Empagliflozin lindrer symptomer på diabetes og renal tubular dysfunktion i en rottemodel af diabetes med forstørret nyre (DEK)

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Ayaka Domon¹, Kentaro KatayamaID¹, Touko Sato², Yuki Tochigi¹, Hiroyuki Tazaki², Hiroetsu SuzukiID^1*

Abstrakt

Baggrund: Natrium-glucose cotransporter 2 (SGLT2) hæmmere bruges i vid udstrækning til at reducere hyperglykæmi. Den nuværende undersøgelse undersøgte virkningerne af en SGLT2-hæmmer, empagliflozin, på hyperglykæmi i en ny rottemodel af type 2-diabetes uden fedme med forstørretnyrer(DEK). Methods: Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations ≤300 mg/dl and >300 mg/dl blev klassificeret som henholdsvis ikke-diabetisk og diabetisk. Grupper af ikke-diabetiske (kontrol) og diabetiske (DM-kont.) rotter blev fodret med standardfoder i 12 uger, hvorimod en anden gruppe diabetiske (DM-empa) rotter blev fodret med standardfoder indeholdende empagliflozin (300 mg/kg/dag) i 12 uger . Blodsukker, kropsvægt, glukosetolerance, føde- og vandindtag, urinvolumen, plasma og biokemiske parametre i urinen samt knoglemineraltæthed blev målt, og deresnyrerog pancreas blev histologisk analyseret. Resultater: Behandling med empagliflozin reducerede blodsukkerkoncentrationen og fødeindtagelsen hos diabetiske rotter, men hæmmede tab af adepstøjler og førte til vægtøgning. Empagliflozin svækkede polyuri og polydipsi, men øgede plasmakoncentrationer af total kolesterol, natrium og totalt protein mod et normalt niveau. Empagliflozin reducerede også signifikant urinudskillelse af proteiner og elektrolytter og genoprettede knoglemineraltæthed og plasmakoncentrationer af valin og isoleucin til normale niveauer. Desuden udvidelse af nyretubuli ognyreudvidelsen var ikke svækket i DM-empa-gruppen. Konklusion: DEK-rotters respons på empagliflozin adskilte sig fra andre diabetiske dyremodeller, hvilket tyder på, at DEK-rotter har unikke egenskaber til at studere og evaluere de multiple biologiske virkninger af SGLT2-hæmmere. Disse resultater indikerede også, at empagliflozin kunne forbedre den systemiske metabolisme og forbedrenyretubuli funktion idiabetikerbetingelser.

Cistanche tubulosa forhindrernyresygdom, klik her for at få prøven

Introduktion

Den verdensomspændende forekomst af diabetes mellitus (DM) fortsætter med at stige, og antallet af patienter anslås at nå 700 millioner i 2045 [1]. Omkring 90-95 procent af disse patienter har type 2 DM, som er karakteriseret ved progressiv reduktion af insulinsekretion med eller uden insulinresistens [2] og er en væsentlig risikofaktor for nyre- og kardiovaskulære sygdomme [3]. Type 2 DM er en førende årsag til nyresvigt i slutstadiet (ESRD) med diabetisk nefropati, også kaldet diabetisknyresygdomme, der er ansvarlige for ESRD hos 20-40 procent af disse patienter [4]. Patienter med ESRD kræver dialyse eller nyretransplantation for at opretholde normalennyrefunktion. Disse procedurer lægger sociale og økonomiske byrder på samfund og individer og påvirker patientens livskvalitet [5]. Der er derfor behov for en indsats for at forebygge eller lindre DM og diabetisk nefropati [6].

Natrium-glucose cotransporter 2 (SGLT2) hæmmere er en ny klasse af antidiabetiske lægemidler, der virker uafhængigt af endogen insulin [7]. SGLT2-hæmmere reducerer blodglukosekoncentrationer ved at hæmme glukosereabsorption ved proksimale nyretubuli [7]. SGLT2-hæmmere har også gavnlige virkninger på den renale og kardiovaskulære komplikation af DM [8-10], såvel som forbedring af stofskiftet [11], som alle er delvist uafhængige af deres glukosesænkende virkning. Endvidere forbedrer SGLT2-hæmmere nyreresultater hos ikke-DM-patienter med kroniskenyresygdomme [12]. Virkningerne af SGLT2-hæmmere, herunder nyreudfald, varierer dog blandt patienter [13]. Disse variationer afspejler sandsynligvis forskelle i flere faktorer, herunder genetisk disposition, metabolisk status, hæmodynamik og livsstil.

