Langt ikke-kodende RNA KCNQ1OT1 regulerer proteinkinase CK2 via MiR-760 i alderdom og kaloriebegrænsning

Nøgleord:KCNQ1OT1; langt ikke-kodende RNA; alderdom;kaloriebegrænsning; proteinkinase CK2;miR-760

Klik her for at få flere oplysninger om Cistanche Anti-Aging-effekter

1. Introduktion

Lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er) er transkripter med en størrelse større end 200 nukleotider, som ikke er oversat til proteiner. LncRNA'er er ansvarlige for forskellige funktioner, herunder transkriptionel regulering icisellertrans, organisering af nukleare domæner og interaktion med mikroRNA'er (miRNA'er) [1–3]. Især giver forståelsen af ​​interaktionsnetværket af lncRNA'er og miRNA'er et nyt perspektiv på de regulatoriske mekanismer af gener. lncRNA'etKCNQ1OT1, hvis fulde navn erKCNQ1overlappende transkript 1, er et 91 kb transkript, der transskriberes af RNA-polymerase II i en antisense-orientering, ift.KCNQ1[4,5]. KCNQ1OT1er til stede i intron 10 af KCNQ1-genet. DetKCNQ1locus er placeret på den korte arm af humant kromosom 11 (11p15.5). Gennem rekruttering af G9a og H3K27 histon methyltransferase PRC2 (polycomb repressivt kompleks 2),KCNQ1OT1interagerer med kromatin for at danne en kompleks foldestruktur og dæmper derefter flere målgener [6]. DerudoverKCNQ1OT1er involveret i adskillige lidelser, herunder hjertesygdomme, cerebral iskæmisk slagtilfælde, åreforkalkning, pyroptose og forskellige kræftformer (mave-, ovarie- og kolorektale) ved at binde til forskellige miRNA'er (f.eks. miR-760, miR{{1} }a, miR-452-3p, miR-320a, miR-701-3p og miR-2054), som alle regulerer ekspressionen af ​​deres målgener [7–13]. Ikke desto mindre er de biologiske roller afKCNQ1OT1i alderdom og kaloriebegrænsning (CR) forbliver uklare.

Cellulær senescens er den terminale standsning af proliferation, stimuleret af adskillige cellulære belastninger såsom telomerforkortning, onkogen aktivering og oxidativ stress [14,15]. Tidligere undersøgelser identificerede proteinkinasen CK2 (CK2), sammensat af to katalytiske ( og/eller 0 ) underenheder og to regulatoriske underenheder, som en senescensregulator. CK2hæmning udløser ekspressionen af ​​flere alderdomsmarkører, herunder alderdomsassocierede -galactosidase (SA- -gal) aktivitet [16], p53–p21Cip1/WAF1akse aktivering [17], produktion af reaktive oxygenarter (ROS) [18], senescens-associeret heterochromatin foci (SAHF) dannelse [19], og senescens-associeret sekretorisk fænotype (SASP) ekspression [20]. miR-186, miR-216b, miR-337-3p og miR-760 fremmer cellulær senescens ved at hæmme CK2 [21,22]. Kaloriebegrænsning (CR), bestående af en kronisk reduktion i det samlede kalorieindtag uden underernæring, er den mest succesrige strategi til at forsinke cellulær alderdom [23]. Det er for nylig blevet rapporteret, at CK2 opreguleres af CR og inducerer autofagi [24]. Imidlertid forbliver den molekylære mekanisme, der ligger til grund for CR-medieret CK2-opregulering, uklar.

I denne undersøgelse er den potentielle rolle afKCNQ1OT1i senescens og CR blev vurderet.KCNQ1OT1knockdown fremmede en senescensfænotype via nedregulering af CK2 i human cancer MCF-7- og HCT116-celler og lungefibroblaster IMR-90-celler. Det peger denne forskning påKCNQ1OT1opregulerer CK2 udtryk gennem interaktion med miR-760 under ældning og CR, hvilket tyder på detKCNQ1OT1kan være et nyt terapeutisk mål for ældningsassocierede sygdomme.

