Inaktivering af RPX1 i Arabidopsis giver modstand mod Plutella Xylosella gennem akkumulering af Homoterpen DMNT

Abstrakt

Lepidoptera afgrødeskadegøreren Plutella xylostella forårsager alvorlige begrænsninger for Brassica-dyrkning. Her rapporterer vi en ny rolle for RPX1 (resistens mod P. xylostella) i resistens over for dette skadedyr i Arabidopsis thaliana. rpx1‐1-mutanten frastøder P. xylostella-larverne, og fodring af rpx1‐1-mutanten beskadiger alvorligt den peritrofiske matrixstruktur i larvernes mellemtarm og påvirker derved larvernes vækst og forpopning negativt. Denne modstand skyldes akkumulering af forsvarsforbindelser, herunder monoterpen (3E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatrien (DMNT), på grund af opreguleringen af ​​PENTACYCLIC TRITERPENE SYNTHASE 1 (PEN1), som koder for en nøgle DMNT biosyntetisk enzym. P. xylostella-angreb og sår inducerer RPX1-proteinnedbrydning, hvilket kan give en hurtig respons på insektangreb. RPX1-inaktivering og PEN1-overekspression er ikke forbundet med negative afvejninger for plantevækst, men har meget højere frøproduktion end vildtypen i nærvær af P. xylostella-angreb. Denne undersøgelse tilbyder en ny strategi for plantemolekylær forædling mod P. xylostella.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

  SØGEORD

resistens mod skadedyr, sekundær metabolisme, flygtige emissioner

1|INTRODUKTION

Skadedyr reducerer ikke kun afgrødeudbyttet, men påvirker også kvaliteten af ​​afgrødeprodukter (Johnson & Züst, 2018; Wu et al., 2016; Zhao et al., 2016). Blandt dem er diamantmølen Plutella xylostella en vidt udbredt og skadelig lepidoptera-skadedyr, der lever af korsblomstrede afgrøder som blomkål og kål, hvilket forårsager enorme økonomiske tab. I øjeblikket inden for landbrugsforvaltning har skadedyrsbekæmpelse ved hjælp af agrokemikalier (f.eks. pesticider) været meget succesfuldt og stærkt anvendt, men denne tilgang er ved at blive problematisk på grund af potentiel miljøforurening og trusler mod menneskers sundhed (Shakeel et al., 2017). En alternativ tilgang til afgrødeproduktion er brugen af ​​gensplejsede afgrøder med øget resistens over for skadedyr, for eksempel i planteekspression af Bacillus thuringiensis (Jouzani et al., 2017) eller andre heterologe entomotoksiske proteiner (Douglas, 2018). Der er gjort en omfattende indsats for at identificere nye tilgange til bekæmpelse af P. xylostella i landbruget; effektive gener, naturlige pesticider og resistent kimplasma forbliver dog begrænset (Zhou & Jander, 2021). Gennem et konstant våbenkapløb med skadedyr har planter udviklet forskellige evner til at bekæmpe insektangreb. I overensstemmelse hermed syntetiserer planter rækker af defensive metabolitter såsom benzoxazinoider (Handrick et al., 2016; Varsani et al., 2019), methylbenzoat (Feng & Zhang, 2017) og serotonin (Lu et al., 2018) som svar på skadedyrsskade. Jasmonsyre (JA), også kaldet 'sårhormon', spiller en central rolle i forskellige sårrelaterede skadesreaktioner initieret af insektangreb (Lortzing & Steppuhn, 2016). Stigende beviser tyder på, at JA fungerer synergistisk og/eller antagonistisk med andre phytohormoner, såsom salicylsyre (SA) og ethylen (Costarelli et al., 2020; Ma et al., 2019). Ud over direkte forsvar frigiver planter, der er beskadiget af insektangreb, forskellige flygtige forbindelser, der tiltrækker planteædernes naturlige fjender (Gols, 2014). Af disse komplekse flygtige blandinger er homoterpenforbindelserne (3E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatrien (DMNT) og (E, E) -4,8,12-trimethyl-1,3,7, 11-tridecatetraene (TMTT) er blevet rapporteret i flere plantearter såsom Arabidopsis (Lee et al., 2010; Sohrabi et al., 2015), ris (Li et al., 2018), majs (Gouinguené et al., 2005) ; Richter et al., 2016) og bomuld (Liu et al., 2018). Adskillige undersøgelser har også indikeret, at DMNT fungerer som et signalmolekyle, der inducerer anti-planteædende forsvar under plante-plante-kommunikation (Arimura et al., 2000; Meents et al., 2019). For eksempel, efter at have pådraget sig skader fra tyggende insekter, udsender nogle søde kartofler DMNT, hvilket resulterer i systemisk induktion af proteaseinhibitoren forstuvning i nabosøde kartoffelplanter og gør dem ufordøjelige for insekter (Meents et al., 2019). Lignende resultater er blevet observeret for teplanter (Jing et al., 2020). For nylig fandt vi ud af, at DMNT spiller en rolle i at dræbe P. xylostella-larver ved at forstyrre den peritrofiske matrix (PM)-barriere i insektmidtarmen (Chen et al., 2021).

I højere planter er DMNT- og TMTT-biosyntesevejene blevet velkarakteriseret gennem omvendt genetik og biokemiske analyser. I majs produceres DMNT og TMTT fra den oxidative nedbrydning af (E)-nerolidol og (E,E)-geranyllinalool af to P450 monooxygenaser, CYP92C5 og CYP92C6 (Richter et al., 2016). I bomuld er to CYP-gener (GhCYP82L1 og GhCYP82L2) ansvarlige for omdannelsen af ​​(E)-nerolidol til DMNT og (E, E)-geranyllinalool til TMTT (Liu et al., 2018). I Arabidopsis-rødder katalyseres DMNT fra precursoren C30 triterpendiol, cannabidiol, af cytochrom P450 monooxygenase kodet af det rodspecifikke gen CYP705A1 (Sohrabi et al., 2015). En undersøgelse med gær som modelorganisme har fremlagt bevis for, at cannabidiol produceres ud fra 2,3-oxidosqualen af ​​cannabidiolsyntasen PEN1 (Xiang et al., 2006), og hvis ekspression er synergistisk forbundet med CYP705A1 (Sohrabi et al. ., 2015). Ikke desto mindre forbliver reguleringen af ​​nøglegenerne i DMNT-biosyntese stort set ukendt. RPX1-genet beskrevet i denne undersøgelse koder for et nyt cap-bindende protein (CBP), som er medlem af den eukaryote initieringsfaktor 4E (eIF4E) genfamilie. I planter består eIF4E-familien af ​​eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E og nCBP, som spiller væsentlige roller i initieringen af ​​cap-afhængig mRNA-translation (Rhoads, 2009). eIF4E-familiemedlemmerne er de primære kilder til recessiv resistens over for kartoffelvirus Y (PVY) - det mest skadelige patogen, der påvirker kartoffeludbyttet og -kvaliteten, og brugen af ​​CRISPR-Cas9-teknologi rettet mod eIF4E1-genet udvider kartoffelvirus Y-resistensspektret for Solanum tuberosum (Lucioli et al., 2022). Tilsvarende reducerer CRISPR/Cas9-medieret redigering af kassava eIF4E isoformer nCBP-1 og nCBP-2 sværhedsgraden og forekomsten af ​​symptomer forårsaget af cassava brown streak disease (Gomez et al., 2019). Desuden viser undersøgelser i Arabidopsis, at nCBP-mangel spiller en rolle i at begrænse celle-til-celle-bevægelsen af ​​plantevirus (Keima et al., 2017). Ikke desto mindre er nCBPs funktion i planteædende forsvar ikke blevet rapporteret. Her bruger vi en integrativ tilgang til funktionelt at karakterisere Arabidopsis-genet RPX1, som spiller en vigtig rolle i planteresistens over for P. xylostella. Vores resultater indikerer, at nedbrydningen af ​​RPX1 resulterer i differentielt udtrykte gener (DEG'er) og akkumulering af forbindelser. Et af de opregulerede gener er PEN1, som er nøglen til DMNT-biosyntese. Angreb af rpx1-mutanten og DMNT-akkumulering påvirker PM-strukturen af ​​P. xylostella og forårsager larveudviklingsdefekter og død. Yderligere beviser viser, at P. xylostella-angreb og sår inducerer RPX1-proteinnedbrydning, hvilket igen kan føre til planteresistens over for insekter.

2|MATERIALER OG METODER

2.1|Plantematerialer og vækstbetingelser

Arabidopsis frø blev bestilt fra Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC, http://Arabidopsis.info/). Frø blev overfladesteriliseret, sået på Murashige og Skoog (MS) medium og lagdelt ved 5 grader i et vækstkammer under en kort-dages fotoperiode (8 timer lys, 16 timer mørk) i 3 dage. De blev derefter overført til 22 grader i drivhuset under en lang dags fotoperiode (16 timer lys, 8 timer mørk) med normal plantevedligeholdelse.

