Lave koncentrationer af paraquat inducerer tidlig aktivering af ekstracellulær signalreguleret kinase 1/2, proteinkinase B og C-Jun N-terminal kinase 1/2 veje: Rolle af C-Jun N-terminal kinase i paraquat-induceret celledød

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo,Germa´n Soler,§ og Jose´M. Fuentes

Abstrakt:

Paraquat er et herbicid med en potentiel risiko for at inducere parkinsonisme på grund af dets påviste neurotoksicitet og dets stærke strukturelle lighed med 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP plus ), et velkendt neurotoksin, der forårsager et lignende klinisk syndrom tilParkinsons sygdom(PD). Men på nuværende tidspunkt er meget lidt kendt om de signalveje, der aktiveres af paraquat i et hvilket som helst cellesystem. I denne undersøgelse har vi undersøgt effekten af ​​paraquat på ekstracellulære signalregulerede kinaser 1 og 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminal kinase (JNK) og proteinkinase B (PKB) aktivering i E18-celler. Lave koncentrationer af paraquat stimulerede meget tidlige stigninger i ERK1/2, JNK1/2 og PKB-phosphorylering. Phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K) hæmmere wortmannin og LY 294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H{{ 19}}benzopyran-4-on) hæmmede tidlige paraquat-inducerede stigninger i PKB-phosphorylering. Desuden var tidlige paraquat-medierede stigninger i ERK1/2-aktivering følsomme over for den mitogenaktiverede proteinkinasekinase 1 (MEK1)-hæmmer PD 98059(2#-amino-3#-methoxyflflavon), mens JNK1/2-responser var blokeret af JNK1/2-hæmmeren SP 600125 (anthra[1-9-cd]pyrazol-6(2H)-on). Forbehandling med wortmannin, LY 294002 eller PD 98059 påvirkede ikke paraquat-celledød i E18-celler. I modsætning hertil reducerede SP 600125 signifikant paraquat-induceret celledød i E18-celler. Som konklusion har vi vist, at lave koncentrationer af paraquat stimulerer robuste meget tidlige stigninger i ERK1/2-, JNK1/2- og PKB-phosphorylering i E18-celler. Desuden tyder de præsenterede data på, at inhibering af JNK1/2-vejen beskytter E18-celler mod paraquat-induceret celledød og understøtter det faktum, at hæmning af tidlig aktivering af JNK1/2 kan udgøre en potentiel strategi i PD-behandling. Nøgleord: paraquat; lave koncentrationer; JNK; celledød; Parkinson.

Anti-Parkinsons sygdom urt:cistanche

INTRODUKTION

Parkinsons sygdom (PD)er en neurodegenerativ lidelse karakteriseret ved døden af ​​dopaminerge neuroner i sub-Constantia nigra i forbindelse med intracytoplasmatiske indeslutninger kendt som Lewy bodies (Olanow og Tatton, 1999). Kun 5-10 procent af PD-patienter har en familiær form for denne sygdom med en autosomal dominant arvemåde (Gasser, 2001). Genetiske faktorer er vigtige hos patienter med unge debut, men de spiller sandsynligvis ikke en større rolle i den mere almindelige sporadiske PD. Derimod indikerer epidemiologiske undersøgelser adskillige miljøfaktorer, der øger risikoen for at udvikle PD(Parkinsons sygdom). Disse omfattede pesticider, herbicider, industrikemikalier, landbrug og at leve i landlige omgivelser (Cory-Slechta et al., 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner og BenShlomo, 1999). Det mest overbevisende argument til støtte for en miljøfaktor i PD vedrører opdagelsen af ​​de biologiske virkninger af MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrarki-dropyridin). Dette toksin i centralnervesystemet producerer et syndrom, der både klinisk og anatomisk ligner PD (Kopin og Markey, 1988; Langston et al., 1983). I denne forstand er det meget anvendte herbicid paraquat (1,1#-dimethyl-4,4#-bypiridinium) blevet foreslået som en formodet risikofaktor baseret på både dets strukturelle homologi med MPPþ, den aktive metabolit af MPTP ( Tanner og Langston, 1990), og om rapporter om parkinsonisme korreleret med eksponering for midlet (Hertzman et al., 1990; Hubble et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou et al., 1997; Wang et al. al., 1992). Mens signalvejene involveret i MPPþ celledød er velkendte (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003), vides der meget lidt om de aktiverede signalveje af paraquat (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) I hvert fald er der ingen undersøgelser om tidlige hændelser observeret efter eksponering for lave koncentrationer af paraquat.

