Identifikation af ACOT13 og PTGER2 som nye kandidatgener for autosomal dominant polycystisk nyresygdom gennem hel eksomsekvensering

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Na Du¹, Dan Dong³, Luyao Sun¹, Lihe Che¹, Xiaohua Li¹, Yong Liu^2*†og Bin Wang^1*†

Abstrakt

Baggrund:Autosomal dominant polycystisknyresygdom (ADPKD) er den mest almindelige monogenenyresygdom. Halvdelen af ​​patienterne ville langsomt udvikle sig til nyresygdom i slutstadiet. Det potentielle mål for ADPKD-behandling mangler dog stadig.

Metoder:FireADPKDpatienter og to raske familiemedlemmer blev inkluderet i denne undersøgelse. De perifere blodprøver blev opnået og testet ved hel-eksom-sekventering (WES). De autosomale mutationer i ADPKD-patienter blev bibeholdt som kandidatsteder. Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) berigelse og protein-protein interaction network (PPI) analyser blev udført af cluster roller R-pakke. Et datasæt indeholdende 18 ADPKD-patienter og tre normale prøver blev downloadet fra Gene Expression Omnibus (GEO)-databasen og analyseret ved hjælp af limma R-pakken.

Metoder:FireADPKDpatienter og to raske familiemedlemmer blev inkluderet i denne undersøgelse. De perifere blodprøver blev opnået og testet ved hel-eksom-sekventering (WES). De autosomale mutationer i ADPKD-patienter blev bibeholdt som kandidatsteder. Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) berigelse og protein-protein interaction network (PPI) analyser blev udført af cluster roller R-pakke. Et datasæt indeholdende 18 ADPKD-patienter og tre normale prøver blev downloadet fra Gene Expression Omnibus (GEO)-databasen og analyseret ved hjælp af limma R-pakken.

Konklusioner:Gennem en kombination af WES, genekspression og PPI netværksanalyser identificerede vi ACOT13 og PTGER2 som potentielleADPKD-relaterede gener.

Nøgleord:Hel exome sekventering, genmutationer, polycystisknyresygdom, ACOT13, PTGER2

Cistanche tubulosa forebygger nyresygdom, klik her for at få prøven

Introduktion

Polycystisknyresygdom (PKD) er en gruppe af monogene lidelser og er den almindelige årsag til nyresygdom i slutstadiet. De fleste voksne patienter er ramt af den autosomale dominante form (ADPKD), mens den autosomale recessive polycystiskenyresygdom (ARPKD) er en sjældnere form, der normalt viser sig perinatalt eller i den tidlige barndom [1]. Mutationer i PKD1 og PKD2, som koder for polycystin 1 og 2 (PC1 og PC2) proteiner, er de mest almindelige årsager til ADPKD. PC2, en kationkanal, er medlem af transient receptor potential (TRP) familie af ionkanaler [2]. Det blev rapporteret, at defekter i PKD2 udløser ændringer i mitokondriel energimetabolisme [3]. rollerne af PC1 og PC1PC2 kompleks er dårligt forstået [4]. Selvom PKD nedarves monogent, er det heterogent i fænotype, gen og allel [1], og 7 procent afADPKDfamilier er genetisk uafklarede [5]. Desuden er de molekylære mekanismer, der ligger til grund fornyredysfunktionsom følge af mutationer i PKD-gener og de fysiologiske funktioner af polycystinproteiner er også stadig uklare [6].

1 og 2 (PC1 og PC2) proteiner er de mest almindelige årsager til ADPKD. PC2, en kationkanal, er medlem af transient receptor potential (TRP) familie af ionkanaler [2]. Det blev rapporteret, at defekter i PKD2 udløser ændringer i mitokondriel energimetabolisme [3]. rollerne af PC1 og PC1PC2 kompleks er dårligt forstået [4]. Selvom PKD nedarves monogent, er det heterogent i fænotype, gen og allel [1], og 7 procent af ADPKD-familier er genetisk uopløste [5]. Desuden er de molekylære mekanismer, der ligger til grund for nyredysfunktionen som følge af mutationer i PKD-gener og de fysiologiske funktioner af polycystinproteiner, også stadig uklare [6].