Vi har for nylig etableret en ny rottestamme af ikke-fedme type 2 DM med forstørretnyre(DEK) fra LEA. PET-kæledyr medfødt stamme. I DEK-stammen viser omkring 50 procent af mændene diabetes, når de er 30 uger gamle. Disse diabetiske rotter viste progressiv reduktion i plasmainsulinkoncentration på grund af tab af pancreasceller, øget nyreparenkym og markant forstørrelse afnyrermed udvidelse af nyretubuli [14]. DEK-rotter viste også reduktioner i plasmakoncentrationer af totalt kolesterol (TCHO), totalt protein og albumin [14]. Disse histologiske og metaboliske egenskaber er unikke for DEK-rotter, og adskiller denne model fra andre dyremodeller for diabetes og antyder, at DEK-rotter kan være nyttige til at studere de farmakologiske virkninger af antidiabetisk medicin pånyrerog stofskifte. Denne undersøgelse evaluerede derfor virkningerne af SGLT2-hæmmeren, empagliflozin, på nyrerne og den systemiske metabolisme af DEK-rotter.

Materials and methods Animals Blood samples were obtained from the tail veins of non-fasting male DEK rats (total n = 33), and glucose concentrations were measured with GLUCOCARD PlushCare (Arkray Inc., Kyoto, Japan). Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations≤300 mg/dl and >300 mg/dl blev klassificeret som henholdsvis ikke-diabetisk og diabetisk [14]. Alle rotter blev holdt under konventionelle forhold, inklusive en 14:10 timers lys:mørkecyklus, en stuetemperatur på 20 ±2˚C og en relativ luftfugtighed på 50±10 procent. Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care and Use Committee på Nippon Veterinary and Life Science University og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Care and Use Committee på Nippon Veterinary and Life Science University.

Male rats with blood glucose concentrations >300 mg/dl i alderen 15-20 uger i DEK-stamme blev tilfældigt opdelt i en empagliflozin-diætgruppe (DM-empa) (n=5) og en standarddiætgruppe (DM-kont.) (n {{6} }) inden for 2-3 uger efter udvikling af DM. Hanrotter med ikke-DM (blodglukoseniveauet var stadig lavere end 300 mg/dl ved 30 ugers alderen) i DEK-stamme blev defineret som kontrol (n=12). Kontrol- og DM-kontinuerlige grupper havde ad libitum adgang til vand og standarddiæt (CR-LPF, Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo. Japan) i 12 uger, hvorimod rotter i DM-empa-gruppen havde ad libitum adgang til vand og en standarddiæt plus empagliflozin (300 mg/kg; Eli Lilly Japan; Kobe, Japan). Dosis af empagliflozin blev designet med henvisning til tidligere rapporter [15, 16]. Ikke-fastende blodsukkerkoncentrationer, kropsvægt og fødeindtagelse blev målt ugentligt. Alle rotter blev aflivet efter 12 uger, og deresnyre, bugspytkirtel og blodprøver blev indsamlet. Vi satte humane endepunkter for alle dyr, der faldt 25 procent af kropsvægten eller viste symptomer forbundet med at være alvorligt syge. Der var dog ingen rotter, der viste en så alvorlig reduktion af kropsvægt og dårlig tilstand i denne undersøgelse.

Oral glukosetolerancetest (OGTT)

Orale glukosetolerancetest (OGTT) blev udført dagen efter den 12 ugers behandlingsperiode, som beskrevet [14]. Kort fortalt blev rotterne fastet i 16 timer og indgivet 2 g/kg kropsvægt (BW) glucose oralt. Blod blev opnået fra halevenen, og glukosekoncentrationer blev målt 0, 30, 60, 120, 180 og 240 minutter efter glukosepåfyldning. Blodprøver blev også opsamlet fra halsvenen under isofluran-bedøvelse kontrolleret af et bedøvelsesmiddel til små dyr (TK-7, Biomachinery, Chiba, Japan) 0, 30 og 60 minutter efter glukosepåfyldning, blandet med heparin og centrifugeret i 15 minutter ved 4˚C for at opnå plasma. Plasmainsulinkoncentrationer blev målt under anvendelse af et LBIS rotteinsulin ELISA Kit (RTU) (Shibayagi, Gunma, Japan).

Måling af nyreparametre

I løbet af uge 12 blev rotterne anbragt individuelt i metaboliske bure i 24 timer, og urinvolumen og drikkevandsvolumen blev målt [14]. Urinkoncentrationer af kreatinin (Cre), urinstofnitrogen (UN), calcium (Ca), Na-K-Cl og glucose (Glu) blev målt med Dri Chem 3500V (FUJIFILM, Tokyo, Japan). Urinproteinkoncentrationer blev målt under anvendelse af Protein Assay Rapid Kit Wako II (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Tokyo, Japan). Blod blev opsamlet fra caudal vena cava under isofluranbedøvelse, og plasmakoncentrationer af UN, albumin (Alb), totalt protein (TP), total kolesterol (Tcho), Ca og Na K-Cl blev målt ved anvendelse af Dri-Chem 3500V. Plasmakoncentrationen af ​​Cre blev målt under anvendelse af FUJIFILM VET Systems Co., Ltd. (Tokyo, Japan). Kreatinin (Ccre), glucose (Cglu), calcium (Cca), natrium (Can), kalium (Ck) og klor (Ccl) clearance blev beregnet ved hjælp af formlen:

Clearance (Cx) (ml/min/kg)=[urinkoncentration (mg/dl eller mEq/l) × urinvolumen (ml/min)] / plasmakoncentration (mg/dl eller mEq/l) / kropsvægt (kg).