Adskillige stimuli, herunder MPPþ og paraquat, kan aktivere en række intracellulære signalkaskader, der er tæt forbundet med både celledød og celleoverlevelsesveje. For eksempel aktiverer MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al., 2002) medlemmer af den mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) familie og proteinkinase B (PKB). TheMAPK-familiemedlemmerne aktiveres af MPPþ eller paraquat inkluderer ekstracellulære signalregulerede kinaser 1 og 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminale kinaser (JNK1 og JNK2) og p38 MAPK'er. Det er generelt accepteret, at ERK1/2 og PKB-aktivering fremmer celleoverlevelse ved at aktivere anti-apoptotiske signalveje, hvorimod aktivering af JNK1/2 og p38 MAPK er forbundet med neuronal celledød (Harper og LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . Aktivering af phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/PKB-vejen er involveret i neuronal overlevelse (Shin et al., 2001). Især kan aktivering af JNK1/2-vejen spille en kritisk rolle i MPP- og paraquat-toksicitet (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al., 2002; Peng et al., 2004) og følgelig i de cellulære processer, der påvirkes i PD(Parkinsons sygdom).

Urtecistanche: Anti-Parkinsons sygdom

MATERIALER OG METODER

Cellelinje og kultur.

Spontant udødeliggjorte rottehjerneneuroblaster, E18-celler, blev brugt i denne undersøgelse. E18-cellelinjen er opnået ved spontan udødeliggørelse fra kulturer af 18-daggamle føtale rotte-hjernebark og blev venligst leveret af Dr. A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, Madrid, Spanien) . E18-celler repræsenterer primitive neuroblaster, der udtrykker NF 68 og den primitive neuronale markør nestin, men mangler astrocytmarkøren, glialfibrillært surt protein. Efter delvis differentieringsinduktion med dibutyryl-cAMP udtrykker cellerne yderligere neuronale markører såsom NF 145, NF 220 og neuronspecifik enolase (Mun˜oz, personlig kommunikation). Celler blev dyrket i Hanks' F-12 (Hyclone, Brevieres, Frankrig) og suppleret med 10 procent FCS (Hyclone), streptomycin (100 mg/ml) og penicillin (100 U/ml). Celler blev podet ved 5 3 10 5 i en 75-cm2 vævskulturkolbe (TPP, Trasadingen, Schweiz) og inkuberet ved 37 C under en 5 procent CO2/95 procent luftatmosfære. Kulturer blev passeret en gang om ugen ved trypsinisering under anvendelse af en trypsin-EDTA-opløsning (Hyclone).

Cellebehandlinger.

Sammenflydende celler (~ 80 procent) i 75-cm2 vævskulturkolber blev trypsinbehandlet og podet i vævskulturskåle i en koncentration på 5 3104 celler/cm2. Fireogtyve timer senere blev mediet aspireret og erstattet med frisk medium alene eller medium indeholdende de angivne koncentrationer af paraquat. I yderligere forsøg, forskellige koncentrationer af kinasehæmmere (LY 294002, wortmannin, SP 600125 og PD(Parkinsons sygdom)98059, alle fra Tocris, Bristol, Storbritannien) blev tilføjet 30 minutter før paraquateksponeringen. Da kinaseinhibitorer blev opløst i dimethylsulfoxid, blev der lavet kontroller med den højeste anvendte koncentration (0,2 procent vol/vol). Dimethylsulfoxidtilsætning påvirkede ikke levedygtighedsværdierne for kontrolplader.

Cellelevedygtighedsanalyse.