2.2|Valg (præference) og no-choice eksperimenter og bioassays

P. xylostella æg blev købt fra Henan Jiyuan Baiyun Company (kat: HJB004, udviklet i 2009, formeret til videnskabelig forskning i et kontrolleret miljø) og inkuberet i et vækstkammer indstillet til 26 grader, 16 timer lys/8 timer mørkt. Til valgeksperimenter overførte vi 3 uger gamle Arabidopsis-planter (henholdsvis otte vildtype- og mutantplanter) til testtanke, der var forbundet til hver ende af glasreagensglasset, og de resterende eksperimentelle trin blev udført som tidligere beskrevet ( Chen et al., 2021). Larverne i fjerde fase blev brugt, og 15 larver blev inkluderet i hver eksperimentelle replikat.

Til no-choice eksperimentet blev 3 uger gamle vildtype og mutantplanter overført til separate og halvåbne petriskåle indeholdende det samme antal 15 s-instar P. xylostella larver. De efterfølgende trin blev udført som tidligere beskrevet (Chen et al., 2021).

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

2.3|Screening af resistente Arabidopsis-mutanter mod P. xylostella

Vi indsamlede 179 T-DNA-insertionsmutanter af Arabidopsis til P. xylostalle-resistensscreening. Mutanterne blev dyrket på MS-medium og transplanteret i P7-potter (størrelse: 7 × 7 cm) under langdags vækstbetingelser (22 grader, 16 timer lys/8 timer mørkt). For at undgå potentiel miljøpåvirkning flyttede og roterede vi potterne dagligt. Til den indledende mutantscreening opsatte vi to replikater ved at dyrke hver mutant i to potter med Col-0-planter som kontrol. Efter 2 ugers vækst efter transplantation blev alle mutanterne underkastet en præferencetest af P. xylostella-larver i tredje fase ved at sammenligne dem med Col-0, som beskrevet ovenfor. De mutanter, der viste forskellige larvepræferencer fra Col-0, blev betragtet som kandidat-resistente eller følsomme mutanter og blev udvalgt til yderligere eksperimentel validering og funktionelle undersøgelser.

2.4|Plasmidkonstruktion og gentransformation

For RPX1pro: RPX1-konstruktionen blev den genomiske kodende RPX1-region med en 1,6 kb opstrømssekvens og en 1 kb nedstrømssekvens PCR-amplificeret fra genomisk DNA ekstraheret fra Col-0. Det samlede DNA-fragment blev klonet ind i pGreenII-0179-vektoren og transformeret til rpx1-1-mutant ved anvendelse af floral dip-metoden (Clough & Bent, 1998). For at konstruere RPX1pro: RPX1-GFP, RPX1-promotor (1,6 kb), kodende region og 1 kb 3' utranslaterede sekvenser blev PCR-amplificeret fra Col-0 genomisk DNA. GFP-fragment blev amplificeret fra et plasmid indeholdende GFP-sekvenser. Disse DNA-fragmenter blev samlet i pGreenII-0179-vektoren ved hjælp af cut-and-ligation-metoden og derefter transformeret til en rpx1-1-mutant. For 35Spro: RPX1-FLAG-konstruktion blev RPX1-kodende sekvenser PCR-amplificeret fra cDNA revers-transskriberet fra Col-0 mRNA. PCR-fragmentet blev klonet ind i en pCambia1300-FLAG-vektor ved anvendelse af infusionsmetoden (Clontech) og transformeret til Col-0. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) og 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): De kodende sekvenser af disse gener blev PCR-amplificeret fra Col-0 cDNA'et og ligeret ind i pLGNL-35S vektoren. Et kunstigt mikroRNA (amiR) målrettet PEN1 blev designet som tidligere beskrevet (Schwab et al., 2006), amplificeret under anvendelse af plasmid pRS300 som skabelon og ligeret ind i en modificeret version af pCambia1300m vektoren. Alle primersekvenser er angivet i Understøttende oplysninger: Tabel S1.

2,5|Analyser af aktiviteten af ​​glutathion s-transferase (GST) og cytochrom P450 (CYP450) i P. xylostella larver

Efter at P. xylostella-larverne i andet stadium var blevet fodret med Col-0 eller rpx1-1 frøplanter i 72 timer, blev de opsamlet og malet til et fint pulver i flydende nitrogen. Assayene blev udført under anvendelse af GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, kat: A004) og CYP450 aktivitetsanalysesæt (Beijing Huabaitai Biology Company, kat: P450), i henhold til producentens instruktioner. Hvert assay havde tre biologiske replikater, og hvert replikat omfattede 30 P. xylostella-larver.

2,6|Smølfe-assays

Tre uger gamle Col-0 eller rpx1-1 frøplanter blev brugt til at fodre P. xylostella-larver i andet stadium. Assayet blev udført som tidligere beskrevet med mindre modifikationer (Chen et al., 2021). Seks biologiske replikater blev anvendt, og hvert replikat indeholdt 15 P. xylostella-larver.

2,7|Mikroskopisk observation af PM struktur af larver

Anatomianalyse af larve-PM-struktur og paraffin-tværsnitsanalyse af larvetarm blev udført som tidligere beskrevet (Chen et al., 2021).

2,8|Genekspressionsanalyse og transkriptom-sekventering (RNA-seq)

Col-{0}} og rpx1-1 frøplanter blev dyrket under en langdags vækstbetingelser (16 timer lys, 8 timer mørk) ved 22 grader. To uger gamle Col-0 og rpx1-1 frøplanter blev brugt til transkriptom-sekventering. Hver prøve indeholdt tre biologiske replikater. Total RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN, katalognummer: DP441). Førstestrengs cDNA'er blev syntetiseret ved omvendt transkription ved hjælp af One-Step RT-systemet (Takara Bio) i henhold til producentens instruktioner. qRT-PCR blev udført med de genspecifikke primere, der er anført i Understøttende oplysninger: Tabel S1 på et Roche Light Cycler 480-instrument. Konstruktionen og sekventeringen af ​​RNA-seq-biblioteker blev udført ved hjælp af Biomarker (Beijing, Kina) på en Illumina HiSeq-platform. Endelig brugte vi edgeR til at udføre differentiel ekspressionsanalyse (tærsklen for signifikant forskel blev sat:|log2foldchange|Større end eller lig med 1, p < 0,05). Tre biologiske replikater blev udført for Col-0 og rpx1-1, og de differentielt udtrykte gener er opført i Datasæt S1.

2,9|Ekstraktion og gaskromatografi og massespektrometri (GC-MS) analyse af DMNT og DMNT-2H i Arabidopsis

DMNT-ekstraktion og analyse blev udført som tidligere beskrevet med mindre modifikationer (Sohrabi et al., 2015). I analyserne blev 2 g 3 uger gamle Arabidopsis-frøplanter brugt til DMNT-ekstraktion og måling.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2,10|Udarbejdelse og karakterisering af DMNT

DMNT blev syntetiseret som tidligere beskrevet, med mindre modifikationer (HJ Huang & Yang, 2007). Kort fortalt blev en 500 ml rundbundet kolbe udstyret med en Teflon-belagt magnetisk omrørerstav fyldt med 1 g (6,48 mmol) allylalkohol og 50 ml dichlormethan. Opløsningen blev omrørt kraftigt og behandlet med 3,6 g aktiv mangandioxid, efterfulgt af tilsætning af 1-2 g oxidationsmiddel hver 2-3 time indtil afslutningen af ​​reaktionen. Produktet blev derefter anvendt til at generere den ønskede forbindelse via en forstærkningsreaktion. Strukturen og renheden af ​​DMNT blev bekræftet ved 1H nuklear magnetisk resonans (NMR) og 13C NMR spektroskopiske tilgange.

2.11|DMNT-behandling af P. xylostella

Analyserne blev udført i petriskåle dækket med klare plastikfilm med flere huller. DMNT blev fortyndet i paraffinolie (Sigma-Aldrich) til den ønskede dosis (2,5 nmol/L-25 μmol/L) og injiceret i foderet som beskrevet i teksten. Alle analyser blev udført i seks biologiske replikater, hvor hver replikat bestod af 15 larver. Larvevækst blev registreret ved fotografisk dokumentation. Foder injiceret med det samme volumen paraffinolieopløsningsmiddel blev anvendt som kontrol.