Fraktionel udskillelse af glucose (FEglu), calcium (FEca), natrium (FEna), kalium (FEk) og klor (FEcl) blev beregnet ved hjælp af formlen:

Fraktionsudskillelse (FEx) ( procent )=Cx (ml/min/kg) / Ccre (ml/min/kg) × 100.

Urinkoncentrationen af ​​leverfedtsyrebinding (L-FABP) blev målt ved hjælp af mus/rotte FABP1/L-FABP kit (R&D Systems, Inc., MN, USA)

Histologi, immunfluorescens og beregning af insulin-positivt areal

Dyr blev aflivet med en overdosis af pentobarbitalnatrium efter 12 ugers behandlingsperiode. Detnyrerog pancreas blev fjernet fra hver aflivet rotte og vejet. Vævsprøver blev fikseret med 4 procent paraformaldehyd i phosphatbufret saltvand (PBS), indlejret i paraffin efter standardprocedurer og sektioneret i 1 μm eller 4 μm tykkelse for periodisk syre-Schiff (PAS) og immunfluorescensfarvning. Renal tubulær dilatation blev scoret som beskrevet tidligere [17]. Ti tilfældige ikke-overlappende 40 x forstørrede felter i nyrebarken og det juxtamedullære område blev bedømt. Tubulær dilatation blev scoret på en skala fra {{10}}–3, hvor 0, 1, 2 og 3 angiver 0,<5, 5–10,="" and="">10 dilated tubules per field, respectively. Pancreas sections were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS and incubated overnight at 4˚C with guinea pig anti-insulin polyclonal antibody (1: 100, Abcam K. K., Tokyo, Japan) or mouse anti-glucagon polyclonal antibody (1: 200, Abcam K.K.). The sections were rinsed with PBS and incubated for one hour at room temperature with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti-guinea pig IgG antibody (1: 1000, Life Technologies, Carlsbad, CA) or Alexa Fluor 568 conjugated donkey anti-mouse IgG antibody (1: 1000, Life Technologies). After rinsing in PBS, the sections were mounted with ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Images were acquired with a Biozero BZ-X800 all-in-one fluorescence microscope, (KEYENCE, Tokyo, Japan). Islet areas and insulin-positive areas were measured in >10 ø-sektioner pr. rotte under anvendelse af Image J-software, og procentdelen af ​​insulin-positivt areal pr. ø-areal blev beregnet.

Knogle densitometri analyse af lårben

Lårbenene blev skåret ud fra fire aflivede ikke-DM-kontrol-, tre DM-kontinuerlige og tre DM-empa-rotter efter 12 ugers behandlingsperiode og scannet med et mikro-CT-system (Latheta LCT-100, Aloka, Tokyo, Japan) . Knoglemineraltæthed (BMD, mg/cm3) og knoglemineralindhold (BMC, mg) blev beregnet ved hjælp af Latheta-software.

Gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) analyse af plasmaaminosyrer

Plasmaprøver blev opnået fra 30-ugegamle kontrolrotter og fra 27-32 uger gamle DM-kont og DM-empa-rotter efter den 12-uges behandlingsperiode. Plasmaprøverne blev behandlet med Phenomenex EZ: hurtig AA-analysekit (Phenomenex, Torrance, CA), med norvalin brugt som de interne standarder [18]. GCMS-QP2010Plus og GCMS-løsningssoftware (Shimadzu, Kyoto, Japan) blev brugt til GC-MS-analyse [19].

Statistisk analyse

Resultater, præsenteret som middel ± standardfejl (SE), blev sammenlignet i to grupper ved to-halede studerendes t-test og i flere grupper ved Tukey-Kramer test. En p-værdi < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="">

Resultater

Generelle tilstande forbundet med diabetes

Ugentlige målinger af fødeindtagelse viste, at det estimerede gennemsnitlige daglige fødeindtag var lidt højere i DM-kont end i DM-empa-gruppen (36,9±1,5 g vs. 34,3±1.0 g). Den estimerede daglige dosis af empagliflozin i DM-empa-gruppen var 23,7 ±0,7 mg/kg legemsvægt (BW). Empagliflozin reducerede dramatisk blodsukkerkoncentrationen dagen efter behandlingsstart, fra 404,6±36,3 mg/dl til 143,8±14,6 mg/dl), hvor blodsukkeret i DM-empa-gruppen var signifikant lavere end i DM. -kont. gruppe i løbet af 12-ugens behandlingsperiode (fig. 1A). Dette niveau i DM-empa har lignet normal kontrol med en normal diæt (147.{{40}}±1,2 mg/dl) [14]. BW steg gradvist med alderen i DM-empa-gruppen, men ikke i DM-cont-gruppen (Fig. 1B), hvor den endelige BW efter 12 uger var 444,6±18,0 g i DM-empa og 372,3±26,4 g i DM- forts gruppe. Ved samme alder var kontrolkroppens kropsvægt ca. 533,4±9,8 g [14]. I overensstemmelse med kropsvægtforøgelse forblev adeps-tøjlerne (1,4±0,2 g) i DM-empaen, men ikke i DM-cont-gruppen.

