Østrogen aktivitet af glycosider fra cistanche deserticola som østrogenreceptorer adjuvans in vitro

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li , Xiang-Ming Sun , Yang Hu , Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

INDFØRELSEN

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" på kinesisk), en traditionel kinesisk urtemedicin, der først blev registreret i ShenNongBenCaoJing, er blevet brugt til behandling af nyremangel, impotens, senil forstoppelse og blodmangel i tusinder af år. [1] Det distribueres hovedsageligt i ørkenregionerne i det nordvestlige Kina, såsom Gansu og Xinjiang. [2] Moderne farmakologiforskning viste, at C. deserticola kan fremme brede medicinske funktioner, såsom hormonregulering, immunmodulerende, antioxidativ, neuroprotektiv, antiinflammatorisk og østrogen aktivitet. [3,4] Glycosider af Cistanches (GCs) blev betragtet som en af de vigtigste aktive komponenter med forskellige biologiske virkninger. [5,6]

Østrogenreceptorer-α (ER'er-α) og ERβ er undertyperne af ER'erne, som kan regulere fysiologiske funktioner. [7] Disse proteiner kunne regulere transkriptionen af målgener ved at binde sig til associerede DNA-regulatoriske sekvenser i cellekernen. Begge undertyper udtrykkes markant i kardiovaskulære og centrale nervesystemer. [8,9] ERα findes hovedsageligt i brystkirtlen, livmoderen, æggestokken, knoglen, det mandlige reproduktive organ og prostata. ERβ er hovedsageligt til stede i prostata, æggestok og blære. [10,11] Desuden er der nogle fælles fysiologiske roller for de to undertyper, såsom i udviklingen og funktionen af æggestokkene og i beskyttelsen af det kardiovaskulære system. [12,13] Tidligere forskning i vores gruppe afslørede den østrogenlignende mekanisme af PC'er ved metoden til metabolomisk analyse. [14] I en kontinuerlig undersøgelse analyserede vi mekanismen for østrogen aktivitet af GCs på MCF-7 cellelinjer relateret til ER'er.

MATERIALER OG METODER

Instrumenter

ECO-170P-230 inkubator var fra New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., Bio-Rad 680 mikropladelæser, og elektroforeseapparater var fra Bio-Rad Laboratories, Inc., CX21 mikroskop var fra Olympus Co., Ltd., GIS-2019 gelbilleddannelsessystem var fra Tanon Science and Technology Co., Ltd., den flade bundplade var fra Corning Inc., EPICS-XL flowcytometri var fra Beckman-Coulter Inc., og StepOnePlus Real-Time polymerasekædereaktionssystem (PCR) var fra Thermo Fisher Scientific.

Kemikalier og reagenser

GC'er blev fremstillet i vores laboratorium, som metoden tidligere har rapporteret,[14] og renheden af GCs blev bestemt til at være 52% (acteosid blev brugt som markør til bestemmelse af GCs) ved ultraviolet spektrofotometri. Estradiol (E2) blev købt fra Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Føtalt kvægserum (FBS) og RPMI-1640 var fra Gibco Co., Ltd., 96-brønd flad bundplade var fra Corning Inc., og dimethylsulfoxid (DMSO) og 3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev købt fra Sigma-Aldrich Corporation. TRIzol reagens, Reverse Transcription (RT) Kit og TB Green™ RT-PCR Kit blev købt fra TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Kina. Anti-ERα Rabbit pAb, anti-ERβ Rabbit pAb og β-actin antistoffer blev købt fra Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Alle de andre almindelige kemikalier blev købt hos standard kommercielle leverandører.

Prøve forberedelse

Fremstilling af glycosider af Cistanches stamopløsning

GCs-ekstrakt blev opløst i DMSO til stamopløsning med en koncentration på 0,1051 g/ml og opbevaret ved 4 °C. Phenol rødfri RPMI-1640 blev anvendt til at fortynde stamopløsningen til forskellige koncentrationer før brug.