2.12|Måling af JA og SA indhold i Arabidopsis frøplanter

Analyserne blev udført af Nanjing Convinced-test Technology Company. To uger gamle Col-{{0}} og rpx1-1 frøplanter var inficeret med 15 s-instar P. xylostella larver, med ikke-inficerede frøplanter som kontrol. Vi placerede to larver på hver plante i angrebsgruppen for at sikre, at alle planter var angrebet. Efter 24 timer blev planteprøver indsamlet og hurtigt frosset i flydende nitrogen til JA- og SA-bestemmelse. Prøverne blev formalet til et fint pulver i flydende nitrogen og ekstraheret med en isopropanol-vand-saltsyre ekstraktionsopløsning, efterfulgt af tilsætning af 8 ul deutereret salicylsyre (D-SA) og dihydro jasmonsyre (2HJA) (1 ug) /ml hver) som interne standarder. Dichlormethan blev derefter tilsat, og opløsningen blev blandet godt på en rotator i 30 min. Efter at den nederste organiske fase var opnået ved centrifugering ved 13,{{1{20}}}} rpm i 5 minutter, blev den blæst tør med nitrogen, genopløst i methanol (0 0,1 % myresyre) og derefter centrifugeret ved 13,000 g i 10 min. Til sidst blev supernatanten filtreret gennem en 0,22 μm organisk filtermembran og analyseret ved højtydende væskekromatografi koblet med massespektrometri (HPLC-MS/MS). Alle ekstraktionstrinene blev udført ved 4 grader. Identiteten af ​​JA og SA blev bestemt baseret på spidsbelastningstiden for målstofferne og masse-til-ladning-forholdet (m/z) af de tilsvarende ioner. Kvantificeringen af ​​JA og SA blev tilpasset ved hjælp af en lineær regressionsligning opnået fra interne standardkurver. Til erhvervelsen af ​​den interne standardkurve blev SA- og JA-standardopløsninger med gradienter på 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 20, 50 og 200 ng/ml fremstillet under anvendelse af methanol (0,1 % myresyre) som opløsningsmiddel, og interne standardopløsninger med en slutkoncentration på 20 ng/ml blev tilsat til det aktuelle plot. Linearitetsanomalierne blev fjernet fra ligningerne for standardkurverne. JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936).

2,13|Analyse af DMNT-transport i Arabidopsis

DMNT blev opløst i DMSO og tilsat til MS-mediet uden glucose. Tre uger gamle Arabidopsis-planter blev overført til reagensglas, og deres rødder blev nedsænket i et MS-medium med DMNT eller DMSO (kontrol). For at forhindre kontaminering blev reagensglassene dækket med to lag parafilm, og der blev lavet et lille hul i filmen, hvorigennem planterødderne blev placeret i MS-medium for yderligere vækst. Efter 24 timer blev rødderne af de behandlede planter fjernet, og deres blade blev brugt til at fodre P. xylostella, og derefter blev larveoverlevelse og forpupningshastigheder analyseret. Det samme eksperiment blev gentaget med et vækstmedium indeholdende enten 2H-mærket DMNT eller DMSO som kontrol. Efter 24 timers inkubation blev blade opsamlet og behandlet til GC-MS-analyse. For at udelukke muligheden for, at DMNT kan fordampe fra DMNT-medium til luftdele og forårsage sporing af kontaminering, blev der på samme måde nedsat en kontrolgruppe, men planterødderne blev begravet med fugtigt bomuld og blev ikke nedsænket i DMNT-medium. Efter 24 timer blev luftdelene høstet til yderligere bioassay eller DMNT-detektion ved hjælp af GC-MS.

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

2,14|Proteinekstraktion og immunblottinganalyse af RPX1 i Arabidopsis efter P. xylostella-angreb og sårbehandlinger

Vi opretter to typer behandlinger på transgene RPX1pro: RPX1‐GFP og 35Spro: RPX1‐FLAG Arabidopsis frøplanter: P. xylostella angreb og sår. Til larveangreb dyrkede vi Arabidopsis-frøplanter i 2 uger og fodrede dem til larver i andet stadium (placer mindst en larve på hver frøplante), efter 15-120 minutter blev larverne fjernet, og de angrebne frøplanter blev udvalgt og høstet for yderligere eksperimenter. For at efterligne sår, brugte vi en nål af en 1 ml sprøjte til at skabe et hul i hvert Arabidopsis-blad. Efter 15-120 minutters vækst blev frøplanterne samlet.

For at bestemme, om P. xylostella-inficerede planter kunne inducere RPX1-nedbrydning, inficerede vi Col-0 frøplanter med P. xylostella i 15-12 0 min og testede dens indflydelse på RPX1-GFP i transgene planter. Alle prøverne blev malet til pulver i flydende nitrogen, og derefter blev lige store mængder af angrebet og ikke-inficeret Col-0 separat blandet med den samme mængde RPX1-GFP-væv og inkuberet i opløsning ved 4 grader i 15 minutter. Til sidst blev blandingen centrifugeret, og supernatanten blev underkastet immunoblotting-analyse. Til western blot-analyse blev totale proteiner ekstraheret med proteinekstraktionsbuffer [50 mmol/L Tris-HCl pH8.0, 2.5 mmol/L EDTA pH8.0, 150 mmol/L NaCl, 1/1000 IGPAL ( v/v), 10 % glycerol (v/v), 7 % 2‐mercaptoethanol (v/v), 1 mmol/L PMSF og 1×proteinasehæmmercocktail (Roche)]. Proteinekstraktet blev derefter brugt til PAGE-separation og immunblotting-analyse med antistoffer mod GFP (Roche, fortynding: 1/1000) og FLAG (Abcam, fortynding: 1/2000). Billeder blev taget ved hjælp af et Tanon 5200 kemiluminescensanalysesystem.

3|RESULTATER

3.1|Arabidopsis rpx1-mutanten har forbedret resistens over for P. xylostella

For at identificere gener involveret i P. xylostella-resistens indsamlede vi 179 Arabidopsis-mutanter og dyrkede dem i et kontrolleret drivhus. To uger efter transplantation udførte vi en præferencetest af P. xylostella-larver i tredje fase, som svar på hver mutant og vildtype Col-0. I dette screeningseksperiment viste 15 mutanter forskellige påvirkninger af larvepræference (data ikke vist), og en af ​​dem blev udvalgt til denne undersøgelse og betegnet som rpx1-1 (resistens mod P. xylostella). RPX1 koder for et nyt cap-bindende protein (nCBP) (Ruud et al., 1998). T-DNA-indsættelsesmutanten var SALK_131503, og genekspressionen af ​​RPX1 blev signifikant slået ned sammenlignet med vildtype Col-{10}} (figur 1a, understøttende information: figur S1a, understøttende information: tabel S1). Når de blev plantet i nærheden, viste rpx1-1-planterne et signifikant lavere niveau af skade fra P.xylostella-larver sammenlignet med vildtypeplanterne (understøttende information: Figur S1b).

FIGUR 1 Inaktivering af RPX1 giver resistens mod Plutella xylostella i Arabidopsis. (a) Genstruktur af RPX1 (At5g18110). Orange bokse angiver exoner, og fuldt optrukne linjer repræsenterer introner og utranslaterede områder. T-DNA-indsættelsen i SALK_131503, kaldet rpx1-1, er på den fjerde exon. (b) P. xylostella-larver bevæger sig fortrinsvis mod vildtype Col-0- og RPX1-komplementeringslinjerne (RPX1pro:RPX1/rpx1-1, RPX1com), sammenlignet med rpx1-1. (c) Sammenligning af Col- 0, rpx1‐1 og RPX1com blade inficeret med P. xylostella. (d) P. xylostella-larver blev alvorligt påvirket af rpx1-1 sammenlignet med dem på vildtype Col-0- og RPX1com-linjerne, hvad angår larvernes statur, størrelse og farve. (e, f) P. xylostella-larver fodret med rpx1‐1 viser højere dødelighed (e) og lavere forpupningsrater (f) i forhold til vildtype Col‐0- og RPX1com-linjerne. (g, h) P. xylostella-larver fodret med rpx1-1-planter har øget glutathion S-transferase (GST, g) og cytochrom P450 (CYP450, h) aktiviteter, hvorimod aktiviteterne i RPX1com-fodrede larver ikke viste nogen forskel fra de på Col-0. I (b, e–h) er data præsenteret som middel ± sem. De forskellige bogstaver ved hver behandling indikerer en signifikant forskel (en-vejs variansanalyse, n=3 for b, g, h, n {{ 36}} for e, f).

For at bestemme mekanismen, der ligger til grund for rpx1-1-resistens mod P. xylostella-angreb, udførte vi præference- og no-choice-tests. I præferenceforsøgene blev P. xylostella-larver placeret i midten af ​​glasreagensglasset i lige stor afstand fra Col‐0 og rpx1‐1 frøplanter, efter 10–6{{11} } min, signifikant flere larver samlet på Col-0-siden end dem på rpx1-1-siden (figur 1b). I no-choice eksperimenterne fodrede vi Col-0 og rpx1-1 frøplanter separat til P. xylostella larver og observerede, at Col-0 mistede mere bladvæv end rpx1-1 mutanten (figur 1c). For at bekræfte, at RPX1 var det forårsagende gen for den observerede resistens, introducerede vi en komplementeringskonstruktion af RPX1 i rpx1-1-mutanten. Disse RPX1-komplementeringslinjer (RPX1pro: RPX1/rpx1‐1, RPX1com) var modtagelige for P. xylostella-angreb, som bestemt af præference- og no-choice-tests (Figur 1b,c), som tyder på, at RPX1 er involveret i Arabidopsis-resistens over for P. xylostella.

