HPLC-fingeraftryk og spektrum-antitumoreffektforhold til diskrimination mellem Mylabris Phalerata Pallas og Mylabris Cichorii Linnaeus

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi, Kina,

2 Nøglelaboratorium for grundlæggende farmakologi under Undervisningsministeriet og Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine under Undervisningsministeriet, Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou, Kina.

3 School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi, Kina, 4Guizhou Provincial College-baserede Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi, Kina.

Klik her for at få mere information om Cistanche antitumor

Højdepunkter

Denne undersøgelse giver en anvendelig, troværdig og mere effektiv HPLC-metode til at diskriminere to Mylabris-arter. Og HPLC-fingeraftryk og spektrum-antitumor virkningerblev integreret, og de tre vigtige differentialmarkører blev fundet til en ny markør for Mylabris.

Abstrakt

Formål: Evaluering af forskelsbehandling mellem to Mylabris-arter baseret på HPLC-fingeraftryk og spektrum-antitumor effektforhold. Metoder: I denne undersøgelse, en enkel og effektiv højtydende væskekromatografi (HPLC) metode, der integrerer med kemometrisk analyse og spektrum-antitumor effektforholdet blev udviklet til diskrimination mellem to arter af Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) og Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Resultater: I fingeraftryksanalysen blev 14 karakteristiske toppe udvalgt til at vurdere forskellene mellem MP og MC ved hjælp af ligheds- og mønstergenkendelsesanalysen ved hjælp af PCA og OPLS-DA. HPLC-kromatogrammerne af prøver fra 10 regioner i Kina viste forskelle mellem MP og MC, og der blev fundet 7 karakteristiske kemiske markører. I spektret-antitumor effektrelationsanalyse, 4 aktivitetsmarkører spillede en afgørende rolle i at reducere IC50 og kan være antitumorkomponenterne i Mylabris ved grå relationel analyse og multivariat lineær regressionsanalyse. Den kemometriske analyse i kombination med resultater af spektrum-effektforhold viste, at toppe 2 (cytosin), 4 (ukendt) og 14 (ukendt) var vigtige differentielle markører for at skelne mellem de to arter af Mylabris.

Konklusion: Metoden er anvendelig, troværdig og mere effektiv til at diskriminere MP og MC og vil tilbyde en ny måde at lette kvalitetskontrollen af insektlægemidler på.

Nøgleord: HPLC, Fingeraftryk, Spektrum-antitumor effekt, Mylabris, Diskrimination

Baggrund

Mylabris, kaldet ban mao i Kina, er blevet brugt som traditionel kinesisk medicin (TCM) til behandling af furunkel, dybt rodfæstede sår, en abdominal masse og er en vigtigAntitumoragent. Derudover er det meget udbredt i Europa som folkemedicin [1]. Den vigtigste aktive bestanddel af Mylabris er cantharidin, som er en effektivanti-tumorforbindelse [2]. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at Mylabris besidder flere aktiviteter og er højt værdsat til behandling af tumorer på grund af dets dobbelteanti-kræftegenskaber og evnen til at øge antallet af leukocytter [3-4]. På nuværende tidspunkt har Mylabris været meget udbredt i nogle kliniske anti-carcinom TCM recepter i Kina, såsom Aidi injektion og Compound ban mao kapsel.

Ifølge Folkerepublikken Kinas farmakopé (2015-version) defineres Mylabris som en tørret krop af Mylabris phalerata Pallas (MP) og Mylabris cichorii Linnaeus (MC), som adskiller sig i deres botaniske egenskaber, befolkningsdynamik og økologi [5-6]. Mylabris er også et meget giftigt stof. Da de lægemidler, der er tilgængelige i Kina, normalt er en blanding af MP og MC, er det nødvendigt at identificere de kemiske og aktivitetsforskelle mellem de to arter.