Cellelevedygtighed blev bestemt ved det kolorimetriske MTT-assay (Mosmann, 1983). I levedygtige celler kan mitokondrieenzymet succinatdehydrogenase metabolisere MTT til et formazanfarvestof, der absorberer lys ved 57 0 nm. Til disse eksperimenter blev der brugt 24-brøndtestplader. Ved afslutningen af ​​hver behandling blev 100 ll MTT fremstillet i en koncentration på 5 mg/ml i PBS tilsat til hver plade. Efter 3 timers inkubation blev mediet dekanteret, og formazan-præcipitaterne blev solubiliseret med sur isopropanol (0,04-0,1 N HCl i absolut isopropanol). Absorbansen af ​​konverteret farvestof blev målt ved en bølgelængde på 570 nm med baggrundssubtraktion ved 630-690 nm. Absorbansen af ​​de ubehandlede kulturer blev sat til 100 procent.

For at bekræfte resultaterne opnået ved MTT-assayet blev celledød også vurderet ved at måle frigivelsen af ​​det cytosoliske enzym lactatdehydrogenase (LDH) til dyrkningsmediet ved hjælp af et kolorimetrisk LDH-assay-kit (Roche, Indianapolis, IN) i henhold til producentens instruktioner . LDH-lækage blev defineret som forholdet mellem LDH-aktivitet i dyrkningsmediet og den samlede aktivitet pr. brønd (3100). Sammenlignelige data blev opnået ved hjælp af begge metoder.

Fremstilling af celleekstrakter og Western blot analyse.

Efter eksperimentelle behandlinger blev cellerne (dyrket i 60- mm skåle) skyllet to gange med kold PBS og fjernet ved skrotning og derefter centrifugeret ved 900 3 g i 5 minutter ved 4 C. Celler blev lyseret i en buffer indeholdende 50 mM HEPES, pH 7,5, 300 mMNaCl, 1 procent Triton X-100, 2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mMNa3VO4 og proteaseinhibitorcocktail (Sigma, St. Louis, MO). Celler blev centrifugeret ved 13, 000 3 g i 5 minutter ved 4 C. Supernatanter blev opbevaret ved 80 C indtil analyse ved Western blot. Proteinkoncentration blev målt ifølge Bradford (1976) under anvendelse af BSA som standard.

Lige store mængder proteiner (10 LG pr. betingelse) blev opløst i 12 procent SDS-gelelektroforese og overført til PVDF-membraner i henhold til konventionelle delvist modificerede metoder (Fuentes et al., 2000). Kort fortalt blev proteiner overført (250 mA i 60 minutter) til PVDF-membraner under anvendelse af Mini Trans-Blot Cell-apparat (Bio-Rad, Hercules, CA). Proceduren for immundetektion inkluderer overførsel og blokering af membranen (60 min ved stuetemperatur) med TTBS (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,2 procent Tween-20) indeholdende 10 procent fedtfri tørret mælk. Membraner blev derefter inkuberet i 60 minutter ved stuetemperatur med polyklonale primære kaninantistoffer (alle fra Cell Signalling, Beverly, MA, fortyndet 1:1000) i TTBS þ 10 procent fedtfri tørret mælk eller 5 procent BSA. Efter vask (i to 5- min perioder med TTBS) blev membraner inkuberet (60 minutter ved stuetemperatur) med peroxidase-konjugerede anti-kanin sekundære antistoffer (1:5000 i TTBS med 10 procent fedtfri tørret mælk). Efter vask (i to 5-min. perioder og en 10-min. periode) blev påvisningen af ​​bundne antistoffer visualiseret ved kemiluminescens ved hjælp af ECL-plus-reagenset (Amersham Biosciences, Orsay, Frankrig) og analyseret efter kvantitet Én software (Bio-Rad). Actinindhold blev analyseret som en kontrol under anvendelse af et kanin polyklonalt antistof (fra Sigma) fortyndet 1:2500 i TTBS med 10 procent fedtfri tørret mælk.

Statistisk analyse.

Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange med en tilfredsstillende korrelation mellem resultaterne af individuelle eksperimenter. De viste data er fra et repræsentativt eksperiment; hver gruppe var i gennemsnit tre til fire kulturretter. Alle data er udtrykt som middelværdi ±SEM. Resultater blev analyseret ved ANOVA. P-værdierne mindre end 0.05 blev betragtet som signifikante.

Anti-Parkinsons sygdom:Cistanche ekstrakt

RESULTATER

Cytotoksiske virkninger af paraquat i E18-celler

Som tidligere rapporteret (Cappelletti et al., 1998; Chun et al., 2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), er flere cellelinjer følsomme over for paraquats toksiske egenskaber. Eksponering for paraquat forårsagede en dosisafhængig reduktion i cellelevedygtighed. (Fig. 1.) I denne undersøgelse udviste E18-celler behandlet med 25 lM paraquat i 24 timer et 50 procents tab af cellelevedygtighed. Cellelevedygtighed blev evalueret ved at måle transformationen til MTT til et formazanfarvestof, der absorberer lys ved 570 nm. Dette assay bruges i vid udstrækning til at overvåge celledød i flere cellelinjer, herunder E18-celler (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al., 2001) og forskellige fornærmelser, herunder paraquat (Chun et al., 2001; Gonzalez. -Polo et al., 2004).

Paraquat-induceret aktivering af ERK1/2 i E18-celler

Forøgelser i ERK1/2-aktivering i E18-celler behandlet med paraquat blev overvåget ved Western blotting under anvendelse af et phosphospecifikt ERK1/2 (Thr202/Tyr204) antistof. Eksponeringen af ​​E18neuroblastceller med 25 1M paraquat frembragte en markant stigning i phosphoryleringsstatus (Thr202/Tyr204) for ERK1/2 (44/42 kDa) (fig. 2A). Maksimale stigninger i phosphoryleringen skete efter 5 minutter, hvorefter phosphoryleringsniveauer langsomt falder til nær basale niveauer. Ydermere var stigningerne i ERK1/2-phosphorylering induceret af paraquat ikke koncentrationsafhængige (fig. 2B). Forbehandling med theMEK1-hæmmeren, PD(Parkinsons sygdom)98059 (50 1M; Dudley et al., 1995) inhiberede fuldstændigt paraquat-inducerede stigninger i ERK1/2-phosphorylering (fig. 3).

Paraquat-induceret aktivering af PKB i E18-celler

PKB-aktivering i E18-celler blev påvist ved Western blotting under anvendelse af et phospho-specifikt (Ser473) antistof. Stimulering af E18-celler med 25 1M paraquat frembragte en markant stigning i PKB-phosphorylering (fig. 4A). Denne stigning forekommer efter 20 minutter, sammenlignelig med den for ERK1/2-phosphorylering efter phosphoryleringsniveauer langsomt faldt til nær basale niveauer (fig. 4A). Ydermere var paraquat-medierede stigninger i PKB-phosphorylering koncentrationsafhængige med et maksimum på 25 lM paraquat (fig. 4A). Da PI-3K er påkrævet til PKB-aktivering, blev PI-3K's rolle i paraquat-induceret PKB-aktivering i E18-celler derfor undersøgt ved hjælp af PI-3K-hæmmerne wortmannin og LY 294002.

Paraquat-medierede stigninger i PKB-phosphorylering blev fuldstændig blokeret efter forbehandling (30 min) af E18-celler med 100 nM wortmannin og 30 1M LY 294002 (fig. 5). Disse observationer viser, at en PI-3K-afhængig pathway medierer paraquat-inducerede stigninger i PKB-phosphorylering i E18-celler.