Fremstilling af østradiolopløsning

E2-ekstrakt blev opløst i DMSO til en stamopløsning med en koncentration på 0,27 mg/ml og opbevaret ved 4 °C. Phenol rødfri RPMI-1640 blev anvendt til at fortynde stamopløsningen til forskellige koncentrationer før brug.

Fremstilling af trækul dextran behandlet-føtalt kvæg serum

Hundredvis af milliliter FBS blev blandet med 250 mg aktivt kulpulver og 25 mg dextran. Efter inkubation i 45 minutter ved 55 °C blev blandingen centrifugeret ved 4 °C, 1000 o/min i 15 minutter. Supernatanten blev filtreret ved hjælp af Millipore Express PES-membranen for at få trækul dextran-behandlet (CDT)-FBS og opbevaret ved -20 ° C.

Cellekultur

De humane brystkræft MCF-7 cellelinjer blev opnået fra den amerikanske type kultur samling (ATCC). Desuden blev cellerne dyrket med RPMI-1640 medium indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C under en befugtet 5% CO2 atmosfære. Celler blev dyrket i phenol rødfri RPMI-1640 medium indeholdende 5% CDT-FBS 4 dage før MTT-assay, således at østrogenet i cellerne skulle ryddes.

Celleproliferationsanalyse af østradiol på MCF-7 cellelinjer

Celleproliferation blev målt ved hjælp af MTT-assay for MCF-7-celler. [15,16] E2 blev opløst i RPMI-1640 kulturmedier indeholdende 0,1% DMSO ved endelige koncentrationer på 0,1, 1, 10, 100 og 1000 nM. MCF-7 cellelinjer blev dyrket i phenol rødfri RPMI-1640 medium i 4 dage. Efter vask med fosfatbufret saltvand (PBS) tre gange blev 100 μL FBS-frit RPMI-1640-medium tilsat i 96-brøndsplader ved 1,5 × 104 pr. Brønd og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af E2-opløsningen i 72 timer. Derefter blev 100 μL MTT-opløsning (0,5 mg/ml) tilsat til hver brønd. Celler blev inkuberet i 4 timer. Endelig blev 150 μL DMSO tilsat for at opløse formazankrystallerne. Absorbansen blev målt til 570 nm af en mikropladelæser, og spredningshastigheden (PR) blev beregnet.

Celleproliferationsanalyse af glycosider af cistanches på MCF-7 cellelinjer

Celleproliferation blev målt ved hjælp af MTT-assay for MCF-7-celler. GC'er blev opløst i RPMI-1640-kulturmedier indeholdende 0,1% DMSO ved endelige koncentrationer på 0,0175, 0,175, 1,75, 17,5 og 175 μg/ml. MCF-7-cellelinjer blev dyrket i phenolrødfrit RPMI-1640-medium indeholdende 5% CDT-FBS i 4 dage. Efter vask af PBS tre gange blev 100 μL FBS-frit RPMI-1640-medium tilsat i 96-brøndsplader ved 1,5 × 104 pr. Brønd og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af GCs-opløsningen i henholdsvis 24, 48 og 72 timer. Derefter blev 100 μL MTT-opløsning (0,5 mg/ml) tilsat til hver brønd. Celler blev inkuberet i 4 timer. Endelig blev 150 μL DMSO tilsat for at opløse formazankrystallerne. Absorbansen blev målt til 570 nm af en mikropladelæser, og PR'en blev beregnet. Phenol rødfri RPMI-1640 og medium indeholdende E2 (2,725 × 10-3 μg/ml) var henholdsvis de negative og positive grupper.

Celleproliferationsanalyse af glycosider af Cistanches med fulvestrant på MCF-7 cellelinjer