Da TCM'er indeholder mange kendte og ukendte ingredienser, udgør kvantitativ profilanalyse af deres kemiske bestanddele en betydelig udfordring. Højtydende væskekromatografi (HPLC) fingeraftryk spiller en vigtig rolle i kvalitetskontrol (QC) af TCM på grund af dets overordnede profilegenskaber for de fleste forbindelser i et komplekst system. Desuden har fingeraftryksanalyse af TCM'er god reproducerbarhed og stabilitet for artsautentifikation og kvalitetsevaluering og accepteres af Verdenssundhedsorganisationen, State Food and Drug Administration of China (SFDA) og Det Europæiske Lægemiddelevalueringsagentur (EMEA). For nylig er der udviklet en kemometrisk analyse, der kombinerer HPLC-fingeraftryk til QC og diskriminerer forskellige komplekse naturlige kilder [7]. Det er imidlertid ineffektivt at diskriminere forskellene i TCM'er, da det ikke kan afspejle forskellene i aktive bestanddele, hvilket er vigtigere for klinisk brug. Indtil videre er spektrum-Antitumor effektder er anvendt forholdsmetoder til med succes at identificere de bioaktive bestanddele i TCM'er [8]. HPLC-fingeraftryk kombineret med kemometrisk analyse og forholdet mellem spektrum og antitumoreffekt vil bedre belyse forskellen mellem flere kilder til TCM'er.

For nylig er der rapporteret om nogle metoder til bestemmelse af indholdet af cantharidin, som kan bruges til at bestemme kvaliteten af Mylabris [9]. Nogle kromatografiske fingeraftryk blev også anvendt til QC [10-11]. Kun en undersøgelse anvendte en metode, der involverede en gradienteluering af de vandopløselige forbindelser af Mylabris baseret på HPLC. I mellemtiden blev der kun anvendt ti prøver, og ingen MC-prøver [12]. Efter vores bedste overbevisning er det ikke blevet undersøgt før at diskriminere MP og MC baseret på kemisk sammensætning og aktivitet.

Denne undersøgelse havde til formål at udvikle en enkel og effektiv metode til at diskriminere to arter af Mylabris ved hjælp af HPLC-fingeraftryk kombineret med kemometrisk analyse og spektrum-Antitumoreffektforhold, som vil danne grundlag for QC i Mylabris. Denne metode kan også anvendes til at identificere QC-markøren for andre TCM'er.

Materialer og metoder

I alt blev 20 partier Af Mylabris phalerata Pallas (MP) og Mylabris cichorii Linnaeus (MC) indsamlet fra forskellige provinser i Kina (tabel 1) og identificeret af vores prof Xiao-Fei Li. Kuponprøverne blev deponeret i vores laboratorier.

Referencestandarden cytosin, uridin, guanosin og adenosin blev købt hos ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). ACEtonitril og methanol af HPLC-kvalitet blev købt hos Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, USA). Watsons rene vand blev brugt i hele undersøgelsen. Andre kemikalier og opløsningsmidler var af analytisk kvalitet og fremstillet af Aladdin Reagens (Shanghai, Kina), Chengdu Kelong Reagens (Chengdu, Kina) og Sinopharm Chemical Reagens (Beijing, Kina)

Apparatur og kromatografiske forhold

HPLC-analysen blev udført ved hjælp af et Agilent 1260 Infinity HPLC-system ved 30 °C på en Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm ×250 mm, 5 μm) til fingeraftryk. Lineær gradienteluering med eluenter A (vand/iseddike, 100:1, v/v) og B (methanol) blev anvendt til separation. Gradientprogrammet blev udviklet som følger: 0-1 min, 3,0-4,6% B; 1-9 min, 4,6-6,8% B; 9-25 min, 6,8-51,0% B; 25-30 min, 51,0-100%. Strømningshastigheden for den mobile fase var 1,0 ml/min. Kromatogrammet blev overvåget ved 254 nm. Efter en 15 minutters ligevægtsperiode blev 10 μL prøver anvendt til injektion.

Prøve forberedelse

De tørrede prøver blev knust til pulver, og 2,5 g af hver pulveriseret prøve blev ekstraheret to gange med 50 ml 75% ethanol ved tilbagesvaling i 1,5 time hver gang. Den ekstraherede prøve blev blandet og koncentreret under reduceret tryk til 20 ml. Blandingen blev derefter udfældet med 80 ml vand i 24 timer under 4 °C. Derefter blev ekstraktet centrifugeret ved 3000 g min-1 i 10 minutter for at adskille supernatanten. Supernatanten blev koncentreret under reduceret tryk til 25 ml. Endelig blev supernatanten filtreret gennem en 0,22 μm Millipore-film før HPLC-analyse.

Validering af metoder

HPLC-metoden blev valideret for præcision, reproducerbarhed og stabilitet (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h). Valideringen blev estimeret ud fra retentionstiden (RT) og peak area (PA). Endelig blev der etableret kemiske fingeraftryk af 20 partier Mylabris for at identificere de integrerede kemiske egenskaber ved flere forbindelser. Nogle kemometriske teknikker blev introduceret på det kemiske fingeraftryk til analyse.