Her udførte vi WES ved hjælp af blodprøver fra fire ADPKD-patienter og to raske familiemedlemmer til at analysere deres geners variation. Derudover blev et genekspressionsdatasæt indeholdende 18 ADPKD-patienter og tre normale prøver opnået fra Gene Expression Omnibus-databasen (GEO). Gennem integrerede analyser af genmutation, genekspression, genfunktionsberigelse og protein-protein-interaktion (PPI) identificerede vi to gener (ACOT13 og PTGER2), der potentielt var forbundet med patogenesen af ​​ADPKD.

Materialer og metoder

Klinisk information

Denne undersøgelse blev godkendt af den lokale etiske komité (godkendelsesnummer: 2019-307). En ADPKD-patient blev behandlet på vores hospital, og fem medlemmer af denne familie blev inkluderet i denne undersøgelse. Denne patient havde en historie med polycystisknyre sygdom, polycystisk leversygdom og nyresten i 13 år (Yderligere fil 1: Tabel S1). Stamtavlen for denne familie er vist i fig. 1A. Te N_2 var denne proband. Te N_4, N_5 og N_6 var alle ADPKD-patienter (sort), hvorimod N_3 og N_1 var raske mennesker (hvide) . I alt var der fire ADPKD-patienter og to raske kontroller i vores undersøgelse. De kliniske symptomer på denne proband omfattede feber, rygsmerter og hæmaturi. Computertomografi (CT) undersøgelse af N_2 afslørede flere cyster i leveren og bilateral polycystisk nyre. Nogle læsioner var komplekse cyster med ændringer i den højre perirenale ekssudation, der havde slørede konturer og øget tæthed (fig. 1B).

Hel exome-sekventering

Genom-DNA'et blev ekstraheret fra perifere blodprøver ved hjælp af et DNA-ekstraktionssæt (Tiangen Biotech, Beijing, Kina), og exomerne blev fanget ved hjælp af Agilent SureSelect Human All Exon V6-kittet (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i henhold til instruktionerne af sættene. Hel-eksom-sekventering blev udført ved hjælp af Illumina Novaseq6000-instrumenterne med parret-ende 150-bp-sekventeringslæsninger. Rå sekventeringslæsninger blev forbehandlet for at fjerne baser af lav kvalitet og læsninger ved hjælp af hurtig [11], en ultrahurtig alt-i-en FASTQ præprocessor, og standardparametrene blev overtaget. Sekvenslæsningerne blev justeret til det humane genom (Build-UCSC hg19) ved hjælp af BWA (Burrow–Wheeler Aligner, http://bio-bwa.sourceforge.net/) softwaren. Ti, enkelt nukleotid polymorfi (SNP) og insertion/deletion (Indel) blev identificeret med SAMtools softwaren (http://samtools.sourceforge.net/). Ved hjælp af ANNOVAR-softwaren (http://annovar.openbioinformat ics.org/en/latest/user-guide/download/) blev der udført funktionel annotering for den identificerede SNP og Indel for at undersøge deres genomiske placeringer og variationsoplysninger (Yderligere fil 2 : Tabel S2).