Paraquat-induceret aktivering af JNK1/2 i E18-celler

Tidligere undersøgelser har vist, at paraquat aktiverer JNK1/2in neuroner (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) og ikke-neuronale celler (Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003). De anvendte koncentrationer er dog stort set højere end dem, der anvendes i dette arbejde. Derudover er de valgte tider til at visualisere JNK1/2-aktivering også længere. JNK1/2-aktivering i E18-celler blev påvist ved Western blotting under anvendelse af et phosphospecifikt JNK (Thr183/Tyr185) antistof. Stimulering af E18-celler med 25 1M paraquat frembragte en markant og tidlig stigning i JNK (46/54 kDa) phosphorylering (fig. 6A). Disse stigninger var maksimale efter 5 minutter, hvorefter phosphoryleringsniveauer faldt mod basale niveauer (fig. 6A). Paraquatmedierede stigninger i JNK1/2-phosphorylering var imidlertid ikke koncentrationsafhængige (fig. 6B). Paraquat-medierede stigninger i JNK1/2-phosphorylering var følsomme over for JNK1/2-hæmmeren SP 600125 (10 lM; Fig. 7; Bennett et al., 2001). Endelig stimulerede paraquat (25 lM) ikke målbare stigninger i p38 MAPK-phosphorylering i E18-celler i de samme tidsforløbseksperimenter (data ikke vist). Disse eksperimenter blev udført under anvendelse af et phosphospecifikt p38 MAPK(Thr180/Tyr182) antistof.

Måling af cellelevedygtighed efter behandling af E18-celler med paraquat- og kinaseinhibitorer

Efter at have vist, at paraquat i alle tilfælde producerer en tidlig aktivering ERK1/2, PKB og JNK1/2 i E18-celler, bestemte vi efterfølgende rollen af ​​den hurtige aktivering af disse kinaseveje i celledød induceret af lave koncentrationer af paraquat ved hjælp af farmakologisk specifik inhibitorer. Som vist i figur 1 inducerede eksponering af E18-celler for 25 lM paraquat en signifikant reduktion i cellelevedygtighed (omkring 50 procent). For at undersøge rollen af ​​ERK1/2, PKB og JNK1/2 i paraquat-induceret celledød, blev E18-celler præinkuberet i 30 minutter med følgende kinasehæmmere: PD(Parkinsons sygdom)98059 (50 1M; MEK1/2-inhibitor), LY 294002 (30 1M; PI-3K-hæmmer), wortmannin(100 nM; PI-3K-hæmmer) og SP 600125 (10 1M; JNK1/2-hæmmer). Som vist i figur 8 (og den er opsummeret i tabel 1), havde wortmannin, LY 294002 og PD 98059 ingen signifikant effekt på tabet af cellelevedygtighed induceret af 25 1M paraquat.

DISKUSSION

For nylig har forskellige undersøgelser øget interessen for muligheden for, at miljømæssige neurotoksiner såsom pesticider kan være relateret til udviklingen af ​​ikke-genetisk PD(Parkinsons sygdom)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz og Yu, 2000; Sherer et al., 2001). PQ er et af de mulige herbicider, der er involveret i PD på grund af en lignende kemisk struktur med MPPþ og den stærke sammenhæng mellem forekomsten af ​​sygdommen og mængden af ​​PQused (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz og Yu, 2000). Imidlertid er mekanismen for den neuronale toksicitet, der forekommer undereksponering for lave niveauer af paraquat, ikke blevet bestemt. Under alle omstændigheder er tidligere værker ikke interesserede i den tidlige proces, der er dokumenteret efter udstillingen til paraquat. Hovedresultatet af denne undersøgelse er, at vi har vist, at E18neuroblastceller udsat for lave koncentrationer af paraquatrapid øgede den aktiverede phosphorylering af de generelt antiapoptotiske signalveje PI-3K/PKB og MEK ERK og også den generelt proapoptotiske JNK1/ 2 MAPK. I modsætning hertil stimulerede paraquat ikke tids- eller koncentrationsafhængige målbare stigninger i p38 MAPK-phosphorylering. Som angivet ovenfor brugte vi en lav koncentration af paraquat. Relevansen af, om paraquat kan komme ind i hjernen eller ej, fordi det er et ladet molekyle, har været diskuteret. Nylige fund (Shimizu et al., 2001) afslørede imidlertid, at paraquat kan bruge den neutrale aminosyrepumpe til at komme ind i hjernen. Resultaterne præsenteret i dette arbejde indikerer, at kun en lav koncentration af paraquat er nødvendig i cellen for hurtigt at stimulere adskillige signalveje inklusive NK, der er impliceret i celledødsprocesser. Disse tidlige aktiveringer på grund af den lave koncentration af paraquat foreslås for første gang i dette arbejde.