Analyse af mønstergenkendelse

Forskelle mellem to arter af topområderne blev evalueret for statistisk signifikans ved hjælp af uparret studerendes t-test. En p-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Som en klassisk uovervåget metode anvendes hovedkomponentanalyse (PCA) i vid udstrækning til statistisk dataanalyse. I stedet for at bruge mange variabler tager PCA et lille antal pc'er uden at miste meget information, og scoreplotter visualiseres derefter for fri adskillelse af observationer. I denne undersøgelse blev PCA udført på de normaliserede spidsområder for hver komponent i HPLC-fingeraftryk ved hjælp af SIMCA-P + 14.0-softwaren (Umetrics, Umeå, Sverige) for at finde diskriminationen mellem de to arter af Mylabris.

For mere foretrukken diskrimination mellem de to Mylabris-arter blev der anvendt en overvåget metode til ortogonal partiel mindste kvadratisk diskriminant analyse (OPLS-DA) til at analysere forskellene i de normaliserede topområder for hver komponent i HPLC-fingeraftrykkene. VIP-værdien er en vægtet sum af kvadrater af OPLS-vægtene, der afspejler det relative bidrag fra hver X-variabel til modellen. Variablerne med VIP-> 1 sammen med S-plot blev anset for at have indflydelse på adskillelsen af prøver i scoreplottene genereret fra OPLS-DA-analysen. Derefter blev de karakteristiske kemiske markører for diskrimination opnået.

Spektrum-antitumor effekt forhold analyse

At udforskeanti-tumoreffekttopområde for Mylabris-prøver integreret med fingeraftryksdata og sammenligne forskellene mellem de to arter, sammenhængen mellem toppen af fingeraftryk oganti-tumoreffekter blev undersøgt. To metoder, der kombinerer grå relationel analyse og multivariat lineær regressionsanalyse (MLRA), blev anvendt af SPSS19.0 (IBM, USA) og GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Kina). Denanti-tumortest blev udført ved vores offentliggjorte metoder [12], human hepatocellulær carcinom cellelinje HepG2 celler blev opretholdt i RPMI1640 medium suppleret med 10% føtal kvæg serum. Cellerne blev dyrket i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 ved 37 C. SRB-metoden blev anvendt til at vurdere spredningen foranti-tumorAktiviteter, derefter blev IC50 af HepG2-celler beregnet, endelig blev IC50 og normaliserede topområder anvendt til kemometrisk analyse. Derefter fik man Mylabris karakteristiske aktivitetsmarkører.

Resultater og diskussion

Optimering af ekstraktbetingelser

For tilstrækkelig ekstraktion af vandopslevende stoffer fra Mylabris blev ekstraktionssystemet optimeret. Ultralyd og refluks viste, at disse forbindelser kunne ekstraheres optimalt ved tilbagesvaling.

Optimering af HPLC-metode

For at opnå maksimale kromatografiske toppe til at beskrive urtens overordnede træk blev sammensætningen af den kromatografiske søjle, den mobile fase og detektionsbølgelængderne (200, 254, 265 og 278 nm) undersøgt. Resultaterne viste, at Phenimenex Synergy Polar-RP80-søjle, vand (indeholdende 1% iseddikesyre) og methanol og 254 nm var de bedste betingelser for Mylabris HPLC-analyse (figur 1), strukturen af 4 standardstoffer er vist i figur 2.

Metode validering

I denne undersøgelse blev 14 toppe godt adskilt og brugt som "fælles toppe". Præcisionen, repeterbarheden og stabiliteten var baseret på retentionstiden (RT) og peak area (PA). RSD-værdierne for RT og PA for præcision (n = 6) oversteg ikke henholdsvis 0,2 og 4% RSD-værdierne for RA og PA for repeterbarhed (n = 6) var henholdsvis under 0,2 og 4%, og RSD-værdierne for stabilitet (0-24 timer) var henholdsvis mindre end 0,4 og 5%, hvilket indikerede, at prøverne var stabile inden for 24 timer. Disse resultater illustrerede, at kvaliteten af de undersøgte prøver og HPLC-metoden var stabil og velkontrolleret.