Berørte DEK-rotter har tidligere vist sig at udvise alvorlig glucoseintolerance, ingen insulinsekretion som reaktion på glukosebelastning og tab af celler [14]. Vi undersøgte, om empagliflozin forbedrede glukosetolerance og insulinsekretion og forhindrede tab af celler. Blodsukkerniveauet efter 16 timers faste var signifikant lavere i DM-empa end i DMcont-gruppen, ligesom blodsukkerniveauet 60-240 minutter efter glukosebelastning (fig. 1C). Den tidsrelaterede ændring af blodsukker i OGTT af DM-empa har næsten lignet den hos ikke-diabetiske kontrolrotter af DEK-stamme [14]. Glucoseinduceret-insulinsekretion forekom imidlertid ikke i nogen af ​​grupperne (fig. 1D). Immunfluorescerende farvning af insulin i bugspytkirteløer viste ingen eller svage insulinsignaler i DM-kont-gruppen og næsten 100 procent positive signaler hos kontrolrotter, hvorimod et svagt insulinsignal, omfattende 24,2±3,5 procent pr. øareal blev observeret hos tre rotter i DM-empa gruppe (fig. 2).

Metaboliske og renale parametre og knogledensitometri

Målinger af metaboliske parametre efter 12 ugers behandlingsperiode viste, at fødeindtagelse var signifikant lavere i DM-empa end i DM-kont-gruppen i både relative (Fig 3A) og absolutte (S1 Fig) værdier. Derudover var vandindtaget (Fig. 3B, S1 Fig) og urinvolumen (Fig. 3C, S1 Fig) omkring 50 procent lavere i DM-empa end i DM-cont-gruppen.

Ved afslutningen af ​​12-ugens behandlingsperiode var plasma-Tcho-, Cre-, Alb-, TP- og Na-koncentrationer signifikant lavere i DM-kontinuerlig end i kontrolgruppen, med de fleste af disse reduktioner i DM-kont. gruppe, der viser delvis bedring i DM-empa-gruppen. Specielt plasma Tcho-, TP- og Na-koncentrationer var signifikant højere i DM-empa end i DM-cont-gruppen, selvom alle disse koncentrationer var lavere i DM-empa end i kontrolgruppen. Plasma Alb- og Cre-niveauer var også højere i DM-empa end i DM-cont-gruppen, men disse forskelle var ikke statistisk signifikante (tabel 1). Urinudskillelse af glukose, UN, Ca, Na, K, Cl og protein var signifikant højere i DM-kontinuerlig end i kontrolgruppen, med de fleste af disse stigninger lindret i DM-empa-gruppen. Især urinudskillelser af Glu, UN, Na, K og Cl var signifikant lavere i DM-empa end i DM-kont-gruppen, selvom alle disse udskillelser var signifikant højere i DM-empa end i kontrolgruppen . Øget urinudskillelse af Ca og protein blev også lindret i DM-empa-gruppen uden signifikant forskel mellem DM-empa- og kontrolgrupperne (tabel 2). Bortset fra Ccre, som ikke adskilte sig signifikant mellem de tre grupper, var alle undersøgte clearances og fraktioner signifikant højere i DM-kontinuerlig end i kontrolgruppen (tabel 3). Desuden, bortset fra Cglu og FEglu, som forblev højere i DM-empa-gruppen, blev de fleste af disse stigninger i DM-cont-gruppen lindret i DM-empa-gruppen. Især Cca, Cna og Ccl var signifikant lavere i DM-empa end i DM-cont-gruppen, men forblev højere i DM-empa end i kontrolgruppen (tabel 3).

Femoral BMD var signifikant lavere i DM-kontinuerlig end i kontrolgruppen, med empagliflozin fundet at genoprette femoral BMD i DM-empa-gruppen (tabel 4). BMC havde en tendens til at være højere i DM-empa end i DM-cont-gruppen, men forskellen var ikke statistisk signifikant (tabel 4)

Patologi af nyrerne

Afficerede DEK-rotter udviste progressiv nyreforstørrelse med dilaterede tubuli [14]. Selvom behandling med empagliflozin dramatisk reducerede blodsukkerniveauet, reducerede den ikke

nyrevægt, som var ens i DM-empa- og DM-cont-grupperne (2,35±0.08 g vs. 2,24 ±0,08 g). Histologisk undersøgelse viste, at alvorlig udvidelse var fremtrædende i nyretubuli i de juxtamedullære regioner i både DM-kontinuerlige og DM-empa-rotter (fig. 4A). Empagliflozin svækkede ikke udvidelsen i nyretubuli (fig. 4B og 4C). I overensstemmelse med dette var urinudskillelse af L-FABP, en biomarkør for nyretubulær skade [20], højere i DM-kont og DM-empa sammenlignet med kontrol, og der var ingen forskel mellem DM-kont og DM-empa ( 4D og 4E). Som tidligere rapporteret [14] var der ingen typisk glomerulær læsion såsom hypertrofi i kontrol, DM-kont og DM-empa (fig. 4F).