Lidt opmærksomhed har været dedikeret til at studere ændringerne i phosphoryleringsniveauer af PKB eller ERK1/2 induceret af paraquat (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). Under alle omstændigheder bruger tidligere rapporter (Peng et al., 2004) relativt høje koncentrationer af paraquat (400 lM), der måler fosforyleringsgraden af ​​ERK efter 12-18 timers eksponering. På disse tidspunkter observerede de ikke ændringer i p-ERK-niveauerne. I vores arbejde opdagede vi en tidlig (5-10 min) og vigtig aktivering af ERK1/2 (Fig.2A). Denne aktivering falder langsomt til de basale niveauer. Under vores forhold er niveauerne af phosphoryleret ERK1/2 (efter 12-18 timer) de samme som i kontrollen, hvilket indikerer, at denne vej ikke er aktiv på disse tidspunkter (data ikke vist) som beskrevet af Peng et al. (2004). Denne aktivering er ikke koncentrationsafhængig, hvilket indikerer resultatet, at den robuste stimulering af ERK opnås og opretholdes med meget lave koncentrationer af paraquat. Ændringer i phosphorylerede PKB-niveauer er stadig ikke blevet beskrevet efter paraquateksponering. Vi viser i figur 4, at resultaterne er tids- og koncentrationsafhængige, og viser en maksimal effekt efter en 20-min. udstilling med 25 lM paraquat. Det vil sige, at tidlige paraquat-medierede stigninger i PKB-phosphorylering er sammenlignelige med dem, der er observeret for ERK1/2. Disse data afslører en tidlig stigning i aktivering af phosphoryleringen af ​​både PKB- og ERK-overlevelsesveje. Der er ingen data om tidlig aktivering af PKB eller ERK ved paraquat-induceret celledød. Tidligere undersøgelser (Halvorsen et al., 2002) beskriver imidlertid en lignende tidlig stigning i begge veje i neuroblastom SH-SY5Y-celler udsat for MPPþ. I dette tilfælde falder fosforyleringsniveauerne ikke mod basalniveauet. Disse data er særligt interessante på grund af den tidligere relaterede lignende struktur mellem paraquat og MPPþ, hvilket indikerer en anden begyndelse af det cellulære maskineri, der er impliceret i virkningen af ​​begge molekyler.

Mere opmærksomhed er blevet dedikeret til rollen som JNK1/2-pathway i at formidle signaler, der bidrager til den paraquat-inducerede celledød. I denne undersøgelse har vi vist, at lave koncentrationer (25 lM) af paraquat udløste signifikante stigninger i phosphoryleret JNK1/2 (fig. 6). Som det sker i PKBor ERK1/2, er denne aktivering tidsafhængig med en meget tidlig begyndelse (5 min) og med en langsom tilbagevenden til de basale niveauer. Tidligere værker (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) viser sene (12-18 timer) aktiveringer af JNK1/2-pathway produceret under alle omstændigheder af relativt høje koncentrationer af paraquat (fra 400 lM [Peng et al., 2004] til 800 lM [Chunet al., 2001]). Under vores forhold er phosphoryleringsgraden af ​​JNK1/2 på de angivne tidspunkter sammenlignelig med kontrollen. Samlet set indikerer disse resultater for første gang, at celleeksponering for en meget lav koncentration af paraquat producerer en tidlig aktivering af PKB-, ERK1/2- og JNK1/2-veje.

