20 ng/ml rekombinant rotte CD44 blandet med forskellige koncentrationer af FC, FOS eller GOS i 10 minutter for at undersøge oligosacchariders indflydelse på CD44-antigenicitet. Blandingerne blev analyseret under anvendelse af et CD44 ELISA-kit (Abcam, kat.nr. ab213928) ifølge producentens instruktioner.

2.7. Forsøgsdyr og renal IRI

Otte uger gamle 129S1/SvImJ hanmus blev købt fra Lasco Technology (Taipei, Taiwan). Alle dyreforsøg blev godkendt af Taipei Medical University Committee of Experimental Animal Care and Use (godkendelsesnr. LAC-2019-0511) og dannet af NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Til IRI-induktion blev mus (der vejede 21-23 g) udsat for bilateral nyrepedikelklemning i 30 minutter ved at udføre et flankesnit [20]. Mus blev bedøvet ved inhalationsbedøvelse med isofluran præoperativt. Sham-opererede mus gennemgik en lignende operation, bortset fra fastklemning af nyrepindler. Alle mus blev fodret med oligosaccharider gennem oral gavage fra 1 dag før til 2 dage efter IRI-kirurgi. Forsøgsmusene blev opdelt i følgende fem grupper med n=8 for resultaterne på dag 3 og dag 7: (1) falsk gruppe; (2) AKI-gruppe; (3) AKI-gruppe fodret med FC (10 mg/kg/dag); (4) AKI-gruppe fodret med FOS (10 mg/kg/dag); og (5) AKI-gruppe fodret med GOS (10 mg/kg/dag). Mus blev aflivet 3 eller 7 dage efter operationen, og blod blev opsamlet og analyseret under anvendelse af en biokemisk analysator og ELISA-sæt. Serumkreatininniveauet for hver mus blev analyseret for at vurdere udviklingen af ​​AKI. Nyremorfologi blev undersøgt ved periodic acid-Schiff (PAS) farvning og immunhistokemisk farvning (IHC) i formalinfikserede 2 µm paraffinsnit.

2.8. Immunhistokemi farvning

Nyrevæv blev fikseret med 4% bufret paraformaldehyd, indlejret i paraffin og skåret i 2 µm sektioner til farvning med UltraVision Quanto Detection System HRP DAB kits (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) og hybridisering med det primære antistof i henhold til producentens instruktioner .

2.9. PAS farvning

Nyresektioner blev farvet med et PAS-farvesæt (Abcam, kat. nr. ab150680) i overensstemmelse med producentens instruktioner.

2.10. ELISA-assay

Det dyrkede medium af NRK-52E-celler og serumprøverne fra forsøgsmusene blev opsamlet og analyseret ved hjælp af MCP-1 ELISA-kittet (Abcam, kat.nr. ab208979) og IL-1 ELISA-sæt (Abcam, kat.nr. ab197742). Serumprøverne blev også analyseret under anvendelse af et TNF-ELISA-kit (R&D Systems, kat. nr. MTA00B) og neutrofil gelatinase-associeret lipocalin (NGAL) ELISA-kit (R&D Systems, kat. nr. MLCN20) af producentens anvisninger.

2.11. Statistiske tests

Signifikante forskelle mellem de to grupper blev bestemt ved hjælp af Students t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante for p-værdier<0.05

3. Resultater

3.1. Oligosaccharider hæmmer stigningen i CD44 og cytokiner i hypoxiske NRK-52E-celler

CD44-ekspression i NRK-52E-celler behandlet med FC, FOS og GOS blev først overvåget for at evaluere oligosacchariders indflydelse på renale tubulære celler. Hypoxi-induceret CD44-ekspression blev hæmmet af alle tre oligosaccharider i intervallet 0.05–0,5 mg/ml (figur 1A). Derfor blev oligosacchariddoseringen på 0,1 mg/ml anvendt i de følgende celleforsøg. I det forberedte system inducerede hypoxibehandling bemærkelsesværdigt ekspressionen af ​​hypoximarkør HIF-1 i NRK-52E-celler, hvilket indikerer, at cellerne var i en hypoxitilstand (figur 1B). Hypoxi opregulerede niveauerne af phosphoryleret JNK, MCP-1, IL-1 og TNF-, men ikke i cellerne behandlet med oligosaccharider (figur 1B, C). JNK-ekspression steg i hypoxiske celler, men ikke i FC-behandlede eller FOS-behandlede celler. GOS påvirkede ikke JNK-ekspression i hypoxiske celler, men undertrykte opreguleringen af ​​phosphoryleret JNK. Derfor kan oligosaccharider inhibere hypoxi-induceret JNK-signaltransduktion og cytokinekspression i renale tubulære celler. Selvom FC og GOS opregulerede phosphoryleret p38 i hypoxiske celler, steg ekspressionen af ​​dette protein ikke i hypoxiske celler. Dette fund indikerer, at p38 ikke spiller en nøglerolle i hypoxi-inducerede reaktioner i NRK-52E-celler.