GC-MS analyse af plasma aminosyrer

Metabolic profiling using PLS-DA multivariate analysis showed differences in amino acid status among the control, DM-cont, and DM-empa groups (S2 Fig). The loading plot corresponded to a score plot consisting of 24 amino acids (S2 Fig). The variable influences on projection (VIP) parameters are shown in S2 Fig. Amino acids colored red had VIP >1 and were considered to have a relatively high impact for separating these groups. Moreover, statistical analysis of amino acids showed a VIP >1.

Plasma-sarcosin havde en tendens til at være højere i DM-kontinuerlig end i kontrolgruppen, hvor empagliflozin øgede plasmasarcosin yderligere. I modsætning hertil havde plasmatryptophan en tendens til at være lavere i DM-kontinuerlig end i kontrolgruppen, hvor empagliflozin yderligere reducerede plasmatryptophan (tabel 5). Plasmaglycinniveauer var ens i DM-kontinuerlig og kontrolgrupper, men var signifikant højere i DM-empa end i de to andre grupper. Glutamin- og ornithinkoncentrationer var signifikant lavere i DM-kontinuerlig end i kontrolgruppen og blev ikke genoprettet ved empagliflozinbehandling. Sammenlignet med kontrolgruppen var plasma-aminosmørsyre signifikant lavere i DM-kont-gruppen, hvor empagliflozin reducerede koncentrationen yderligere. Koncentrationerne af plasmavalin og isoleucin var signifikant højere i DM-kontinuerlig end i kontrolgruppen, hvor disse koncentrationer blev genoprettet til kontrolniveauet ved empagliflozinbehandling.

Diskussion

SGLT2-hæmmere reducerer blodsukkerniveauet på en insulinuafhængig måde og viser renobeskyttende virkninger hos patienter med type 2 DM, såvel som i flere dyremodeller [8, 12, 21-23]. De fleste dyreforsøg med SGLT2-hæmmere er blevet udført i overvægtige dyr med type 2 DM [22, 24-28]. Imidlertid er mange type 2 DM-patienter, især i Asien, ikke-overvægtige [29]. Virkningerne af SGLT2-hæmmere på patienter med nyrelæsioner eller ikke-overvægtige diabetes forbliver uklare [29, 30]. Den nuværende undersøgelse undersøgte virkningerne af empagliflozin på metabolisme, nyrefunktion og histopatologi hos DEK-rotter, en ny ikke-overvægtig diabetisk rottemodel med en disposition for forstørrede nyrer [14]. Sammenlignet med diabetiske dyremodeller med overvægtige, var fænotypen af ​​diabetiske DEK-rotter karakteriseret ved den progressive reduktion af plasmainsulinkoncentrationen på grund af tab af bugspytkirtelceller, snarere end insulinresistens, således at diabetiske DEK-rotter viste et fald i BW og fedt med progression af DM. Derudover viste diabetiske DEK-rotter øget nyreparenkym og markant forstørrelse af nyrerne med udvidelse af nyretubuli [14].

SGLT2-hæmmere fremmer udnyttelsen af ​​fedt, muskler og aminosyrer som energikilder [31-33], hvilket reducerer fedtmasse og BW hos overvægtige mennesker og dyr [28, 34, 35]. Tab af fedtmasse og fald i vægtøgning er også blevet observeret hos ikke-overvægtige diabetiske gnavere behandlet med SGLT2-hæmmere [31]. Derudover viste både mennesker og gnavere behandlet med SGLT2-hæmmere kompenserende hyperfagi for at opretholde deres energi- og næringsbalance [27, 32, 36]. I denne undersøgelse sænkede behandling med empagliflozin blodsukkerniveauet hos DEK-rotter inden for 24 timer, med disse lavere koncentrationer opretholdt gennem hele den 12-uges behandlingsperiode, svarende til andre undersøgelser af SGLT2-hæmmere [15, 24]. I modsætning til tidligere fund [27, 28,36] fandt vi, at empagliflozin-behandling reducerede fødeindtagelse og svækkede tabet af adeps-tøjler og hæmningen af ​​BW-forøgelse. Dette uventede resultat var sandsynligvis forbundet med forbedringer i energibalancen. Indledningsvis var uringlucoseudskillelsen signifikant lavere i DM-empa end i DM-kontinuerlige rotter, selvom det markant højere Cglu i DM empa-gruppen skyldtes fuldstændig hæmning af glucose reabsorption, hvor FEglu var næsten 100 procent. Dette fund blev yderligere understøttet af den signifikante reduktion i urin UN-udskillelse, en parameter for proteinkatabolisme, på trods af et normalt BUN-niveau, i DM-empa-gruppen [37]. Derudover indikerede stigningen i plasma-TP og faldet i urinprotein i DM-empa-gruppen, at empagliflozin forbedrede proteinretentionen. Retentionen og udnyttelsen af ​​glucose og tilbagevenden fra en katabolsk til en assimileret tilstand hos rotter behandlet med empagliflozin kan have været på grund af dets succesfulde kontrol af blodsukkerniveauet.