3.2|Vækst af P. xylostella larver påvirkes negativt af rpx1‐1 mutationen

For at undersøge P. xylostellas fysiologiske respons på fodring med rpx1-1 mutanter, inspicerede vi udviklingen af ​​larver efter fodring med 3 uger gamle planter af Col-0, rpx1-1 og RPX1com linjer. Larverne, der blev fodret med rpx1-1-planter, viste en alvorlig kompromitteret udvikling med hensyn til kropsstørrelse. Larvernes kropsfarve var også forskellig fra den for larverne, der blev fodret med Col‐0 planter. Imidlertid observerede vi ikke sådanne ændringer i larverne fodret med RPX1com frøplanter (figur 1d). Yderligere fænotypisk analyse viste, at P. xylostella-larver fodret med rpx1-1 havde markant højere dødelighed og lavere forpupningsrater end dem, der blev fodret med Col-0 eller RPX1com (Figur 1e,f). Derudover udviste larver fodret med rpx1‐1 højere enzymatiske aktiviteter af GST og CYP450, som er biomarkører for organ- eller vævsskade (Cheng et al., 2018; Mikstacki et al., 2015) end dem på Col-0 og RPX1com (figur 1g, h), hvilket tyder på, at larvevævet kan blive beskadiget ved fodring af rpx1-1.

3.3|Mellemtarm af P. xylostella larver er beskadiget efter fodring med rpx1‐1 planter

Vi observerede, at rpx1‐1‐fodrede larver forbrugte færre plantevæv og producerede meget færre fæces end dem der blev fodret med vildtype Col‐0; derfor antog vi, at fordøjelsen af ​​larverne fodret med rpx1-1 kunne blive påvirket. For at kontrollere, om der skete lækage i tarmen på larverne, der blev fodret med rpx1‐1, udførte vi 'Smølfetesten'. Larverne fodret med vildtype Col-0- og RPX1com-linjer defecerede farvestoffet, og intet farvestof blev visuelt tilbage i kroppen af ​​larverne, hvorimod de rpx1-1-fodrede larver tilbageholdt en betydelig mængde farvestof i mellemtarm og det omgivende væv, og larverne blev blå (figur 2a). Kvantitativ analyse af blå ('Smølf') og normale ('ingen Smølf') larver viste, at fodring af rpx1-1-planter resulterede i, at mere end tre gange individer viste 'Smølf' sammenlignet med dem, der blev fodret med vildtype Col-{{ 14}} eller RPX1com (Figur 2b). Disse resultater tyder på, at fodring af rpx1-1 kan forårsage læsioner og højere permeabilitet i mellemtarmen af ​​larver.

3.4|Peritrofisk matrix af P. xylostella er beskadiget ved fodring af rpx1‐1 frøplanter

Vi dissekerede og isolerede yderligere peritrofisk matrix (PM) fra larverne fodret med Col-{0}}, rpx1-1 og RPX1com frøplanter til strukturel analyse under et stereomikroskop. Sammenlignet med den intakte og lodrette PM af larverne fodret med Col-0 og RPX1com, udviste larverne fodret med rpx1-1 skadekarakteristika og var tynde, løse og diskontinuerlige (figur 2c-f). For yderligere at bekræfte skadeegenskaberne for PM, opnåede vi tværgående sektioner af larveprøverne. Hæmatoxylin-eosin (HE) farvningsresultater afslørede, at PM af larverne fodret med Col-0 var tykke og intakte, og at der var et ektoperitrofisk rum (ES) mellem PM og midgut epidermale celler (figur 2g). I modsætning hertil var PM i mellemtarmen af ​​larverne fodret med rpx1‐1 alvorligt forstyrret, og tarmindholdet var tæt på tarmvæggen (nej, figur 2h). Når larverne blev fodret med RPX1com frøplanter, blev deres PM og ES ikke væsentligt ændret (figur 2i,j). Disse resultater bekræfter, at RPX1 knockdown skadede PM af P. xylostella larver.

3,5|Akkumulering af DMNT indhold i rpx1‐1 giver resistens mod P. xylostella larver

For at undersøge om nedbrydningen af ​​RPX1 omformer metabolitterne af Arabidopsis og fører til resistens mod P. xylostella larver, sammenlignede vi de flygtige organiske forbindelser (VOC'er) frigivet fra rpx1‐1 og vildtype Col‐0 planter. Fire VOC'er (Hexanol, 3-ethyl-5methyl, Octance, 2,6-dimethyl, Nonan, 2,6-dimethyl og DMNT) blev differentielt akkumuleret mellem rpx1-1 og Col-0 (figur 3a). For yderligere at dissekere den molekylære mekanisme af rpx1-1 i P. xylostella-resistens udførte vi RNA-seq-analyse. Sammenlignet med Col-0 udviste rpx1-1 mutanten 211 differentielt udtrykte gener (DEG'er) (understøttende information: Datasæt S1). KEGG-berigelsesanalyse indikerede, at disse DEG'er tilhørte mere end 20 forskellige metaboliske veje, inklusive sesquiterpenoid- og triterpenoidbiosyntese, alfa-linolensyremetabolisme og tyrosinmetabolismeveje (Figur 3b, Understøttende oplysninger: Tabel S2). Navnlig var den mest signifikant berigede vej biosyntesen af ​​sesquiterpenoider og triterpenoider, som bestod af tre DEG'er: At4g15340, At5g42600 og At5g48010 (Figur 3b, Understøttende information: Figur S2a-c). At4g15340 er blevet rapporteret at kode for PEN1, en oxidosqualencyclase, der omdanner 2,3-oxidosqualen til arabidiol og fører til syntesen af ​​bioaktivt DMNT via CYP705A1 (Field & Osbourn, 2008; Sohrabi et al., 2015). At5g42600 koder for mineralsyntase 1 (MRN1), som er en nøglekomponent i mineralbiosyntese. At5g48010 koder for thalianolsyntase (THAS), et enzym involveret i thalianolbiosyntese. Marneral og thalianol er blevet rapporteret at være involveret i vedligeholdelsen af ​​planteudvikling (Field & Osbourn, 2008; Go et al., 2012) (Supporting Information: Figur S3). Vi undersøgte de potentielle roller af MRN1 og THAS i insektresistens ved at undersøge præferencen, dødeligheden og forpupningsraten for P. xylostella ved at fodre dem med de transgene Arabidopsis-kimplanter, der overudtrykker MRN1 (35Spro: MRN1) og THAS (35Spro: THAS) (Supporting) Information: Figur S4a,b). Der blev ikke påvist nogen signifikant forskel mellem de to transgener og vildtype Col-0 (understøttende information: Figur S4c-n), hvilket tyder på, at insektresistensen af ​​rpx1-1 sandsynligvis ikke er afhængig af disse to gener.

FIGUR 2 RPX1-inaktivering beskadiger strukturen af ​​peritrofisk matrix (PM) i larvens mellemtarm. (a) Repræsentative billeder af larver fodret med Col-0-, rpx1-1- og RPX1com-linjer, der viser farvestofretention, som det fremgår af deres blå udseende, som Smurf-tegneseriefiguren. (b) Kvantificering af resultater er vist i (a). Data præsenteres som middel ± sem; de forskellige bogstaver indikerer en signifikant forskel (en-vejs variansanalyse, n=6). (c–f) PM-ultrastruktur af larver fodret med Col-0 (c), rpx1-1 (d) og RPX1com-linjer (e, f). Bemærk, at PM fra larver fodret med Col‐0 og RPX1com er fyldige og intakte, men PM af larver fodret med rpx1‐1 er tynde, delikate og diskontinuerlige i nogle regioner. (g–j) Tværsnit og hæmatoxylin-eosin-farvning viser beskadigelse af PM fra larverne fodret med Col-0 (g), rpx1-1 (h) eller RPX1com-linjer (i, j). [Farvefigur kan ses på wileyonlinelibrary.com]