3.2. CD44 og JNK spiller en kritisk rolle i cytokinforøgelse i hypoxiske NRK-52E-celler

Ekspressionen af ​​CD44, phosphoryleret JNK og cytokiner i renale tubulære celler blev alle påvirket af oligosaccharider, men deres sammenhæng mangler at blive belyst. For at undersøge CD44's rolle i JNK-signaltransduktion og cytokinekspression i hypoxiske celler blev NRK-52E-celler transficeret med forskellige doser af CD44-siRNA. CD44 siRNA ved 50 og 100 PM blokerede effektivt hypoxi-øget CD44-ekspression og inhiberede signifikant hypoxi-induceret stigning i niveauerne af phosphoryleret JNK, MCP- 1, IL-1 og TNF- (figur 2A). Indflydelsen af ​​CD44-blokering på JNK-ekspression var relateret til siRNA-doser. JNK-ekspression i hypoxiske celler blev induceret af CD44 siRNA ved 50 pM, men inhiberet ved 100 pM. Begge doser undertrykte opreguleringen af ​​phosphoryleret JNK. Den selektive inhibitor for JNK, SP600125, reducerede signifikant ekspressionen af ​​MCP-1, IL-1 og TNF- i hypoxiske NRK-52E-celler (figur 2B). Disse resultater tyder på, at den hæmmende virkning af CD44 siRNA-transfektion på hypoxi-inducerede cytokiner tilskrives en reduktion i phosphoryleret JNK.

Figur 1. Inhiberende effekt af oligosaccharider på CD44-signaltransduktion i hypoxiske NRK-52E-celler. Cellerne blev forbehandlet med FC, FOS eller GOS i 3 0 min og derefter udsat for hypoxisk dyrkning. Proteinekspression blev analyseret ved Western blotting. (A) Dosisafhængige virkninger af oligosaccharider på CD44-ekspression. (B) Effekt af oligosaccharider på CD44-relaterede signaler. Oligosaccharidkoncentration blev sat til 0,1 mg/ml. Relative stigninger i proteinbånd er også præsenteret i søjlediagramform (C). Resultater er udtrykt som middelværdi ± SD (n=4).

Figur 2. Rolle af CD44 og JNK i hypoxi-inducerede inflammatoriske responser i NRK-52E-celler. Proteinekspression blev analyseret ved Western blot. (A) Inhiberende effekt af CD44 siRNA-transfektion på phosphoryleret JNK og cytokiner. (B) Inhiberende effekt af SP600125 på cytokiner. Cellerne blev forbehandlet med 20 µM SP600125 i 30 minutter før hypoxibehandling. Relative stigninger i proteinbånd præsenteres også i søjlediagramform. Resultater er udtrykt som middelværdi ± SD (n=4).

3.3. Hypoxi-induceret cytokinsekretion i renale tubulære celler fremmer makrofagproliferation

Inflammation er en mediator af nyreskade i AKI. Derfor blev indflydelsen af ​​oligosaccha-rids på leukocytter undersøgt. Figur 3A viser, at FC, FOS og GOS ikke påvirkede proliferationen af ​​makrofag RAW264.7-celler. Proliferationen af ​​RAW264.7-celler blev fremmet af 24-times dyrkningsmediet for hypoxiske NRK-52E-celler (figur 3B), men ikke af mediet for hypoxiske NRK-52E-celler behandlet med oligosaccharider. Førstnævnte havde højere MCP-1- og IL-1-niveauer end sidstnævnte (figur 3C, D). Alle tre oligosaccharider reducerede signifikant MCP-1 og IL-1 i dyrkningsmediet af hypoxiske NRK-52E-celler. Derfor kan FC, FOS og GOS reducere ekspression og sekretion af cytokiner i hypoxiske renale tubulære celler og følgelig mindske inflammation forårsaget af beskadigede renale tubulære celler.