SGLT2-hæmmere har vist sig at øge urinvolumen, hvor stigninger i tubulær reabsorption kompenserer for tab af kropsvæsker og elektrolytter [21, 25, 38]. Derfor øges urinvolumen umiddelbart efter start af SGLT2-hæmmerbehandling, men langtidsbehandling kan reducere både urinvolumen og vandindtag [38, 39]. Selvom plasma-Cre-niveauet var signifikant lavere i DM-cont og DM-empa end i kontrolgruppen, afveg Ccre ikke signifikant blandt kontrol-, DM-cont- og DM-empa-grupperne. Da der ikke var tydelige beviser for glomerulær hypertrofi hos DEK-DM-rotter [14], kunne glomerulær hyperfiltration derfor næsten ikke forekomme eller være mild i DM-kont. Derudover kan en forstørret nyre med øget parenkym have øget nefrontal, hvilket indikerer, at en forstørret nyre i både DM-kont og DM-empa kan være relateret til reducerede plasma Cre-niveauer. Derfor kan det reducerede urinvolumen i DM-empa-gruppen være et resultat af forbedringer i vandreabsorption i nyretubuli, ikke fra en reduceret glomerulær filtrationshastighed. Samlet set blev den øgede urinudskillelse af elektrolytter i DM-kont-gruppen svækket i DM-empa-gruppen, hvilket indikerer, at de reducerede plasmakoncentrationer af elektrolytter i DM-kont-gruppen blev svækket af empagliflozin-behandling via forbedring af den renale tubulære funktion. Denne hypotese blev understøttet af de konsekvente reduktioner af deres clearances med reducerede fraktionsudskillelser i DM-empa-gruppen.

SGLT2-hæmmere er blevet rapporteret at have skadelige virkninger på knogler [31, 40]. Fordi osteoporose er en almindelig komplikation af DM, sammenlignede vi BMD og BMC i de tre grupper af rotter. BMD og BMC var signifikant lavere i DM-kontinuerlig end i kontrolgruppen, men disse reduktioner blev svækket i DM-empa-gruppen. Desuden blev disse stigninger i BMD og BMC i DM-empa-gruppen ledsaget af reduktioner i urin Ca-udskillelse. Fordi plasma Ca-niveauer er strengt reguleret, var der ingen signifikante forskelle i plasma Ca-niveauer blandt kontrol-, DM-fortsat og DM-empa-grupperne. Disse fund tyder på, at den negative Ca-balance i DM-kontinuerlig-gruppen kan opvejes af mobilisering af a fra knogle ind i kredsløbet, hvor denne tilstand delvist svækkes af den forbedrede renale tubulære funktion af Ca i DM-empa-gruppen.

Svækkelsen af ​​hypoproteinæmi i DM-empa-gruppen kan være et resultat af en forbedring af proteinuri. Selvom glomerulær hyperfiltration og hypertrofi ikke var tydeligt udvist i DM-kont-gruppen, kan det reducerede blodsukkerniveau nedsætte den glomerulære filtration af Alb. Derudover kan forbedringer i den tubulære reabsorption af proteiner og aminosyrer have bidraget til syntesen af ​​plasmaproteiner i leveren. Påvirkede DEK-rotter er karakteriseret ved lave plasma-Tcho-koncentrationer [14]. Fordi øget produktion af Alb er ledsaget af øget produktion af Tcho i leveren [41], kan de højere plasma Tcho-niveauer i DM-empa-gruppen være forbundet med den øgede leverproduktion af Alb. Sidstnævnte kan være et resultat af de øgede aminosyre- og energiforsyninger relateret til forbedringer i proteinretention og energibalance.