Evaluering af fingeraftryk lighed

Fingeraftrykslighedsanalysen blev brugt til at evaluere ligheden mellem HPLC-toppe. Lighederne mellem MP og MC blev beregnet ved hjælp af henholdsvis HPLC-referencefingeraftrykket. Som vist i tabel 1, bortset fra to MP-prøver (fra Guizhou2 og Guizhou5) med lavere ligheder (henholdsvis 0,880 og 0,920), var andre prøver af MP >0,930. Lighederne mellem MC-prøver var >0,921 bortset fra MC-prøver (fra Guizhou2 og Guizhou4), hvis ligheder var henholdsvis 0,888 og 0,887. Disse data viste, at kvaliteten af Mylabris inden for en art var stabil. Lighederne mellem kun tre MP-prøver sammenlignet med HPLC-referencefingeraftrykket var imidlertid > 0,930; og lighederne mellem kun to MC-prøver sammenlignet med HPLC-referencefingeraftrykket var > 0,921. Disse resultater viste, at de to arter af Mylabris var betydelige variationer i nogle topområder.

Diskrimination af MP og MC ved mønstergenkendelsesanalyse

Til global analyse af forskellen blev PCA brugt til at finde kvalitetsvariationen af prøverne fra de to arter af Mylabris. Figur 3 viser, at den todimensionelle PCA-model blev konstrueret af de to første pc'er, som omfattede ca. 61,8% af de oprindelige data. Scoreplottet viste, at MP- og MC-prøverne ikke kunne adskilles af PCA. For at forstå forskellene mellem MP og MC blev der etableret en OPLS-DA-model. Som vist i figur 4 kunne Mylabris-prøverne klassificeres i to grupper med R2X = 0,502, R2Y = 0,492 og Q2 = 0,0769 sammenlignet med PCA-modellen. Disse resultater viste, at OPLS-DA-modellen var mere egnet end PCA-modellen til tydelig adskillelse af testprøverne baseret på deres forskellige komponenter. Fra S-plottet i OPLS-DA kunne der findes topmarkører inklusive toppe 1, 2, 4, 7, 9, 12 og 14 mellem MP og MC (figur 5). Baseret på VIP>1 kan toppe 1, 2, 4, 7, 9, 12 og 14 være de mest betydningsfulde variabler i forskelsbehandling mellem de to arter (figur 6). Topgruppen (1, 2, 4, 7, 9, 12 og 14) kan spille en afgørende rolle i at skelne mellem MP og MC som karakteristiske kemiske markører.

Spektrum-effekt-forhold ved grå relationel analyse

For yderligere at evaluere forholdet mellem variationerne i normaliseret topområde og IC50 blev der udført grå relationel analyse (GRA). Indflydelsesrangeringen efter normaliseret topområde var P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 som vist i tabel 2. Resultaterne viste, at top-6-toppen inklusive toppe 13, 14, 12, 2, 3 og 4 var de vigtigste påvirkende faktorer for antitumoreffekten baseret på standarden for relativ grå korrelativ grad (RGCE) >0,75.

Spektrum-effekt-forhold af MLRA

MLRA-modellen er den mest almindelige modelleringsmetode til at udlede forholdets kompleksitet mellem to eller flere variabler og et svar, der blev bygget af følgende formel

Hvor Y er den anslåede værdi og repræsenterer svaret Xn er en uafhængig variabel, b0 er aflytningen, og bn er regressionskoefficienten for Xn. I denne undersøgelse blev MLRA anvendt til at fastslå forholdet mellem fingeraftryk og effektivitet mellem værdierne af topområderne i HPLC-fingeraftryk og IC50 af anti-HepG2 og derefter finde de mulige antitumorkomponenter. Kollineationen af data blev fundet ved en fælles MLRA-model, som er uegnet til at undersøge sammenhængen mellem Y (IC50) og X (PA). En PCA MLRA-model blev brugt til at studere forholdet mellem fingeraftryk og effekt, og de første seks pc'er med en kumulativ variansbidragssats: 91.068% blev udvalgt til analyse. Endelig blev følgende ligning fastlagt i henhold til SPSS-udgangen og pc'erne: IC50 = 1.115864 +( 1.87268PA1- 699.722PA2 + 25.7138PA3 - 24.1528PA4 + 7.22878PA5 - 40.2114PA6 + 2.95283PA7- 15.5305PA8 + 13.0297PA9 + 22.5683PA10 - 10.3462PA11 + 123.762PA12 + 31.0428PA13 - 10.702PA14) ×10-6. (R var 0,682, P<>

Integrering af analyse af to Mylabris-arter

Eksperimentet viste, at HPLC-fingeraftrykket kunne bruges til at afspejle Mylabris' kemiske egenskaber. Lighedsalgoritmerne, PCA og OPLS-DA blev anvendt til at finde forskellen mellem MC og MP. Topgruppen (1, 2, 4, 7, 9, 12 og 14) blev defineret som karakteristiske kemiske markører.