Celleproliferation blev målt ved hjælp af MTT-assay for MCF-7-celler. GC'er blev opløst i RPMI-1640-kulturmedier indeholdende 0,1% DMSO ved endelige koncentrationer på 1,75, 17,5 og 175 μg/ml. MCF-7-cellelinjer blev dyrket i phenolrødfrit RPMI-1640-medium indeholdende 5% CDT-FBS i 4 dage. Efter vask af PBS tre gange blev 100 μL FBS-frit RPMI-1640-medium tilsat i 96-brøndsplader ved 1,5 × 104 pr. Brønd og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af GCs-opløsningen og inkuberet med fulvestrant (6,06 × 10-5 μg/ml) i 48 timer. Derefter blev 100 μL MTT-opløsning (0,5 mg/ml) tilsat til hver brønd. Celler blev inkuberet i 4 timer. Endelig blev 150 μL DMSO tilsat for at opløse formazankrystallerne. Absorbansen blev målt til 570 nm af en mikropladelæser, og PR'en blev beregnet. Phenol rødfri RPMI-1640 og medium indeholdende E2 (2,725 × 10-3 μg/ml) var henholdsvis de negative og positive grupper.

Cellecyklus assay

GC'er blev opløst i RPMI-1640-kulturmedier indeholdende 0,1% DMSO ved endelige koncentrationer på 1,75, 17,5 og 175 μg/ml. MCF-7-cellelinjer blev dyrket i phenolrødfrit RPMI-1640-medium indeholdende 5% CDT-FBS i 4 dage. Efter vask af PBS tre gange blev 1 ml FBS-frit RPMI-1640-medium tilsat i 6-brøndsplader ved 2,5 × 105 pr. Brønd og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af GCs-opløsningen og inkuberet med fulvestrant (6,06 × 10-5 μg/ml) i 48 timer. Efterfølgende blev cellerne opsamlet og vasket med PBS tre gange, centrifugeret ved 4 °C, 1000 o/min i 10 minutter og fikseret med 70 % ethanol ved −20 °C natten over. Efter vask med PBS to gange blev cellerne farvet med PI-opløsning (50 mg/ml) indeholdende 1 mg/ml RNase A og 0,1 % Triton X-100 i 30 minutter i mørke ved 4 °C. Cellecyklussen blev detekteret ved hjælp af flowcytometri, og proliferationsindeks (PI) blev beregnet som følger. Phenol rødfri RPMI-1640 og medium indeholdende E2 (2,725 × 10-3 μg/ml) var henholdsvis de negative og positive grupper. PI = (S + G2 M)/(G0 /G1 + S + G2 M) × 100%

RNA-isolering og kvantitativ polymerasekædereaktionsanalyse i realtid

For at måle niveauet af mRNA blev der anvendt et RT-kvantitativt PCR-assay (qPCR). Total cellulært RNA blev ekstraheret med TRIzol-reagens. For qPCR blev RNA omvendt transskriberet til cDNA fra 4 μg total RNA under anvendelse af et RT-kit. RT-PCR-analyser blev udført ved hjælp af TB Green™ RT-PCR Kit. Alle protokoller blev udført i henhold til producentens anvisninger. Det primerpar, der blev anvendt til forstærkning af ERα, var 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (fremad) og 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (omvendt); det primerpar, der blev anvendt til forstærkning af ERβ, var 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (fremad) og 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (omvendt). PCR-betingelserne for ERα og ERβ var 94 °C i 3 minutter efterfulgt af henholdsvis 37 og 40 cyklusser på 94 °C i 30 s, 58 °C i 2 minutter og 72 °C i 2 minutter. Primerparret, der blev brugt til forstærkning af GAPDH, var 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (fremad) og 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (omvendt). PCR-betingelserne for GAPDH var 94 ° C i 3 minutter efterfulgt af 30 cyklusser på 94 ° C i 30 s, 58 ° C i 2 minutter og 72 ° C i 2 minutter. Hver gang RT-qPCR-eksperimentet blev gentaget mere end to gange. Til dette blev GAPDH brugt som en intern kontrol. Den relative genekspression af ERα/ERβ af transfektanter i forhold til kontrolceller blev beregnet: 2−(∆∆Ct).