Berigelsen af ​​terpenoidbiosyntese i KEGG-analyse (Figur 3b) og den differentielle akkumulering af DMNT påvist i rpx1-1 (Figur 3a) antydede, at DMNT kunne være en af ​​de forbindelser, der er involveret i planteresistens mod P. xylostella. I lighed med tidligere rapporter, der knap havde detekteret DMNT ved GC-MS-analyse i Col-0 (Liu et al., 2018; Sohrabi et al., 2015), vi kunne detektere spormængder af DMNT i ikke-inficeret Col-0 (figur 4a,b). I modsætning hertil var DMNT-niveauer stærkt beriget (~8 ng/g) i rpx1-1, og RPX1com-linjer viste meget lave niveauer af DMNT, svarende til det i Col-0-planter (figur 4). Efter P. xylostella-angreb steg DMNT-niveauerne (~20 ng/g) i rpx1-1, hvilket var højere end i Col-0- og RPX1com-linjerne (figur 4) . Vi syntetiserede DMNT in vitro ved hjælp af en modificeret metode (Chen et al., 2021). I overensstemmelse med tidligere observationer (Chen et al., 2021), undertrykte DMNT P. xylostella-vækst, som det fremgår af præference (2,5 μmol/L) og no-choice-ydelse (0,25-25 μmol/L) ( Understøttende oplysninger: Figur S5a,b). Desuden afslørede HE-farvningsresultater, at kontrollarvernes PM var tyk og intakt (understøttende information: figur S5c), hvorimod PM fra larver behandlet med 2,5 μmol/L DMNT i 48 timer var tynd og diskontinuerlig i nogle regioner (understøttende information: figur S5d). Samlet set tyder vores resultater på, at rpx1-1-mutationen forårsager DMNT-akkumulering, hvilket bidrager til drabet af P. xylostella-larver i Arabidopsis. JA og SA er plantesekundære metabolitter, der er tæt forbundet med biotisk stress. For at afgøre, om disse stoffer bidrager til insektresistensen af ​​rpx1‐1, kontrollerede vi JA- og SA-niveauerne af Col‐0 og rpx1‐1 før og efter angreb af P. xylostella. Under ubehandlede forhold var der ingen signifikant forskel i niveauerne af JA og SA mellem rpx1‐1 og Col‐0 planter (understøttende information: figur S6), og niveauerne af begge hormoner steg signifikant 24 timer efter angreb med P. xylostella . Navnlig efter angreb var SA-indholdet signifikant lavere i rpx1-1 sammenlignet med Col-0, hvorimod JA-indholdet var meget højere i rpx1-1 end i Col-0 (understøttende information: Figur S6).

FIGUR 3 Sammenligning af flygtige forbindelser og genekspression differentielt beriget mellem Col-0 og rpx1-1. (a) Differentielt berigede flygtige forbindelser i Col-0 og rpx1-1 blev påvist ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) metoden. Data præsenteres som middel ± sem; stjerner angiver en signifikant forskel (*p < 0.05, **p < 0.01, to-halet uparret t-test). (b) Transkriptomisk analyse af Col-0 og rpx1-1. KEGG-analyse af pathway-berigelse fra forskelligt udtrykte gener mellem Col-0 og rpx1-1 mutanten. En beriget vej (rød pil) er relateret til sesquiterpenoid og triterpenoid biosyntese og består af tre gener, som vist i figuren. [Farvefigur kan ses på wileyonlinelibrary.com]

3.6|RPX1 regulerer DMNT-akkumulering i afhængighed af PEN1

For at undersøge bidraget af PEN1 i rpx1-1-reguleret DMNT-akkumulering, genererede vi en konstruktion indeholdende et kunstigt miRNA (PEN1amiR) og transformerede det til rpx1-1-mutanter. Vi genererede også en PEN1-overekspressionskonstruktion, som blev transformeret til Col‐0 (35pro: PEN1/Col‐{{10}}). Genekspressionsanalyse viste, at PEN1 blev slået ned (4-7 gange) i PEN1amiR/rpx1-1 sammenlignet med rpx1-1 og blev overudtrykt (~2,5 gange) i 35Spro: PEN1 sammenlignet med Col-0 (Figur 5a). I disse transgene linjer blev ekspressionen af ​​RPX1 ikke påvirket af PEN1 knockdown eller overekspression (figur 5b). Når angrebet med P. xylostella i 6-24 timer, var PEN1-ekspression signifikant opreguleret i Col-0 og rpx1-1, og meget højere PEN1-ekspression blev opnået i rpx1-1 efter 24 timers infestation (figur 5c). . Dernæst målte vi DMNT-indhold i Col‐0, rpx1‐1, PEN1amiR/rpx1‐1 og 35Spro: PEN1/Col‐{{50}}. Uden P. xylostella-angreb producerede rpx1‐1 højere niveauer af DMNT end Col‐0 (figur 5d,e,f,k,l), og når PEN1 blev slået ned af kunstigt mikroRNA i rpx1‐1 (PEN1amiR /rpx1-1), blev DMNT-niveauer nedreguleret og udviste et meget lavere niveau end i rpx1-1 (figur 5d,g,h,m,n). Ved larveangreb var DMNT-niveauerne i Col-0 og rpx1-1 frøplanter signifikant opreguleret, men i PEN1amiR/rpx1-1 frøplanter kunne DMNT-niveauet ikke induceres og var meget lavere end i rpx1-1 (Figur 5d, g, h, m, n), hvilket tyder på, at PEN1 kan spille en vigtig rolle i RPX1-reguleret DMNT-biosyntese, som illustreret i understøttende information: Figur S3. I overensstemmelse hermed var DMNT stærkt akkumuleret i 35Spro: PEN1/Col-0 frøplanter (figur 5d, i,j,o,p).

FIGUR 4 Tab af RPX1 øger akkumulering af dimethyl-1,3,7-nonatrien (DMNT). (a) gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) analyse af DMNT i Col-0, rpx1-1 og RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1-1) linjer. DMNT-standarden er vist nederst. (b) Totalionkromatografi (TIC) af DMNT fanget fra Col-0, rpx1-1 og RPX1com. (c) DMNT-indhold stiger i rpx1-1-mutanten, men vender tilbage til vildtype-niveauer i RPX1com-transgene planter. Data præsenteres som middel ± sem; de forskellige bogstaver indikerer en signifikant forskel (en-vejs variansanalyse, n=3). [Farvefigur kan ses på wileyonlinelibrary.com]

3,7|PEN1 bidrager til at dræbe P. xylostella i rpx1‐1

I betragtning af den observation, at PEN1 knockdown kunne dæmpe DMNT-akkumuleringen induceret af RPX1-inaktivering (figur 5), udførte vi bioassays på PEN1 knockdown og overekspression transgen Arabidopsis for at demonstrere dens biologiske rolle. Vi fandt, at P. xylostella-larverne ikke viste nogen præference for amiR-PEN1/rpx1-1-planter sammenlignet med Col-0 (understøttende information: figur S7). I mellemtiden viste P. xylostella-larver fodret med PEN1‐amiR/rpx1‐1 signifikant lavere dødelighed og højere forpupningsrater end rpx1‐1, hvorimod larverne fodret med 35Spro: PEN1/Col‐0 viste højere dødelighed og lavere forpupning satser end dem, der blev fodret med Col‐0 (Figur 6a,b). I overensstemmelse med disse resultater viste yderligere 'smølfestest' og transektionsforsøg, at PEN1‐amiR/rpx1‐1 havde normale og intakte tarme og PM sammenlignet med larverne fodret med rpx1‐1 (figur 6c,d,g,h), og overekspression af PEN1 forårsagede alvorlig skade på mellemtarmen og PM af P. xylostella-larver (figur 6c,d, i,j). Disse resultater tyder på, at PEN1 knockdown kunne undertrykke de negative virkninger på larvevækst forårsaget af RPX1-inaktivering og derved spille en vigtig rolle i rpx1-1-induceret toksisk indflydelse på P. xylostella-larver.

3,8|DMNT transporterer fra rødder til luftdele af Arabidopsis 

PEN1 er blevet rapporteret at være hovedsageligt udtrykt i Arabidopsis-rødder (AC Huang et al., 2019; Sohrabi et al., 2015) (Supporting Information: Figur S8a), hvilket er forskelligt fra de resultater, som luftdelene af rpx1‐1 viste toksicitet over for P. xylostella på en PEN1‐ afhængig måde (figur 6). Derfor formulerede vi en alternativ hypotese: planter syntetiserer DMNT hovedsageligt i rødderne og transporterer det til luftens dele, hvor det fremmer resistens over for insekter. For at teste denne hypotese udførte vi to DMNT-transportassays. I det første assay (figur 7a) inkuberede vi rødderne af 3- 3-uger gamle Arabidopsis-frøplanter i et flydende plantevækstmedium indeholdende 2,5 μmol/L DMNT, ved at bruge DMSO som kontrol. Efter dyrkning i 24 timer skar vi Arabidopsis-bladene ud og tilbød dem til P. xylostella-larverne. Sammenlignet med DMSO-kontrollen forårsagede bladene fra DMNT-behandlede planter signifikant højere larvedødelighed og lavere forpupningsrater end kontrollen (figur 7b, c). I det andet eksperiment, der havde til formål at opnå yderligere uafhængig validering af DMNT-transport, mærkede vi DMNT med 2 H og tilsatte DMNT- 2 H til det flydende plantevækstmedium. Efter 24 timers inkubation var DMNT-2H stærkt beriget i bladene (figur 7d-i). For at udelukke muligheden for, at DMNT kan fordampe fra flydende vækstmedium til luften og forurene planternes luftdele, opstillede vi en parallel kontrol, som blev udført på samme måde som i figur 7a, bortset fra at Arabidopsis rødder ikke var nedsænket i væske vækstmedium. Resultaterne viste, at der ikke blev påvist DMNT- 2H i planternes luftdele (understøttende information: Figur S8b,c). Således foreslår vi, at DMNT flytter fra rødderne, hvor det produceres, til Arabidopsis-blade, hvor det forårsager skadedyrsdød.