Forgrenet aminosyre (BCAA) homeostase bestemmes i vid udstrækning af BCAA katabolisk aktivitet i væv [42], med defekter i BCAA homeostase betragtet som et indeks for insulinresistens eller diabetisk tilstand [43-45]. Vores GC-MS-analyse af aminosyrer viste, at plasmakoncentrationerne af valin og isoleucin i DM-empa-rotter var lig med dem i ikke-diabetiske kontrolrotter, hvilket tyder på, at empagliflozin-behandling forbedrede proteinkatabolisme og diabetiske tilstande. Derudover observerede vi, at en empagliflozin-specifik stigning i plasmaglycinniveauet var forbundet med forbedringen af ​​diabetes. Interessant nok er lavt plasmaglycinniveau blevet observeret ved human diabetes [46], og glycinadministration viste sig at inducere antioxidative og genbeskyttende virkninger hos rotter med streptozotocin-induceret diabetes [47]. Højere plasmaglycinniveauer kan derfor være forbundet med svækkelsen af ​​oxidativt stress og diabetisk nefropati hos diabetespatienter og forsøgsdyr behandlet med empagliflozin. Plasmaniveauer af aminosyrer påvirkes af deres udnyttelse af væv og organer i hele kroppen og afhænger af anabolske og katabolske forhold. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme, hvordan ændringer i niveauerne af disse og andre aminosyrer er relateret til en metabolisk tilstand.

SGLT2-hæmmere udøver renobeskyttende virkninger ved at undertrykke flere processer forbundet med nyresygdomme, såsom albuminuri og øget nyrevægt [15, 24, 48, 49]. Nyretubuliudvidelse og proteinuri er markører for diabetes-associeret nyreskade [50]. Imidlertid var empagliflozin ikke i stand til at undertrykke nyretubuliudvidelse og øget urinudskillelse af L-FABP i vores rottemodel, men forbedrede den tubulære funktion signifikant. Denne uoverensstemmelse tydede på, at den empagliflozin-associerede forbedring i tubulær funktion skyldtes mindre eller sekundære virkninger, der ikke var ledsaget af organiske ændringer i nyretubuli. Alternativt, fordi tubulær udvidelse med skade og øget nyrevægt blev opretholdt under normoglykæmiske tilstande hos påvirkede DEK-rotter, kan disse ændringer have været genetiske træk relateret til diabetes hos DEK-rotter snarere end sekundære til hyperglykæmi.

Selvom SGLT2-hæmmere er rettet mod nyretubuli, vides der kun lidt om virkningerne af disse midler på overordnede ændringer i funktionen af ​​nyretubuli, bortset fra at glomerulær hypertrofi involverer den tubulære samtransport af natrium med glucose [13, 22, 24]. Undersøgelser af virkningerne af SGLT2-hæmmere på tubulær funktion viste, at vandreabsorption ikke kun blev undertrykt af osmotisk diurese, men blev forstærket af opregulering af aquaporin og urinstoftransporter af en endnu ikke fastlagt mekanisme [21, 25]. Renale tubulære epitelceller fra diabetespatienter påvirkes ikke kun af det osmotiske tryk af glucose, der er til stede i den tubulære væske, men af ​​overskydende glucose og natrium optaget i cellerne via SGLT2. For nylig er oxidativt stress i nyretubuli blevet betragtet som vigtigt for progressionen af ​​diabetisk nefropati (DN), og ipragliflozin viste renobeskyttende virkninger ved at forhindre overproduktion af ROS i nyretubuli [51]. Selvom der ikke blev fundet nogen alvorlig progression af DN hos påvirkede DEK-rotter, kan oxidativ stress forringe tubulær funktion. I øjeblikket er der ingen samlet konsensus om virkningerne af SGLT2-hæmmere på tubulær funktion, hvilket tyder på et behov for yderligere undersøgelser for at belyse den mekanisme, hvorved empagliflozin forbedrer tubulær funktion hos DEK-rotter.

SGLT2-hæmmere har vist sig at bevare cellemasse i type 1 DM og overvægtige type 2 DM-modeller [52, 53]. Vi opdagede celler med svage insulinsignaler i DM-empa-gruppen, men ingen celler i DM-cont-gruppen. OGTT viste dog moderate forbedringer i glucosetolerance uden insulinsekretion i DM-empa-gruppen. Da empagliflozin har en kort halveringstid på ca. 8 timer, skyldtes de reducerede blodsukkerniveauer observeret efter en 16 timers faste og forbedringen i glukosetolerance ikke virkningerne af rest-empagliflozin. Disse resultater tyder derfor på, at langvarig administration af empagliflozin kan forbedre glukosemetabolismen og reducere blodsukkerniveauet moderat efter one-shot glukosebelastning på en insulinuafhængig måde.

Som konklusion indikerer resultaterne af denne undersøgelse, at empagliflozin forbedrer systemisk metabolisme og renal tubulær funktion hos DEK-rotter, selvom de detaljerede mekanismer, der ligger til grund for disse dyrs unikke respons på empagliflozin, forbliver uklare. Disse resultater indikerer også, at DEK-rotter er en nyttig model til at studere og evaluere de multiple biologiske virkninger af SGLT2-hæmmere ved diabetes.

Referencer

1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas 9. udg. Bruxelles, Belgien 2019.

2. American Diabetes Association. Klassificering og diagnose af diabetes. Afsnit 2. Standarder for medicinsk behandling ved diabetes-2019. Diabetes pleje. 2019; 42 (Suppl 1): S13–S28.