Desuden viste både GRA og MLRA sig at være en tilfredsstillende metode til yderligere forskelsbehandling. Integrering af GRA- og MLRA-analyseresultaterne, top 2, 4 og 14 som aktivitetsmarkører for Mylabris, bør være ansvarlig for antitumoreffekten, som kan være det farmakodynamiske materialegrundlag for Mylabris.

De vigtige differentialmarkører blev defineret for toppen med karakteristiske kemiske og aktivitetsmarkøregenskaber. Så mellem MC og MP på HPLC-fingeraftryk efter spektrumeffektforholdsanalyse var toppe 2 (cytosin), 4 (ukendt) og 14 (ukendt) vigtige differentielle markører for forskellene mellem MP og MC som vist i figur 7.

Konklusion

Afslutningsvis blev der i den foreliggende forskning foreslået en HPLC-metode til kemisk fingeraftryk af MP og MC. Ved at kombinere HPLC-fingeraftryk, PCA og spektrumeffektforholdsanalyse såsom GAS og MLRA kan de kemiske og farmakologiske egenskaber hos to nære arter af Mylabris diskrimineres. Dette indikerede, at forbindelser fra toppe 2 (cytosin), 4 (ukendt) og 14 (ukendt) som vigtige differentielle markører spillede dominerende roller i at skelne mellem MP og MC. Strukturen af toppe 4 og 14 bør identificeres ved hjælp af anden teknologi. Metoden til HPLC-fingeraftryk kombineret med statistisk, kemometrisk analyse og spektrumeffektforholdsanalyse viste sig at være effektiv til at opdage markørkomponenter eller til fremme af QC afPlantelægemidler.

Referencer

1 Wang GS. Medicinske anvendelser af Mylabris i det gamle Kina og nyere undersøgelser. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP, et al. Bestemmelse af cantharidinindhold og dets hæmmende virkning på humane hepatom HepG2-celler. Biomed Res-Indien 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ, et al. Acyl-CoA: kolesterol acyltransferasehæmmende aktiviteter af fedtsyreamid isoleret fra Mylabris phalerate Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Dag RM, Harbord M, Forbes A, et al. Cantharidin blærer: en teknik til undersøgelse af leukocythandel og cytokinproduktion på steder med betændelse hos mennesker. J Immunol Metoder 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Undersøgelse af foretrukken mad af voksen Mylabris phalerata i forskellige geografiske populationer. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Biologisk karakteristik af Meloidae og dens kunstige fodring. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H, et al. Kvantitativ analyse i kombination med fingeraftryksteknologi og kemometrisk analyse anvendt til evaluering af seks arter af vilde Paris ved hjælp af UHPLC-UV-MS. J Anal Metoder Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G, et al. Overvågning og evaluering af kvalitetskonsistensen af Compound Bismuth Aluminate tabletter ved hjælp af en simpel kvantificeret forholdsfingeraftryksmetode kombineret med samtidig bestemmelse af fem forbindelser og korreleret med antioxidantaktiviteter. Plos One 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Analyse af cantharidin i falske blisterbiller (Coleoptera: Oedemeridae) ved headspace fastfasemikroekstraktion og gaskromatografi-massespektrometri. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Undersøgelse af GC-fingeraftryk af Mylabris phalerata. China Journal of Hospital Pharmacy (Chin) 2010; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX og Shi XF. Digitaliserede fingeraftryk af Mylabris fra HPCE. Central South Pharmacy (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX og Wang, Z. Undersøgelse af Mylabris' digitaliserede HPLC-fingeraftryk. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (Chin) 2008;28(7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, et al. Anti-human hepatocellulært carcinom HepG 2 celler aktivitet af cantharidin afledt af Guizhou provinsen og omkringliggende regioner. Journal of Modern Medicine & Health (Chin) 2016; 32(5): 648-650.