FIGUR 5 PEN1 bidrager med en vigtig rolle i akkumulering af dimethyl-1,3,7-nonatrien (DMNT) i rpx1-1. (a) PEN1-ekspressionsanalyse i Col-0, rpx1-1, PEN1-knockdown i rpx1-1-baggrund (PEN1-amiR/rpx1-1) og PEN1-overekspression (35Spro:PEN1/Col-{{2{{ 22}}}}) linjer. (b) RPX1-udtryk i Col-{{30}}, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 og 35Spro:PEN1/Col-0. (c) PEN1-ekspression induceres af Plutella xylostella-angreb i Col-0 og rpx1-1. (d) Sammenligning af DMNT-akkumulering mellem Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 og 35Spro:PEN1/Col-0. (e–j) gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) analyse af flygtige stoffer udsendt fra Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) og 35Spro: PEN1/ Col‐0 (i, j) linjer. (k–p) TIC for DMNT fanget fra Col-0 (k), rpx1-1 (l), PEN1-amiR/rpx1-1 (m, n) og 35Spro: PEN1/Col-0 (o, p) linjer , svarende til dataene i (e–j). I (a–d) præsenteres data som middelværdi ± sem; de forskellige bogstaver indikerer en signifikant forskel (en-vejs variansanalyse, n=3). [Farvefigur kan ses på wileyonlinelibrary.com]

3,9|RPX1 nedbrydes af P. xylostella-angreb og sårbehandlinger

Vi viste, at PEN1-ekspression var opreguleret i rpx1-1- og Arabidopsis-frøplanter inficeret med P. xylostella-larver (figur 5a,c), hvilket øgede muligheden for, at RPX1 også kan reagere på larveangreb. For at validere denne forudsigelse undersøgte vi det potentielle respons af RPX1 på P. xylostella-angreb. Genekspressionsanalyse viste, at RPX1 blev udtrykt i forskellige væv (understøttende information: figur S9a), men havde ingen signifikant respons på 6-24 timers larveangreb (understøttende information: figur S9b). Derfor kontrollerede vi RPX1-proteinniveauer i RPX1pro: RPX1-GFP transgene planter ved at udføre immunblotting. Resultaterne viste, at uden larveangreb var RPX1-GFP stabil i 0-12{{40}} min; i modsætning hertil, efter angreb af larver i 15 minutter, begyndte RPX1-GFP at nedbrydes; efter 12 0 min. faldt RPX1-GFP-protein kontinuerligt til ca. 6 % af starttidspunktet (figur 8a, understøttende information: figur S10a). Som kontrol var GFP i Arabidopsis-frøplanter indeholdende GFP-transgen relativt stabilt efter larveangreb (figur 8b). For at udelukke den mulige indflydelse af GFP-mærket på RPX1-stabiliteten, genererede vi transgene RPX1-planter med et FLAG-mærke (35Spro: RPX1-FLAG) for at udføre larveangrebsforsøg, som viste konsistente resultater, at RPX1-FLAG også kunne nedbrydes af larver angreb, svarende til RPX1-GFP (figur 8c). Insektangreb forårsager ofte sår i planter, og fysisk skade kan delvist simulere fodringsprocessen for planteædende insekter. For at demonstrere, om sårdannelse kunne inducere RPX1-nedbrydning, brugte vi en nål til at skabe huller i planteblade for at efterligne sår og fandt ud af, at RPX1-GFP blev nedbrudt efter 3 0 minutters behandlinger (figur 8d, understøttende information: figur S10b). For bedre at forstå årsagen til RPX1-nedbrydning efter P. xylostella-angreb inkuberede vi vævene fra RPX1-GFP transgene planter sammen i opløsning i 15 minutter med Col-0, som var blevet angrebet af P. xylostella i 15-120 minutter , eller Col-0 væv uden angreb. Immunoblotting-analysen viste, at RPX1-GFP-niveauet fra prøverne inkuberet med præ-inficeret Col-0 var meget lavere end dem med ikke-inficeret Col-0 (figur 8e), hvilket tyder på, at P. xylostella-angreb inducerede nogle faktorer eller signaler i Col-0 der kan føre til RPX1-nedbrydning.

3,10|rpx1‐1 mutation giver en fordel i planteudvikling og reproduktion

Et fælles træk ved planteædende-specifikke forsvarsresponser er afvejningen mellem skadedyrsresistens og plantevækst og reproduktion (Li et al., 2018). For at bestemme, om genotypen på RPX1-locuset er genstand for sådanne afvejninger, sammenlignede vi frøproduktion i Col-{{10}}- og rpx1-1-mutanter. I fravær af P. xylostella-angreb var frøudbyttet pr. plante ens mellem de to genotyper (understøttende information: figur S11). I modsætning hertil reducerede udsættelse af 3-ugers gamle rpx1-1 og Col-0 planter for angreb af 15 s-instar P. xylostella i kun 72 timer det endelige frøudbytte af Col-0 med tre gange, mens frøudbyttet i rpx1‐1 var ikke signifikant påvirket. Desuden var frøudbyttet af RPX1com det samme som Col-0, men meget lavere end rpx1-1, hvilket tyder på, at RPX1-inaktivering giver en fordel i frøproduktion ved larveangreb (understøttende information: figur S11). Vi vurderede også frøproduktion i 35Spro: PEN1 transgen Arabidopsis og observerede, at overekspression af PEN1 producerede et højere frøudbytte under både larveinficerede og ikke-inficerede forhold (understøttende information: figur S11). Disse resultater tyder på, at rpx1-1-mutationen og højere PEN1-ekspression giver resistens mod P. xylostella i fravær af en typisk associeret vækstafvejning, hvilket fremhæver potentialet af RPX1 og PEN1 i molekylære avlsprogrammer, der sigter mod at forbedre afgrødeproduktionen.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

4|DISKUSSION

Skadedyr sænker dramatisk det agronomiske udbytte og kvalitet, hvilket gør plantebeskyttelse til et prioriteret og langsigtet mål for landmænd og avlere. I denne undersøgelse identificerede vi Arabidopsis-mutanten rpx1-1, som viste høj resistens over for P. xylostella, en vigtig lepidoptera-skadedyr af afgrøder. Vores analyse afslørede, at rpx1-1-mutation resulterede i højere PEN1-transkriptniveauer, DMNT-akkumulering og forbedret planteresistens mod skadedyr. Vi viste også, at RPX1-protein kunne nedbrydes ved larveangreb og sårbehandling.

FIGUR 6 PEN1 bidrager til den øgede modstand af rpx1‐1 mod Plutella xylostella. (a, b) PEN1-amiR-transgen lindrer signifikant resistensen af ​​rpx1-1 over for P. xylostella-angreb, mens 35Spro: PEN1 øger resistenseffekten, som vist ved dødelighed (a) og forpopnings (b)-rater af P. xylostella-larver . (c) Repræsentative billeder af larverne fodret med Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 og 35Spro: PEN1 frøplanter, der viser farvestofretention, som det fremgår af deres blå udseende, som Smurf-tegnefilmen Karakter. (d) Kvantificeringsresultater af billeder vist i (c). (e–j) Tværsnit og hæmatoxylin-eosin-farvning viser beskadigelse af PM fra larverne fodret med Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) og 35Spro: PEN1 frøplanter (i, j). Data præsenteres som middel ± sem; de forskellige bogstaver ved hver behandling indikerer en signifikant forskel i (a, b, d) (en-vejs variansanalyse, n=6). [Farvefigur kan ses på wileyonlinelibrary.com]

I no-choice-testene udviste rpx1-1-mutanten signifikant resistens over for P. xylostella-angreb (figur 1c). Omvendt viste P. xylostella larver fodret med rpx1‐1 planter alvorlige negative udviklingslidelser (figur 1d,e). Disse fænotyper kan tilskrives inaktiveringen af ​​RPX1, fordi RPX1 komplementeringslinjer (RPX1com) er lige så modtagelige som vildtypen Col-0 (Figur 1c-e), hvilket understøtter konklusionen om, at RPX1 er involveret i skadedyrsresistens. Ud over at dræbe larver havde rpx1‐1 mutanten også en langsigtet effekt på larveudviklingen, herunder forpupning (figur 1f), hvilket førte til reduceret reproduktion af skadedyret.