2. Resultater

2.1. KCNQ1OT1 Knockdown-induceret aktivering af SA- -gal Farvning, p53-s21Cip1/WAF1Pathway og H3K9 Trimethylering Via CK2 Silencing i menneskelige kræftceller

MCF-7- og HCT116-celler blev transficeret medKCNQ1OT1siRNA til at undersøge involvering afKCNQ1OT1i alderdom.KCNQ1OT1knockdown opreguleret SA- -gal aktivitet (figur1EN). Derudover indikerede immunoblot-resultater detKCNQ1OT1 knockdownopregulerede niveauerne af p53 og p21Cip1/WAF1, og kendetegn ved SAHF (øget H3K9-trimethylering (H3K9me3) og nedsat H3K9-acetylering (H3K9Ac)) (figur1B). Det er tidligere rapporteret, at CK2-nedregulering inducerer disse senescensmarkører (aktivering af SA- -gal farvning, p53-p21Cip1/WAF1pathway og SAHF) [16,17,19]. Derfor blev det undersøgt omKCNQ1OT1interagerer med CK2. Interessant nok, ektopisk CK2 udtryk ophævede induktionen af ​​SA- -gal aktivitet, p53, p21Cip1/WAF1, og H3K9me3, formidlet afKCNQ1OT1nedregulering (figur1A,B). Desuden,KCNQ1OT1 knockdownreducerede proteinniveauet af CK2 (Figur1B). Disse resultater tyder samlet på detKCNQ1OT1knockdown inducerer cellulær senescens ved at nedregulere CK2.

2.2. KCNQ1OT1 Knockdown-induceret SASP-faktorudtryk og ROS-generering via CK2 Silencing i menneskelige kræftceller

Det blev undersøgt evtKCNQ1OT1nedregulering øgede ekspressionen af ​​SASP-faktorer på grund af rapporter om, at senescerende celler udskiller pro-inflammatoriske faktorer [14,15]. KCNQ1OT1knockdown inducerede udtryk for SASP-faktorer, herunder interleukin (IL)-1 , IL-6 og matrixmetalloproteinase (MMP) 3 (figur2A). KCNQ1OT1nedregulering øgede mængden af ​​intracellulær ROS, fordi oxidativt stress er en væsentlig årsag til alderdom [14,15]. Til dette formål blev HCT116- og MCF-7-celler transficeret medKCNQ1OT1siRNA og farvet med CM-H2DCFDA.KCNQ1OT1knockdown øgede ROS-produktion, som indikeret af det højre skift i FL-fluorescens under flflowcytometri (figur2B). Det er tidligere rapporteret, at CK2-nedregulering inducerer SASP-ekspression [20] og ROS generation [18]. Ektopisk ekspression af CK2 ophævede induktionen af ​​SASP-faktorekspression og ROS-generering, medieret afKCNQ1OT1nedregulering (figur2A,B). Samlet indikerer disse resultater detKCNQ1OT1knockdown inducerer ROS-generering og inflammation gennem nedregulering af CK2.

Figur 1. KCNQ10T1 knockdown-induceret aktivering af SA--gal-farvning, p53-p21CipI/WAF-vejen og H3K9-trimethylering via CK2x-silencing i humane cancerceller. HCT116- og MCF{{10}}-celler blev transficeret med KCNO10T1-siRNA i to dage i fravær eller tilstedeværelse af pcDNA3.1.HA-CK2x. (A) Celler blev farvet med 5-brom-4-chlor-3-indolyl--D-galactosid, og repræsentative billeder blev opnået ved 20x forstørrelse (øverst). Målestok=100 um. Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist. Graferne repræsenterer procentdelen af ​​blåfarvede celler (nederst). (B) Immunoblotting blev brugt til at bestemme niveauet af hvert protein under anvendelse af specifikke antistoffer (øvre). 3-Actin blev brugt som kontrol. Graferne repræsenterer kvantificeringen af ​​hvert protein i forhold til B-actin (nederst). Data er rapporteret som middel SEM.* p < 0,05; ** p < 0,01, ** p < 0,001. H3K9me3, histon H3 Lys9 trimethylering; H3K9AC, H3 Lys9 acetylering.