Screening af kandidat SNP/Indel for ADPKD

Vi fjernede først mutationer med frekvenser højere end 1 procent i mindst én af de fire databaser (1000g_all, esp6500si_all, gnomAD_ALL og gnomAD_ EAS). Ti mutationer i exoniske eller splejsningspositioner (10 bp opstrøms og nedstrøms for exonet) blev bibeholdt. Små fragmenter (<10 bp)="" non-frameshifting="" indel="" mutations="" in="" the="" repeat="" region="" were="" also="" removed.="" in="" addition,="" mutations="" that="" met="" one="" of="" the="" following="" conditions="" were="" retained:="" (a)="" te="" sites="" that="" were="" considered="" as="" harmful="" by="" at="" least="" half="" of="" the="" four="" software="" sift="" [12],="" polyphen="" [13],="" mutationtaster="" [14],="" and="" cadd="" [15]="" basing="" on="" the="" scores;="" (b)="" mutations="" that="" were="" predicted="" to="" affect="" the="" splicing="" by="" dbscsnv="" [16].="" ten,="" the="" genetic="" mutations="" that="" were="" classified="" into="" pathogenic="" and="" likely="" pathogenic="" ones="" according="" to="" the="" criteria="" and="" guidelines="" for="" grading="" clinical="" significance="" of="" single-gene="" mutations="" of="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" and="" genomics="" (acmg,="" https://www.acmg.net/)="" were="" selected="" as="" candidate="" sites.="" for="" the="" screening="" of="" dominant="" genetic="" pattern,="" on="" the="" basis="" of="" mutation="" site="" filtering,="" the="" sites="" showing="" autosomal="" mutations="" in="" adpkd="" patients,="" which,="" however,="" could="" not="" be="" detected="" in="" normal="" controls="" were="" retained="" as="" candidate="">

Funktionel berigelse og PPI analyser

mRNA-ekspressionsprofildataene for GSE7869 [18] blev downloadet fra GEO-databasen (https://ncbi.nlm. nih.gov/geo), som blev detekteret baseret på Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array . GSE7869-datasættet indeholdt 18 ADPKD-prøver og tre normale prøver. mRNA-ekspressionsprofildataene blev analyseret ved hjælp af limma-funktionspakken i R [19]. Differentielt udtrykte gener (DEG'er) blev udvalgt under anvendelse af tærsklerne for absolut værdi af differentiel ekspression (|Log2FC|) > 0.5 og P-værdi <>

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført under anvendelse af R-software v3.5.2. P-værdi < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="" signifikant="" i="" alle="" statistiske="">

Results

Mutatipåal landscape

Det samlede antal SNP'er i de seks prøver var koncentreret mellem 100,000 og 150,000, og de var hovedsageligt placeret i intronregionen, exonregionen og intergenregionen (fig. 2A). Det samlede antal Indels i de seks prøver var koncentreret mellem 15,000 og 20,000, og disse Indels var hovedsageligt fordelt i intron- og intergenområdet (fig. 2B). Vi udforskede derefter landskabet af mutationer, der var placeret i den kodende region. Som følge heraf inkluderede SNP'erne for seks prøver i den kodende region hovedsageligt anonyme, missense og stop-loss mutationer, hvis kumulative antal var næsten 21,000 (fig. 2C). Indelserne af seks prøver i kodningsregionen bestod hovedsageligt af nonframeshift_sletning og nonframeshift_indsættelse (fig. 2D)

Potentielle mutationer og gener for ADPKD

Seks mutante gener, herunder AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 og ADAM21, blev screenet ved hjælp af det dominerende genetiske mønster. De var heterozygot muterede i ADPKD-prøver, men ikke muterede i normale prøver. De fleste af disse gener er ikke blevet rapporteret at være relateret til forekomsten af ​​ADPKD. I mellemtiden blev 19 gener også udvalgt i henhold til mutationens skadelighed, herunder MUTYH, USH2A, HBS1L, GLI3, SBDS, SND1, ABCA2, RPS6KA4, FLVCR1, ATIC, SCN11A, ATP6V1A, GLRA1, PRMT8, PKD1CF, INSL5, PKD, CF, INSL og GPR143. For at studere forholdet mellem disse genmutationer og ADPKD analyserede vi først virkningerne af genmutationer på proteiner. Følgelig havde alle disse gener mindst én mutation, der kunne påvirke kodningen af ​​protein, hvilket indikerer de potentielle roller af disse mutationer (tabel 1).