FIGUR 7 Dimethyl-1,3,7-nonatrien (DMNT) transporterer fra Arabidopsis-rødder til blade. (a) Illustration af DMNT-transportanalysen med Arabidopsis-kimplanter. DMNT blev opløst i Murashige og Skoog flydende medium. Efter en 24-times dyrkning blev rødderne skåret ud, og bladene blev brugt til at fodre Plutella xylostella-larver med henblik på dødelighed og forpupningshastighed. (b, c) DMNT, transporteret fra rødder til blade, resulterer i højere dødelighed (b) og lavere forpupningsrater (c) af P. xylostella-larver. (d–f) 2 H-mærket DMNT (DMNT- 2 H) transporteres fra rod til blade. DMNT-2H blev opløst i flydende MS-medium som i (a) i 24 timer, og derefter blev bladene høstet til GC-MS-analyse (e). DMSO blev anvendt som kontrol (d). DMNT‐ 2 H standard er vist som reference (f). (g–i) TIC for DMNT‐2H opnået under transportanalyserne vist i (d–f). Data præsenteres som middel ± sem, i (b, c) n=6 vises p-værdier ved siden af ​​histogramkolonnerne for at angive en signifikant forskel (to-halet uparret t-test). Bemærk, at flere kontroller til transportanalyserne er inkluderet i understøttende oplysninger: Figur S8. [Farvefigur kan ses på wileyonlinelibrary.com]

Ydermere indikerede præferencetest, at vildtype-Col-{{0}}- og rpx1-1-mutanterne kunne udsende forskellige flygtige forbindelser; en af ​​dem er DMNT, som er effektiv til at afvise skadedyr (figur 1b, 3a, understøttende information: figur S5a). Baseret på ovenstående resultater foreslår vi, at DMNT-akkumulering i rpx1‐1 er en af ​​årsagerne til insektforgiftning. JA- og SA-signalveje er blevet rapporteret at være involveret i insektresistens (Costarelli et al., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016). I denne undersøgelse, efter 24 timers insektfodring, steg indholdet af JA og SA i både Col-0- og rpx1-1-mutanter, og stigningen i SA-indhold i rpx1-1 var signifikant lavere end i Col-0, mens stigningen i JA-indhold var meget højere (Supporting Information: Figur S6), hvilket tyder på, at JA og SA også kan spille vigtige roller i rpx1‐1's modstand mod P. xylostella. Derfor foreslår vi, at både direkte og indirekte effekter af rpx1-1 bidrager til øget resistens af Arabidopsis mod insekter.

FIGUR 8 RPX1-proteinnedbrydning induceres af Plutella xylostella-angreb og sårbehandlinger. (a) RPX1-GFP fra RPX1pro: Transgene RPX1-GFP-planter nedbrydes ved P. xylostella-angreb i 15-120 min. (b) Som kontrol for (a) viser GFP selv fra 35Spro: GFP transgene planter ingen nedbrydning ved larveangreb. (c) RPX1-flag fra 35Spro: RPX1-flag transgene planter nedbrydes ved larveangreb. (d) RPX1-GFP fra RPX1pro: RPX1-GFP transgene planter nedbrydes af 15-120 min sårbehandling. (e) RPX1-GFP fra RPX1pro: RPX1-GFP transgene planter nedbrydes, når vævene inkuberes i opløsning med vævene fra Col-0 planter, der har været angrebet af P. xylostella i 15-120 min. Værdierne under immunblotting-bånd viser den relative proteinoverflod kvantificeret ved hjælp af ImageJ. Alle disse eksperimenter er blevet gentaget mindst tre gange, og repræsentative resultater er vist. Flere eksperimentelle data med uafhængige transgene linjer er vist i understøttende information: Figur S10. [Farvefigur kan ses på wileyonlinelibrary.com]

Vi præsenterer adskillige bevislinjer, der viser, hvordan PEN{{0}}-medieret DMNT-akkumulering bidrager til RPX1-funktioner i planteresistens over for P. xylostella. PEN1, et nøglegen, der tilhører sesquiterpenoid- og triterpenoid-biosyntesevejen, blev identificeret ud fra KEGG-analysen af ​​RNA-seq-data fra rpx1-1 mutant (figur 3b), hvilket giver et link mellem RPX1, PEN1 og DMNT (Sohrabi et al. , 2015). Til støtte for DMNT som en af ​​de forårsagende forbindelser, der dræber skadedyrslarver, akkumulerede DMNT højere i rpx1-1 mutanter end i Col-0 (Figur 3a), men niveauet i RPX1com-linjer blev vendt til Col-0 ( Figur 4a-c). Derudover kunne kemisk syntetiseret DMNT frastøde og dræbe P. xylostella-larver (understøttende information: figur S5a,b), hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af rpx1‐1 (figur 1b,e). Desuden producerede transgene planter, der overudtrykte PEN1, mere end fire gange af DMNT i Col-0 og bidrog tilsvarende resistens over for P. xylostella som rpx1-1 (figur 5d, i,j,o,p og 6).

Det er vigtigt, at reduktion af PEN1-transkriptniveauer i rpx1‐1 blokerer DMNT-biosyntese (figur 5d,g,h,m,n) og lindrer dræbende virkning på P. xylostella-larver, som er modtagelige for P. xylostella-angreb (figur 6a,b) ). Disse kombinerede resultater indikerer, at PEN1-mutationen kan undertrykke funktionen af ​​RPX1-inaktivering i skadedyrsresistens. RPX1-læsion forårsager højere PEN1-overflod (figur 5a), ikke desto mindre, hvordan nøjagtigt RPX1 regulerer PEN1 og medierer DMNT-biosyntese, kræver yderligere undersøgelser. Da RPX1 er forudsagt som et nyt cap-bindende protein, der tilhører eIF4E-familien (Rhoads, 2009; Ruud et al., 1998), er det muligt, at RPX1 kan påvirke PEN1 ved at påvirke dets mRNA-stabilitet eller proteintranslationseffektivitet, hvilket vil være en vigtig emne i fremtidig undersøgelse. Desuden skal det bemærkes, at DMNT-niveauer stadig kan induceres til et højere niveau af P. xylostella-angreb i rpx1-1-mutanten (figur 5d), hvilket tyder på, at der kan være nogle andre veje, der regulerer DMNT-akkumulering uafhængigt af RPX1. DMNT er blevet påvist i en lang række plantearter, såsom Arabidopsis (Sohrabi et al., 2015), bomuld (Liu et al., 2018) og majs (Richter et al., 2016). Derudover giver det indirekte beskyttelse mod planteædende skadedyr ved at tiltrække rovdyr, hvilket gør det muligt for planter at fjerne skadedyrstrusler (Kappers et al., 2005; Lee et al., 2010; Li et al., 2018). Vi har for nylig rapporteret, at det kunne frastøde og dræbe P. xylostella-larver ved at beskadige PM i larvens mellemtarm (Chen et al., 2021). Her fandt vi, at PM-strukturen kunne blive alvorligt beskadiget, når larverne blev fodret med rpx1‐1 eller PEN1 overudtrykkende frøplanter (figur 2c–j og 6i,j). Disse resultater er i overensstemmelse med resultaterne i de DMNT-behandlingseksperimenter, vi beskrev tidligere (Chen et al., 2021), hvilket igen understøtter forslaget om, at DMNT-akkumulering i rpx1‐1 kan være en af ​​de faktorer, der bidrager til frastødning af skadedyr og død. RPX1 tilhører eIF4E-genfamilien (Rhoads, 2009) og er involveret i celle-til-celle-bevægelsen af ​​plantevirus (Keima et al., 2017). Hvorvidt DMNT-akkumulering er forbundet med viral resistens i planter, er dog stadig uklart. PEN1 udtrykkes specifikt i Arabidopsis-rødder, hvor det katalyserer DMNT-biosyntese (Sohrabi et al., 2015).

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Konsekvent i denne undersøgelse opdagede vi høj PEN1-ekspression i rødderne og meget lav ekspression i bladene (understøttende information: figur S8a). Vi observerede, at rpx1-1-mutantens blade var toksiske for P. xylostella-larver (figur 1), hvilket tyder på, at akkumuleringen af ​​DMNT og den tilhørende skadedyrsresistens i blade ikke blot kan forklares med minimal PEN1-ekspression i disse væv. Meningsfuldt fandt vi, at DMNT kunne transporteres fra planterødder til luftdele, som vist ved DMNT-transportassays og GC-MS-analyse af bladekstrakter fra planterne inkuberet med DMNT-2H ved deres rødder (figur 7). Hvordan denne forbindelse transporteres i planter er uklart, og det kan være et emne for yderligere undersøgelse. Planter har evnen til at tolerere og bekæmpe insektangreb på forskellige måder. Ved at udføre immunoblotting-analyse af RPX1pro: RPX1-GFP og 35Spro: RPX1-FLAG transgene planter fandt vi her, at ved P. xylostella-angreb kunne RPX1-protein nedbrydes hurtigt (Figur 8a,c, Understøttende information: Figur S10a), hvorimod på mRNA-ekspressionsniveauet forblev RPX1 upåvirket (understøttende information: figur S9b). I øjeblikket er det stadig uklart, hvordan RPX1-protein nedbrydes, men vores data har primært antydet, at proteinnedbrydningsmekanismen kan være involveret i signalvejene for sår (figur 8d, understøttende information: figur S10b).