Figur 2. KCNQ10T1 knockdown-induceret senescens-associeret sekretorisk fænotype (SASP) faktorekspression og generering af reaktive oxygenarter (ROS) via CK2x silencing i humane cancerceller HCT116- og MCF-7-celler blev transficeret med KCNO1{ {20}}T1 siRNA i to dage i fravær eller tilstedeværelse af pcDNA3.1-HA-CK2a. (A) Niveauet af hvert mRNA blev bestemt ved omvendt transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR) under anvendelse af specifikke primere (øvre). Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist. Graferne repræsenterer kvantificeringen af ​​hvert mRNA i forhold til 6-aktin (nederst). (B) Cellerne blev inkuberet med 10 UM CM-HDCEDA. Fluorescensintensitet blev bestemt ved flowcytometrianalyse (øvre). Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist. Graferne viser det relative fluorescensniveau (nederst) Data rapporteres som middel 士 SEM. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

2.3. KCNQ1OT1 var involveret i lipopolysaccharid (LPS)-medieret SASP-faktorekspression via silencing CK2 i humane kræftceller

Fordi behandling med LPS forårsager cellulær senescens ved at nedregulere CK2 [20], blev det testet om LPS nedreguleredeKCNQ1OT1udtryk. Behandling med LPS (6µg/µL) reducerede transskriptionsniveauerne afCK2 ogKCNQ1OT1i humane kræftceller (figur3EN). Desuden effekten afKCNQ1OT1på SASP-faktorekspression i celler behandlet med LPS blev undersøgt. Behandling med LPS (6µg/µL) øget SASP-faktor (IL-1 , IL-6 og MMP3) ekspression i humane cancerceller; yderligere behandling med pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36.181-37.140) ophævede den LPS-medierede induktion af SASP-faktorer (figur3B). Det blev tidligere vist, at den samordnede handling af miR-760, miR- 186, miR-337-3p og miR-216b stimulerede for tidlig alderdom ved at dæmpe CK2'en protein i HCT116-celler [21], og at miR-760 og miR-186 blev opreguleret i replikative senescent IMR-90-celler [22]. Ekspressionsmønstrene for disse miRNA'er påvirket af behandling med LPD blev bestemt. Kvantitativ real-time polymerase chain reaction (qPCR) analyse viste, at mængden af ​​miR-760 steg med mere end 200 procent i både HCT116 og MCF-7 celler behandlet med LPS (6µg/µL), sammenlignet med kontrolcellerne. miR-186 blev ikke opreguleret af LPS-behandling, og miR-337-3p og miR-216b var forskelligt reguleret i disse celler (figur3C). Disse resultater indikerer således samlet, at LPS øgede miR-760 mængder via nedreguleringKCNQ1OT1, hvilket resulterer i CK2 nedreguleringsmedieret alderdom.

Figur 3. KCNO10T1 var involveret i lipopolysaccharid (LPS)-medieret senescens-associeret sekretorisk fænotype (SASP) faktorekspression via silencing CK2x i humane cancerceller. (A) HCT116- og MCF-7-celler blev behandlet med LPS (6 ug/uL) i to dage. Niveauet af hvert mRNA blev bestemt ved RI-PCR under anvendelse af specifikke primere (øverst). Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist. B-Actin blev anvendt som kontrol. Graferne repræsenterer kvantificeringen af ​​hvert mRNA i forhold til B-actin (nederst). (B) Celler blev behandlet med LPS (6 ug/uL) i fravær eller tilstedeværelse af pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) i to dage. Niveauet af hvert mRNA blev bestemt ved RI-PCR under anvendelse af specifikke primere (venstre). Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist, at 3-Actin blev brugt som kontrol. Graferne repræsenterer kvantificeringen af ​​hvert mRNA i forhold til -actin (til højre). (C) Celler blev behandlet med LPS (6 ug/uL) i to dage, totalt RNA blev isoleret fra celler og underkastet PCR-analyse for at bestemme de relative niveauer af miR-760, miR-186, miR{{ 26}}p og miR-216b ved hjælp af RNU48 til normalisering. Data er vist som temaer 士 SEM.*p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