Betydeligt berigede KEGG-veje og GO-termer for potentielle ADPKD-relaterede gener

Resultaterne af GO- og KEGG-berigelsesanalyser af de 25 potentielle gener forbundet med ADPKD er vist i fig. 3A (biologisk proces), fig. 3B (cellulær komponent), fig. 3C (molekylær funktion) og fig. 3D (KEGG). . GO-analyse viste, at disse 25 gener var signifikant beriget i de biologiske processer (BP) af cellulær proces med en enkelt organisme og respons på stimulus, cellekomponenter (CC) af plasmamembranen og celleperiferien og molekylær funktion (MF) af anionbinding. Derudover afslørede KEGG pathway-analysen, at disse 25 gener hovedsageligt var beriget i cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) signalveje og veje i cancer.

ACOT13 og PTGER2 kan være kandidatgener forbundet med ADPKD

PPI-netværksanalysen blev udført for at udforske sammenhængen mellem de 25 potentielle ADPKD-relaterede gener. Som vist i fig. 3E var de fleste af disse gener uafhængige i netværket. ACOT13 havde direkte interaktion med både SBDS og ATIC; PTGER2, ADCY4 og INSL3 blev forudsagt at interagere med hinanden (fig. 3E). Hvad mere er, ACOT13, PTGER2 og ADCY4 var gener, der kun muterede hos ADPKD-patienter. , baseret på ekspressionsdataene, der blev downloadet fra GEO-databasen, sammenlignede vi ekspressionsniveauerne for ACOT13, PTGER2 og ADCY4 mellem ADPKD-patienterne og de normale kontroller. Sammenlignet med de normale kontroller var ekspressionsniveauet af ACOT13 signifikant lavere hos ADPKD-patienter (fig. 4A), mens PTGER2 viste et højere ekspressionsniveau hos ADPKD-patienter (fig. 4B). ADCY4 udviste ikke signifikant ekspressionsforskel mellem ADPKD-patienter og normale prøver (fig. 4C). Ved at kombinere informationen spekulerede vi i, at ACOT13 og PTGER2 kunne være kandidatgener forbundet med ADPKD.

Diskussion

ADPKD er forårsaget af en mutation i et af to gener -78 procent af tilfældene er forårsaget af en mutation i PKD1 på kromosom 16 og 15 procent af tilfældene er forårsaget af en mutation i PKD2 på kromosom 4 [20]. Cystiske nyresygdomme er også blevet kaldt ciliopatier. Te PC1- og PC2-proteiner, kodet af PKD1 og PKD2, er begge placeret på de primære cilia og fungerer som flowsensorer i nyren [21]. I denne undersøgelse blev den skadelige mutation i PKD1, såvel som andre 18 kendte skadelige gener, påvist i prøverne af ADPKD-patienter. Desuden blev seks mutanter, inklusive AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 og ADAM21, screenet ved hjælp af det dominerende genetiske mønster, og de fleste af dem var ikke tidligere blevet anerkendt som ADPKD-relaterede patogene gener.

De patogene proteiner i ADPKD er hovedsageligt ansvarlige for at overføre information fra det ydre miljø til cellerne [22]. Vi analyserede de potentielle funktioner af de 25 identificerede gener ved GO- og KEGG-berigelsesanalyser. Resultaterne viste, at BP'erne af den cellulære proces med en enkelt organisme, respons på stimulus, såvel som CC'er af plasmamembranen og celleperiferien var signifikant beriget. Desuden kan ADPKD-celler skifte deres energiproduktionsmåde fra oxidativ fosforylering til andre veje, og disse ændringer i cellemetabolisme er dukket op som et kendetegn for ADPKD [6]. Ændringerne i moduleringen af ​​energiproduktion og udnyttelse i ADPKD er afhængige af flere indre cellulære signalveje, såsom AMP-aktiveret proteinkinase (AMPK), calciumsignalering ved mitokondrier-associerede membraner, pattedyrmål for rapamycinkompleks 1 (mTORC1), cAMP og cystisk fibrose transmembrankonduktansregulator (CFTR)-medieret iontransport [23, 24]. Her blev cAMP-signalvejen identificeret som den signifikant berigede i disse ADPKD-prøver. Disse resultater understøtter pålideligheden af ​​de mutationer, vi screenede. I mellemtiden, på trods af, at funktionel information delvist blev afsløret ved berigelsesanalyse, fortjente flere detaljer om de 25 identificerede gener yderligere udforskning i ADPKD i fremtiden.