Efter at have fastslået, at paraquat udløser tidlig PKB-, ERK1/2- og JNK1/2-aktivering i E18-celler, undersøgte vi derefter rollen af ​​disse proteinkinaseveje i paraquat-induceret celledød ved hjælp af flere farmakologiske inhibitorer. Cellelevedygtighed blev overvåget ved at måle transformationen til MTT til et formazanfarvestof, der absorberer lys ved 570 nm. MTT-assay er blevet brugt til nøjagtigt at måle neuronal skade efter en række forskellige fornærmelser, herunder MPPþ eller paraquat (Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck et al., 2002; Sheng et al., 2002; Storch et al., 2004 ), og det er den mest anvendte metode til at bestemme celledød. Som vist i figur 8 reducerede forbehandling med den selektive JNK1/2-hæmmer SP 600125 signifikant paraquat-induceret celledød. Denne koncentration af SP 600125 blokerede fuldstændigt paraquat-induceret aktivering af JNK1/2 (fig. 7). Disse data tyder på, at inhibering af den tidlige aktivering af JNK1/2-vejen beskytter celler mod paraquat-induceret celledød. Disse data er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004), som har vist, at JNK1/2 er involveret i neuronal celledød udløst af paraquat. Imidlertid bruger disse undersøgelser mellem 15 og 30 gange mere koncentration af paraquat end den, der er anvendt i denne undersøgelse. Vi demonstrerer også, at lave koncentrationer af paraquat kan producere ikke kun aktivering, men også en tidlig aktivering af denne vej. Beskyttelsen observeret med SP600125 indikerer også, at JNK1/2-vejen er involveret i celledød induceret af paraquat. Derudover er JNK1/2-hæmning designet som en potentiel strategi til behandling af PD(Parkinsons sygdom)i flere modeller både in vivo og in vitro (Wang et al., 2004).

neurobeskyttende virkning af cistanche

Tidligere undersøgelser har vist, at både PKB- og ERKpathways er involveret i neuronal overlevelse (Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). I denne undersøgelse har vi vist, at lave koncentrationer af paraquat producerer og tidligt stimulerer både PKB- og ERK-veje. Disse observationer tyder på, at paraquat-induceret PKB- og ERK-aktivering kan være involveret i at beskytte celler mod paraquat-induceret celledød. For at undersøge denne mulighed brugte vi de strukturelt ikke-relaterede PI-3K-hæmmere wortmannin og LY 294002 og ERK1/2-hæmmeren PD(Parkinsons sygdom)98059. Interessant nok ændrede både PKB- og ERK-hæmning ikke cellelevedygtighed i nærvær af paraquat, hvilket tyder på, at øget PKB- og ERK-aktivering under vores forhold ikke er afgørende for overlevelse i paraquat-induceret celledød i E18-celler.

Det er velkendt, at mekanismen for paraquat-neurotoksicitet blandt andre faktorer medieres via oxidativt stress (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). I denne forstand er der for nylig blevet beskrevet en meget hurtig cytosolisk oxidativ stress i tidlige apoptotiske hændelser impliceret i paraquat-induceret celledød (Gonzalez-Polo et al., 2004). Da oxidativ stress aktiverer medlemmer af MAPK-familien (såsom ERK1/2 og JNK1/2) og PKB (Kamata og Hirata, 1999), kan denne tidlige aktivering af ERK1/2, JNK1/2 og PKB tilskrives den hurtige oxidative stress-induceret efter paraquateksponering.

Sammenfattende viser vores resultater for første gang, at lave koncentrationer af paraquat stimulerer meget tidlige og robuste stigninger i PKB-, ERK1/2- og JNK1/2-phosphorylering i E18-celler. Derudover har vi vist, at inhibering af den tidlige aktivering af JNK1/2-vejen beskytter E18-celler mod paraquat-induceret celledød. Dette resultat peger mod eksistensen af ​​nogle tidlige hændelser (som hurtig JNK1/2-aktivering), der spiller en væsentlig rolle i celledøden induceret af lave koncentrationer af paraquat. Dette resultat åbner også en ny og spændende linje i studiet af paraquat-toksicitet og dens mulige implikation i udviklingen af ​​PD(Parkinsons sygdom).

BEMÆRK: Cistancheer en traditionel kinesisk urt, der har effekter på neuroner og hjerneceller. cistanche er også kendt som ørkenginsengen, det er en potentiel behandling for neurosygdom som f.eksParkinsons sygdombaseret på det moderne farmakologiske studie