Desuden inducerede P. xylostella præ-inficeret Col-0 RPX1-GFP-nedbrydning i forskellige planter (figur 8e), hvilket tyder på, at P. xylostella-angreb kan forårsage en ophobning af signaler i planter, som igen kan føre til RPX1 nedbrydning. Det bliver interessant at finde ud af identiteten af ​​signalerne i fremtiden. Denne egenskab ved RPX1-nedbrydning er vigtig for planter, hvilket kan føre til DMNT-akkumulering og give en hurtig reaktion på skadedyrsbeskadigelse (understøttende information: Figur S3). Øget plantetolerance over for skadedyr kommer ofte på bekostning af fitness. Observationen af, at rpx1-1-mutationen fører til øget resistens (figur 1) og højere frøproduktion (understøttende information: figur S11) i Arabidopsis uden væsentlige afvejninger tilbyder en lovende vej til ingeniørafgrøder med højere skadedyrsresistens. For eksempel er genomredigering via CRISPR-Cas9 et kraftfuldt værktøj til afgrødeforbedring (Yang et al., 2017), der tillader introduktionen af ​​mutationer i RPX1 og potentielt udvider dets anvendelser til forskellige afgrøder.

REFERENCER

Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, W. & Takabayashi, J. (2000) Planteædende-inducerede flygtige stoffer fremkalder forsvarsgener i Lima-bønneblade. Nature, 406, 512-515.

Chen, C., Chen, H., Huang, S., Jiang, T., Wang, C., Tao, Z. et al. (2021) Flygtig DMNT beskytter planter direkte mod Plutella xylostella ved at forstyrre den peritrofiske matrixbarriere i insektmidtarmen. eLife, 10, e63938.

Cheng, X., Hu, J., Li, J., Chen, J., Wang, H., Mao, T., et al. (2018) Silkekirtelskaden og den transkriptionelle reaktion på afgiftende enzymrelaterede gener fra Bombyx mori under phoxim-eksponering. Chemosphere, 209, 964-971.

Clough, SJ & Bent, AF (1998) Floral dip: en forenklet metode til Agrobacterium-medieret transformation af Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 16, 735–743.

Costarelli, A., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, M. et al. (2020) Salicylsyre induceret af fodring af planteædere modvirker jasmonsyre-medieret planteforsvar mod insektangreb. Plant Signaling & Behavior, 15, e1704517.

Douglas, AE (2018) Strategier for øget afgrødebestandighed mod skadedyr. Årlig gennemgang af plantebiologi, 69, 637–660.

Feng, Y. & Zhang, A. (2017) En blomsterduft, methylbenzoat, er et effektivt grønt pesticid. Scientific Reports, 7, 42168.

Field, B. & Osbourn, AE (2008) Metabolisk diversificering-uafhængig samling af operonlignende genklynger i forskellige planter. Science, 320, 543-547.

Go, YS, Lee, SB, Kim, HJ, Kim, J., Park, HY, Kim, JK et al. (2012) Identifikation af mineralsyntase, som er afgørende for vækst og udvikling i Arabidopsis. The Plant Journal, 72, 791–804.

Gols, R. (2014) Direkte og indirekte kemiske forsvar mod insekter i en multitrofisk ramme. Plant, Cell & Environment, 37, 1741–1752.

Gomez, MA, Lin, ZD, Moll, T., Chauhan, RD, Hayden, L., Renninger, K., et al. (2019) Samtidig CRISPR/Cas9-medieret redigering af maniok eIF4E isoformer nCBP-1 og nCBP-2 reducerer sværhedsgraden og forekomsten af ​​cassava brown streak sygdomssymptomer. Plant Biotechnology Journal, 17, 421-434.

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA & Turlings, TCJ (2005) Antennale elektrofysiologiske reaktioner fra tre snyltehvepse på larve-inducerede flygtige stoffer fra majs (Zea mays), bomuld (Gossypium herbaceum) og cowpeaum (Vigna unguiculata). Journal of Chemical Ecology, 31, 1023-1038.

Handrick, V., Robert, CAM, Ahern, KR, Zhou, S., Machado, RAR, Maag, D. et al. (2016) Biosyntese af 8-O-methylerede benzoxazinoidforsvarsforbindelser i majs. Plantecellen, 28, 1682-1700.

Huang, AC, Jiang, T., Liu, YX, Bai, YC, Reed, J., Qu, B. et al. (2019) Et specialiseret metabolisk netværk modulerer selektivt Arabidopsis-rodmikrobiota. Science, 364, eaau6389.

Huang, HJ & Yang, WB (2007) Syntese af moenocinol og dets analoger ved hjælp af BT-sulfon i Julia-Kocienski-olefinering. Tetraederbreve, 48, 1429–1433.

Jing, T., Du, W., Gao, T., Wu, Y., Zhang, N., Zhao, M. et al. (2020) Herbivor-induceret DMNT katalyseret af CYP82D47 spiller en vigtig rolle i induktionen af ​​JA-afhængig planteæderresistens hos naboteplanter. Plant, Cell & Environment, 44, 1178-1191.

Johnson, SN & Züst, T. (2018) Klimaændringer og skadedyr: modstand er ikke nytteløst? Trends in Plant Science, 23, 367–369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: et vellykket insekticid med nye miljøegenskaber og nyheder. Applied Microbiology and Biotechnology, 101, 2691-2711.

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. & Bouwmeester, HJ (2005) Genteknologi af terpenoidmetabolisme tiltrækker livvagter til Arabidopsis. Science, 309, 2070-2072.

Keima, T., Hagiwara-Komoda, Y., Hashimoto, M., Neriya, Y., Koinuma, H., Iwabuchi, N., et al. (2017) Mangel på eIF4E isoformen nCBP begrænser celle-til-celle-bevægelsen af ​​et plantevirus, der koder for triple-gen-blok-proteiner i Arabidopsis thaliana. Scientific Reports, 7, 39678.

Lee, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. & Tholl, D. (2010) Herbivore-inducerede og florale monoterpenflygtige stoffer biosyntetiseres af et enkelt P450-enzym (CYP82G1) i Arabidopsis . Proceedings of the National Academy of Sciences, 107, 21205-21210.

Li, B., Förster, C., Robert, CAM, Züst, T., Hu, L., Machado, RAR, et al. (2018) Konvergent udvikling af en metabolisk skift mellem bladlus og larveresistens i korn. Science Advances, 4, eaat6797.

Liu, D., Huang, X., Jing, W., An, X., Zhang, Q., Zhang, H. et al. (2018) Identifikation og funktionel analyse af to P450-enzymer af Gossypium hirsutum involveret i DMNT- og TMTT-biosyntese. Plant Biotechnology Journal, 16, 581-590.

Lortzing, T. & Steppuhn, A. (2016) Jasmonatsignalering i planter former plante-insektinteraktionsøkologi. Current Opinion in Insect Science, 14, 32-39.

Lu, H., Luo, T., Fu, H., Wang, L., Tan, Y., Huang, J., et al. (2018) Resistens af ris over for insektskadedyr medieret af undertrykkelse af serotoninbiosyntese. Naturplanter, 4, 338–344.

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. & Tavazza, M. (2022) CRISPR-Cas9-målretning af eIF4E1-genet udvider kartoffelvirus Y-resistensspektret af Solanum tuberosum L. cv. ønske. Frontiers in Microbiology, 13, 873930.

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. & Miao, X. (2019) Ny krydstale mellem ethylen- og jasmonsyre-pathway-responser på et piercing-sugende insekt i ris. Ny Phytologist, 225, 474-487.

Meents, AK, Chen, SP, Reichelt, M., Lu, HH, Bartram, S., Yeh, KW et al. (2019) Flygtig DMNT inducerer systemisk jasmonat-uafhængigt direkte anti-planteædende forsvar i blade af sød kartoffel (Ipomoea batatas) planter. Scientific Reports, 9, 17431.

Mikstacki, A., Zakerska-Banaszak, O., Skrzypczak-Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. & Slomski, R. (2015) Glutathion S-transferase som toksicitetsindikator i generel anæstesi: genetik og biokemisk funktion. Journal of Clinical Anesthesia, 27, 73–79.

Rhoads, RE (2009) eIF4E: nye familiemedlemmer, nye bindende partnere, nye roller. Journal of Biological Chemistry, 284, 16711–16715.

Richter, A., Schaff, C., Zhang, Z., Lipka, AE, Tian, ​​F., Köllner, TG et al. (2016) Karakterisering af biosyntetiske veje til produktion af de flygtige homoterpener DMNT og TMTT i Zea mays. Plantecellen, 28, 2651–2665.

Ruud, KA, Kuhlow, C., Goss, DJ & Browning, KS (1998) Identifikation og karakterisering af et nyt cap-bindende protein fra Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry, 273, 10325-10330.