3. Zheng Y, Ley SH, Hu FB. Global ætiologi og epidemiologi af type 2 diabetes mellitus og dens komplikationer. Nat Rev Endocrinol. 2018; 14(2):88-98.

4. Lin CC, Li CI, Liu CS, Lin WY, Lin CH, Yang SY, et al. Udvikling og validering af en risikoforudsigelsesmodel for nyresygdom i slutstadiet hos patienter med type 2-diabetes. Sci Rep. 2017; 7(1):10177.

5. Valderra´bano F, Jofre R, Lo´pez-Go´mez JM. Livskvalitet hos patienter med nyresygdom i slutstadiet. Am J Nyre Dis. 2001; 38(3):443-64.

6. Sal PM. Forebyggelse af progression i diabetisk nefropati. Diabetes Spectr. 2006; 19(1): 18-24.

7. Hsia DS, Grove O, Cefalu WT. En opdatering om natrium-glucose co-transporter-2 hæmmere til behandling af diabetes mellitus. Curr Opin Endocrinol Diabetes Fedme. 2017; 24(1):73-79.

8. Perkovic V, Jardine MJ, Neal B, Bompoint S, Heerspink HJL, Charytan DM, et al. Canagliflozin og nyreudfald ved type 2-diabetes og nefropati. N Engl J Med. 2019; 380(24):2295-2306.

9. Sarafidis PA, Tapas A. Empagliflozin, kardiovaskulære resultater og dødelighed ved type 2-diabetes. N Engl J Med. 2016; 374(11):1092.

10. Wiviott SD, Raz I, Bonaca MP, Mosenzon O, Kato ET, Cahn A, et al. Dapagliflozin og kardiovaskulære udfald ved type 2-diabetes. N Engl J Med. 2019; 380(4):347-357.

11. Brown E, Rajeev SP, Cuthbertson DJ, Wilding JPH. En gennemgang af virkningsmekanismen, metabolisk profil og hæmodynamiske virkninger af natrium-glucose co-transporter-2 hæmmere. Diabetes Obes Metab. 2019; 21 Suppl 2:9–18.

12. Heerspink HJL, Stefansson BV, Chertow GM, Correa-Rotter R, Greene T, Hou FF, et al. Begrundelse og protokol for det randomiserede kontrollerede forsøg med Dapagliflozin og forebyggelse af uønskede resultater i kronisk nyresygdom (DAPA-CKD). Nephrol skivetransplantation. 2020; 35(2):274-282.

13. Bae JH, Park EG, Kim S, Kim SG, Hahn S, Kim NH. Effekter af natrium-glucose cotransporter 2-hæmmere på nyreresultater hos patienter med type 2-diabetes: En systematisk gennemgang og meta-analyse af randomiserede kontrollerede forsøg. Sci Rep. 2019; 9(1):13009.

14. Domon A, Katayama K, Tochigi Y, Suzuki H. Karakterisering af ny nonobese type 2 diabetes rottemodel med forstørrede nyrer. J Diabetes Res. 2019; 2019:8153140. PMID: 31467929

15. Vallon V, Gerasimova M, Rose MA, Masuda T, Satriano J, Mayoux E, et al. SGLT2-hæmmeren empagliflozin reducerer nyrevækst og albuminuri i forhold til hyperglykæmi og forhindrer glomerulær hyperfiltration hos diabetiske Akita-mus. Am J Physiol Renal Physiol. 2014; 306(2): F194–204.

16. Vickers SP, Cheetham SC, Headland KR, Dickinson K, Grempler R, Mayoux E, et al. Kombination af natrium-glucose cotransporter-2-hæmmeren empagliflozin med orlistat eller sibutramin forbedrer yderligere kropsvægtreduktionen og glukosehomeostasen hos overvægtige rotter, der fodres med en cafeteriadiæt. Diabetes Metab Syndr Overvægt. 2014; 7:265-75.

17. Glastras SJ, Chen H, The R, McGrath RT, Chen J, Pollock CA, et al. Musemodeller af diabetes, fedme og relateret nyresygdom. PLoS One. 2016; 11(8):e0162131.

18. Badawy AA, Morgan CJ, Turner JA. Anvendelse af Phenomenex EZ:faast™ aminosyreanalysesættet til hurtig gaskromatografisk bestemmelse af koncentrationer af plasmatryptophan og dets konkurrenter til hjerneoptagelse. Aminosyrer. 2008; 34(4):587-96.

19. Michishita M, Saito N, Nozawa S, Furumoto R, Nakagawa T, Sato T, et al. Metabolitprofilering i sfæredannende celler fra hunde brystadenokarcinomcellelinjer ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometri. J Vet Med Sci. 2019; 81(9):1238-1248.

20. Kamijo-Ikemori A, Sugaya T, Kimura K. Urinary fedtsyre-bindende protein i nyresygdom. Clin Chim Acta. 2006; 374(1-2):1-7.