Te PPI og differentielle ekspressionsanalyser indikerede, at sammenlignet med normale mennesker, var ACOT13 og PTGER2 muterede og differentielt udtrykt i ADPKD-patienter og kunne være de potentielle gener forbundet med ADPKD. ACOT13-protein er et medlem af acyl-CoA-thioesteraser (Acts)-enzymer, som katalyserer reaktionen af ​​hydrolyse af fedt-acyl-CoA-molekyler til frie fedtsyrer plus CoASH. ACOT13 er beriget i oxidativt væv og er forbundet med mitokondrier [25]. Lin et al. rapporterede, at PC1 påvirkede mitokondriers morfologi og funktion, hvilket kan spille en nøglerolle i regulering af mitokondriefunktion og cellulær metabolisme [26]. Så vidt vi ved, har der ikke været rapporter om forholdet mellem ACOT13 og ADPKD. Ekspressionen af ​​PTGER2 påvirker den biologiske adfærd af forskellige typer af ondartede tumorer [27-29], som burde være relateret til berigelsen af ​​veje i cancer i KEGG-analyse. Ellers er prostaglandin E (2) (PGE2) rolle i cystogenese i genetisk ikke-ortologe modeller af ADPKD allerede blevet undersøgt. Liu et al. fandt, at PGE2 kunne aktivere de afvigende signalveje i PC--1-deficiente epitel og mediere proliferation og chloridsekretion i ADPKD cystisk nyreepitel [30]. Elberg et al. har indikeret PTGER2's rolle i medieringen af ​​PGE2-effekten på at inducere dannelsen af ​​cysten gennem kombinerede biokemiske, farmakologiske og funktionelle analyser i ADPKD [31]. Dette bekræfter yderligere pålideligheden af ​​vores tilgang til screening af patogene gener i ADPKD, som kan være anvendelig i andre sygdomme. Det understøtter også indirekte pålideligheden af ​​ACOT13 som et potentielt ADPKD-relateret gen. Den underliggende biologiske funktion af ACOT13 i ADPKD berettiger dog stadig yderligere undersøgelser.

Konklusioner

I denne undersøgelse identificerede vi to potentielle ADPKD-relaterede gener, herunder ACOT13 og PTGER2, ved at analysere WES-resultaterne fra fire ADPKD-patienter og to raske familiemedlemmer kombineret med genekspressionsdata fra GEO-databasen. Vores resultater kan være nyttige for yderligere undersøgelser af de underliggende patologiske årsager til ADPKD. Men på grund af det lille antal patienter i vores undersøgelse, er der stadig en vis usikkerhed om den potentielle rolle af ACOT13 og PTGER2, hvilket stadig berettiger yderligere undersøgelser.

Referencer

1. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, Horie S, Peters DJM, Torres VE. Polycystisk nyresygdom. Nat Rev Dis Primere. 2018;4(1):50. https://doi. org/10.1038/s41572-018-0047-y.

2. Grieben M, Pike AC, Shintre CA, Venturi E, El-Ajouz S, Tessitore A, Shrestha L, Mukhopadhyay S, Mahajan P, Chalk R, et al. Struktur af den polycystiske nyresygdom TRP-kanal Polycystin-2 (PC2). Nat Struct Mol Biol. 2017;24(2):114–22.