2.4. KCNQ1OT1 Opreguleret CK2 ved at sponging miR-760 i humane kræftceller

Dernæst blev det undersøgt omKCNQ1OT1regulerer CK2 udtryk via miR-760. HCT116- og MCF-7-celler blev transficeret med pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36.181-37.140) eller KCNQ1OT1-siRNA sammen med en miR-760-mimik eller inhibitor (sekvenser vist i supplerende tabel S1). Ektopisk udtryk forKCNQ1OT1(36.181-37.140) øgede mRNA-niveauet afCK2 , hvorimod yderligere behandling med miR-760-mimik er undertryktKCNQ1OT1-formidletCK2 opregulering (figur4EN). I modsætning,KCNQ1OT1knockdown reducerede mRNA-niveauet afCK2 , hvorimod yderligere behandling med en miR-760-hæmmer er undertryktKCNQ1OT1knockdown-medieretCK2 nedregulering (figur4B). Både miR-760-mimikeren og inhibitoren kunne ikke ændre mængden afKCNQ1OT1, hvilket indikerer, at miR-760 ikke var en opstrømsregulator afKCNQ1OT1. Alt i alt tyder disse resultater på detKCNQ1OT1øger mængden afCK2 mRNA ved at svampe miR-760. Supplerende figur S1 viser sekvenserne og bindingsstederne forKCNQ1OT1, miR-760 ogCK2 mRNA, bestemt ved hjælp af TargetScan og Miranda.

Figur 4. KCNQ10T1 opregulerede CK2x ved at svampe miR-760 i humane cancerceller. (A) HCT116- og MCF-7-celler blev transficeret med pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) i to dage i fravær eller tilstedeværelse af miR-760. (B) HCT116- og MCF-7-celler blev transficeret med KCNO10T1-siRNA i to dage i fravær eller tilstedeværelse af en miR-760-hæmmer. Niveauet af hvert mRNA blev bestemt ved RT-PCR under anvendelse af specifikke primere (øverst). Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist. Graferne repræsenterer kvantificeringen af ​​hvert mRNA i forhold til B-actin (nederst). Data rapporteres som middel 士 SEM.* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

2.5. CR-tilstand opreguleret CK2x af miR-760 nedregulering via KCNQ1OT1 opregulering i humane kræftceller

Det blev antaget, at KCNQ1OT1-ekspression var opreguleret i CR-tilstanden, fordi niveauet af CK2x mRNA var opreguleret i CR-tilstanden [24]. HCT116- og MCF-7-celler blev inkuberet under CR-betingelser for at teste denne hypotese. Som vist i figur 5A blev ekspressionen af ​​KCNO10T1 og CK2x induceret af CR i disse celler, hvor yderligere behandling med KCNQ10T1 siRNA undertrykte CR-medieret CK2ainduktion, hvilket indikerer KCNQ10T1 som en positiv regulator af CK2x under CR-betingelser. Derudover viste analyse med qPCR i realtid, at niveauet af miR-760 faldt med 70 procent under CR-forhold, hvorimod niveauerne af miR-186, miR-216b og miR{{22 }}p i CR-betingelser var uændrede eller øgede (figur 5B). Dernæst blev effekten af ​​miR-760 på CR-medieret CK2x-opregulering undersøgt. Behandling med en miR-760 efterligner suppresseoCR-medieret CK2x-opregulering, hvilket indikerer, at miR-760 er en væsentlig negativ regulator af CK2ain CR-tilstande (figur 5C). Endelig viste gPCR-analyse i realtid, at behandling med KCNO10T1 siRNA øgede niveauerne af miR-760, hvorimod CR undertrykte KCNO10T1 knockdown-medieret miR-760-induktion (figur 5D). Alt i alt indikerer disse resultater, at CR nedregulerede miR-760 ved at opregulere KCNQ10T1, hvilket resulterede i CK2x opregulering i humane cancerceller. Fordi det er blevet rapporteret, at lncRNA SNHG6 også fungerer som ensvamp af miR-760 i CRC-celler [25], blev det testet om CR opregulererSNHG6 udtryk. Imidlertid,SNHG6udtryk var uændret i CR-tilstanden (data ikke vist)

Figur 5. Kaloriebegrænsningstilstand (CR) opregulerede CK2x ved miR-760-nedregulering via KCNO10T1-opregulering i humane cancerceller. (A,C og D) HCT116- og MCF-7-celler blev transficeret med KCNO1{{20}}T1-siRNA (A og D) eller miR-760 (C) i 1,5 dage og derefter inkuberet under CR-betingelser i syv timer. (B) HCT116- og MCF-7-celler blev inkuberet under CR-betingelser i syv timer. (A,C) Niveauet af hvert mRNA blev bestemt ved RT-PCR under anvendelse af specifikke primere (øverst) Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist. 3-Actin blev brugt som en kontrolgraf til at repræsentere kvantificeringen af ​​hvert RNA i forhold til B-actin (nederst). (B,D) Total RNA blev isoleret fra celler og underkastet analyse ved qPCR ved anvendelse af RNU48 til normalisering for at bestemme de relative niveauer af de angivne miRNA'er. Data er vist som middelværdier plus SEM *y < 0,05.*p < 0,01;** * p < 0,001.

