Genetik af osteopontin hos patienter med kronisk nyresygdom: Den tyske undersøgelse af kronisk nyresygdom Ⅳ

Baseline variabler og målinger

Et standardiseret sæt biomarkører blev målt i et centralt certificeret laboratorium ved hjælp af standardiserede protokoller [81]. Blandt andet blev kreatinin og albumin fra serum og urin kvantificeret ved hjælp af en IDMS sporbar metodik (Creatinine plus, Roche, Tyskland) og en turbidimetrisk metode (Tina-quant, Roche, Tyskland) Roche/Hitachi MODULAR P. Glomerulær filtrationshastighed (GFR) blev estimeret ved hjælp af den kreatininbaserede CKD-EPI for mula (enhed: ml/min/1,73 m2, [82]). UACR blev beregnet som målt urinalbumin/urinkreatinin (mg/g, [83]). Alder og køn blev selvrapporteret ved baseline besøget. I 2015 blev OPN målt fra baseline-serumprøver fra den komplette GCKD-studiekohorte ved hjælp af en kvantitativ sandwichenzymimmunoassayteknik (fastfase ELISA; Quantikine Human OPN Immunoassay DOST00 fra R&D Systems (R&D Systems Europe, Abingdon, UK) )). Kvantificering blev udført ved Institut for klinisk kemi og laboratoriemedicin, Greifswald, Tyskland. Variationskoefficienter (intra-assay) var 4,5 %, 5,3 % og 3,5 % for henholdsvis lave, mediane og høje niveauer. Inter-assay variationskoefficienten var 6,4%. Reagenser og sekundære standarder blev brugt som anbefalet af producenten.

ØKOLOGISK TRADITIONEL URT TIL NYRESUNDHED

Genotyping, kvalitetskontrol og imputation

Detaljeret information om genotypebestemmelse og datarensning i GCKD-undersøgelsen er blevet beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt blev DNA isoleret fra fuldblod og genotypebestemt ved 2.612.357 varianter for 5.123 GCKD-deltagere ved hjælp af Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip-array (Illumina, GenomeStudio, Genotyping Module Version 1.9.4) på ​​Helmholtz Center Munich. Datarensning blev udført separat for Omni2.5-indholdet og exome-chipindholdet i arrayet. Baseret på standardiserede protokoller [84], blev brugerdefinerede skrevne scripts (R, Perl) og Plink1.9 [85] software brugt til kvalitetskontrol (QC) af Omni2.5-indholdet. Prøvebaserede QC-trin omfattede kontrol af opkaldshastighed, køn, heterozygositet, genetisk herkomst og slægtskab, hvilket førte til udelukkelse af 89 prøver. På variantniveauet blev enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP'er) udelukket, hvis opkaldshastigheden var<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

Genom-dækkende associationsundersøgelse af almindelige varianter

Som tidligere rapporteret [17,18] blev GWAS udført for GCKD-deltagere med komplet genotypebestemmelse (Omni2.5), eGFR, UACR og log2(OPN) måling (N=4,897) data ved brug af linørregression af log2 (OPN) på SNP'er (additiv genetisk model) med en MAF �1%, justeret for alder, køn, log(eGFR) og log(UACR) (S1 Fig). Associationsanalyse blev udført ved hjælp af SNPTEST v2.5 [89]. Sammenfattende statistik blev kontrolleret for kvalitet ved hjælp af GWAtoolbox [90] og for inflation ved hjælp af genomisk kontrol [91]. En genomisk kontrolkorrektion blev dog ikke anmodet om (λ=1.01). Associationer med en p-værdi<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

Funktionel annotering af varianter blev udført ved hjælp af ANNOVAR[92], SNiPA [93], Open Targets Genetics [94], FAVOR [95] og RegulomeDB [96]. Regionale foreningsplot blev plottet ved hjælp af LocusZoom v1.3 [97].

Fin-mapping

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

Kolokaliseringsanalyser

For yderligere at forstå de molekylære mekanismer og tilknyttede fænotyper, der ligger til grund for associationerne, udførte vi kolokaliseringsanalyser af OPN GWAS-resuméstatistikken relateret til de to replikerede OPN-loci med GWAS-resuméstatistik fra tre andre kilder som beskrevet nedenfor. Til alle kolokaliseringsanalyser brugte vi funktionen 'coloc.fast' fra R-pakken gtx med standardparametre og tidligere definitioner (https://github.com/tobyjohnson/gtx), en implementering af en tilpasset version af colokaliseringsmetoden introduceret af Giambartolomei et al. [98]. Vi betragter en positiv kolokalisering, når den posteriore sandsynlighed for en delt kausal variant ved associationslocuset for begge træk (H4, p12) var > 0.8.

Genekspression.

Først brugte vi GWAS opsummerende statistik over genekspressionsdata fra GTEx-projektet [99] og NEPTUNE-studiet [100]. eQTL-data fra GTEx V8 (49 væv) og NEPTUNE-undersøgelsen (NephQTL fra glomerulus og tubulointerstitielle nyredele) blev downloadet fra GTEx-portalen (https://www.gtexportal.org/home/) og NephQTL-webstedet (http ://nephqtl.org/), henholdsvis. Analysetrinene for kolokalisering er blevet beskrevet i detaljer andetsteds [17]. For det første blev GWAS-resuméer af GTEx og NephQTL i genomiske regioner ±100 kb af de to OPN SNP'er ekstraheret. Generne i det ekstraherede GWAS identificeres, og for hvert gen defineres et cis-vindue på 500 kb, der flankerer starten og slutningen af ​​genet. Derefter, for hvert sådant cis-genvindue, med mindst én SNP med en association p-værdi < 0,001, blev GWAS-resuméerne af GTEx- og NephQTL-væv såvel som OPN-GWAS ekstraheret og brugt som input til kolokaliseringsanalyse.