Vestlig blotting

Ekspressionen af ERα- og ERβ-proteiner blev påvist ved western blot-analyse som den rapporterede metode med mindre ændringer. Kort fortalt blev MCF-7-cellerne dyrket i 6-brøndsplader ved 2,5 × 105 celler pr. Brønd og behandlet med GC'er i den endelige koncentration på henholdsvis 1,75, 17,5 og 175 μg/ml i 48 timer. Efter inkubation blev helcelleekstrakterne fremstillet under anvendelse af RIPA-buffer indeholdende 1 mM PMSF. Proteiner i helcelleekstrakterne blev adskilt af 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og derefter overført til polyvinylidendifluoridmembraner. Membranen blev blokeret med 5% (w/v) skummetmælk opløst i TBST-buffer og inkuberet med primære og sekundære antistoffer igen. Bundne antistoffer blev observeret.

Statistisk analyse

Resultaterne blev udtrykt som midler og standardafvigelser, og statistisk signifikans blev udført ved hjælp af Student's t-test med SPSS 21.0-software (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

RESULTATER

Efter 24 timers E2-behandling blev spredningen af MCF-7-celler naturligvis forbedret [figur 1a]. 10nM E2-opløsning kunne naturligvis stimulere cellernes vækst (123,89%). Men med stigningen i E2-koncentrationen svækkedes celleproliferationsevnen. Derfor var 10nM den optimale koncentration af E2 i dette eksperiment.

GCs gruppe i koncentrationerne på 1,75, 17,5 og 175 μg / mg kunne øge proliferationen af MCF-7-cellelinjerne med en tids- og doseringsafhængig måde og udviste en signifikant forskel med negativ gruppe [figur 1b]. Sammenlignet med en negativ gruppe udviste E2-gruppen åbenlys spredning (120,06%).

Kombineret medicingruppe (CMG) (fulvestrant med E2 eller GCs) i CDT-FBS-mediet blev inkuberet med MCF-4-celler. Efter 72 timers inkubation kan CMG føre til hældning af PR sammenlignet med den enkelte medicingruppe (IMG) (P< 0.01)="" [figure="">

Flowcytometrianalyse viste, at GC'er kunne øge PI-værdien lidt, hvilket tyder på, at GC'er kunne fremme G0 / G1-faseceller til S- og G2 / M-faser [Figur 2 og tabel 1] og fremme celle-DNA-syntese. Resultatet indikerer, at mekanismen for GCs på MCF-7 lignede E2. I CMG (fulvestrant med GCs) faldt PI-værdien af celle PI til IMG lidt (P<>

RT-PCR-analyse viste, at ekspressionerne af ERα og ERβ mRNA blev øget sammenlignet med kontrolgruppen (P< 0.01)="" in="" a="" dose‑dependent="" manner="" after="" being="" treated="" by="" different="" concentrations="" of="" gcs="" for="" 48="" h="" [figure="" 3a="" and="">

Western blot-resultat, der indikerer, at efter behandling med forskellige koncentrationer af GC'er i 48 timer øges indholdet af ERα- og ERβ-proteiner i MCF-7 med GCs øget som en dosisafhængig måde [Figur 3c-e]

KONKLUSION

I denne forskning blev effekten af GCs på spredning og cellecyklus af MCF-7 analyseret ved henholdsvis MTT- og flowcytometrimetoden. GCs kunne øge spredningen af MCF-7-celler i en koncentration på 1,75, 17,5 og 175 μg/ml efter inkuberet i 72 timer. Stigningen har dog en tendens til at aftage, når CC'er og fulvestrant blev brugt sammen. GCs kunne øge PI-værdien af MCF-7-celler, reducere cellen i G1-fasen og øge cellen i S- og G2-faserne.

Fulvestrant er en ER-specifik antagonist, som blokerer den nukleare lokalisering af ER ved at forringe receptordimerisering og energiafhængig nuklear transport. [17] I denne forskning har en konklusion bekræftet, at fulvestrant kan svække spredning af GC'er på MCF-7-celler, og det kan påvirke cellecyklustransformationen. Derfor indikerede denne undersøgelse den østrogene aktivitet af GCs, og også ER er målet for GCs. I RT-PCR- og Western blot-eksperimentet steg mRNA- og proteinekspressionerne af ERα og ERβ i MCF-7-cellerne med stigningen i GCs koncentration. Derfor kan GCs spille en rolle i østrogen aktivitet i henhold til opreguleret mRNA og proteiner af ERα og ERβ.