2.6. KCNQ1OT1 blev nedreguleret under replikativ senescens i humane lungefibroblastceller, hvilke CR-tilstande reddede

Da CK2x er nedreguleret i replikative senescerende celler og ældet væv [16] blev det undersøgt, om KCNO1OT1 er nedreguleret under senescens i humane lungefibroblast IMR-90-celler. KCNO10T1 knockdown reducerede mRNA-niveauet af CK2xin IMR-90-celler (figur 6A). Omvendt opregulerede KCNO1OT1 knockdown SA-P-gal aktivitet i IMR-90 celler, og ektopisk ekspression af CK2a ophævede induktionen af ​​SA-3-gal aktivitet medieret af KCNO1OT1 nedregulering (figur 6B). For at bestemme, hvordan KCNQ10T1-ekspression faldt ved replikativ senescens, blev IMR-90-celler passeret gentagne gange, indtil en senescenslignende tilstand blev observeret. De fleste celler ved PDL 47 farvede positivt for SA-B-gal, hvorimod kun få farvede positivt for SA-B-gal blandt tidlig-passage (PDL 34) celler (data ikke vist). Transskriptionsniveauerne af KCNO10T1 faldt med 60 procent i replikative senescerende celler (PDL 47) sammenlignet med tidlig passage (PDL 34) celler, hvilket indikerer, at KCNO10T1 blev nedreguleret under replikativ senescens. Endelig øgede CR-betingelser KCNO1OT1 med 150 procent i tidlig passage (PDL 34) celler sammenlignet med normale kalorieforhold. Imidlertid øgede CR-tilstande KCNO10T1 kraftigere (med 250 procent) i replikative senescentceller (PDL 47) sammenlignet med normale kalorieforhold. hvilket indikerer, at CR kan redde den reducerede ekspression af KCNO10T1 og CK2x, medieret af replikativ senescens (figur 6C). Samlet indikerer disse data, at replikativ senescens reducerer CK2x-ekspression via nedregulering af KCNQ10T1, og at CR kan undertrykke replikativ senescens via en KCNO1OT1-CK2-akse

Figur 6. KCNQ1011 blev nedreguleret under replikativ senescens i humane lungefibroblastceller, som var i stand til at blive reddet ved kaloriebegrænsning (CR)-betingelser. (A) IMR-90-celler (PDI36) blev transficeret med KCNO10T1-siRNA. Niveauet af hvert mRNA blev bestemt ved RT-PCR under anvendelse af specifikke primere (øverst). Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist3-Actin blev brugt som kontrol. Graferne repræsenterer kvantificeringen af ​​hvert mRNA i forhold til 6-aktin (nederst). (B) IMR-90-celler (PDL 36) blev transficeret med KCNO10T1-siRNA i to dage i fravær eller tilstedeværelse af pcDNA3.1-HA-CK2a. Celler blev farvet med 5-brom-4-chlor3-indolyl--D-galactosid, og repræsentative billeder blev opnået ved 20x forstørrelse (venstre) Skalalinje=100 um . Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist. Graferne repræsenterer procentdelen af ​​blåfarvede celler (højre). (C) IMR-90-celler af PDL 34 og PDL 47 blev inkuberet under CR-betingelser i syv timer. Niveauet af hvert mRNA blev bestemt ved RT-PCR under anvendelse af specifikke primere (venstre). Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist3-Actin blev brugt som kontrol. Graferne repræsenterer kvantificeringen af ​​hvert mRNA i forhold til 6-aktin (til højre). Data er rapporteret som middel 土 SEM.* p < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001. (D) Mulig model, der illustrerer rollerne af KCNO10T1 for senescens og CR. PDL, befolkningsfordoblingsniveau