3. Chumley P, Zhou J, Mrug S, Chacko B, Parent JM, Challa AK, Wilson LS, Berryhill TF, Barnes S, Kesterson RA, et al. Afkortning af PKHD1 og

PKD2-mutationer ændrer energimetabolismen. Am J Physiol Renal Physiol. 2019;316(3): F414–25.

4. Kim DY, Park JH. Genetiske mekanismer af ADPKD. Adv Exp Med Biol. 2016;933:13–22.

5. Cornec-Le GE, Olson RJ, Besse W, Heyer CM, Gainullin VG, Smith JM, Audrezet MP, Hopp K, Porath B, Shi B, et al. Monoalleliske mutationer til DNAJB11 forårsager atypisk autosomal-dominant polycystisk nyresygdom. Am J Hum Genet. 2018;102(5):832–44.

6. Padovano V, Podrini C, Boletta A, Caplan MJ. Metabolisme og mitokondrier i polycystisk nyresygdom forskning og terapi. Nat Rev Nephrol. 2018;14(11):678–87. https://doi.org/10.1038/s41581-018-0051-1.

7. Bergmann C. Nylige fremskridt i den molekylære diagnose af polycystisk nyresygdom. Ekspert Rev Mol Diagn. 2017;17(12):1037–54. https://doi. org/10.1080/14737159.2017.1386099.

8. Yang Y, Muzny DM, Xia F, Niu Z, Person R, Ding Y, Ward P, Braxton A, Wang M, Buhay C, et al. Molekylære fund blandt patienter henvist til klinisk hel-eksom-sekventering. JAMA. 2014;312(18):1870–9.

9. Mallawaarachchi AC, Hort Y, Cowley MJ, McCabe MJ, Minoche A, Dinger ME, Shine J, Furlong TJ. Helgenomsekventering overvinder pseudogen homologi for at diagnosticere autosomal dominant polycystisk nyresygdom. Eur J Hum Genet. 2016;24(11):1584–90. https://doi.org/10.1038/ ejhg.2016.48.

10. Braun DA, Schueler M, Halbritter J, Gee HY, Porath JD, Lawson JA, Airik R, Shril S, Allen SJ, Stein D, et al. Hel-eksom-sekventering identificerer kausative mutationer i størstedelen af ​​slægtede eller familiære tilfælde med øget nyreekkogenicitet i barndommen. Nyre Int. 2016;89(2):468–75.

11. Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. hurtig: en ultrahurtig alt-i-én FASTQ-forprocessor. Bioinformatik. 2018;34(17):i884–90.

12. Kumar P, Henikof S, Ng PC. Forudsigelse af virkningerne af kodning af ikke-synonyme varianter på proteinfunktion ved hjælp af SIFT-algoritmen. Nat Protoc. 2009;4(7):1073-81.

13. Flanagan SE, Patch AM, Ellard S. Brug af SIFT og PolyPhen til at forudsige mutationer med tab af funktion og forstærkning af funktion. Genet Test Mol Biomarkører. 2010;14(4):533–7.

14. Schwarz JM, Rodelsperger C, Schuelke M, Seelow D. MutationTaster evaluerer sygdomsfremkaldende potentiale for sekvensændringer. Nat Metoder. 2010;7(8):575–6.

15. Itan Y, Shang L, Boisson B, Ciancanelli MJ, Markle JG, Martinez-Barricarte R, Scott E, Shah I, Stenson PD, Gleeson J, et al. Mutations signifikans cutof: gen-niveau tærskler for variant forudsigelser. Nat Metoder. 2016;13(2):109–10.

16. Liu X, Wu C, Li C, Boerwinkle E. dbNSFP v3.0: en one-stop database med funktionelle forudsigelser og annoteringer for humane ikke-synonyme og splejsningssite-SNV'er. Hum Mutat. 2016;37(3):235–41.