Cistanche Deserticola ekstrakt øger knogledannelsen i osteoblaster
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lien, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Hoen, Chi-Ming Wuen, Wen-Chi Chend,Yi-Chin Fonga,eog Chih-Hsin Tangf,c
Abstrakt
Mål:Vi undersøgte effekten afCistanche deserticola Ma. (CD) om knogledannelse ved dyrkede osteoblaster.MetoderDet mineraliserede knudedannelsesassay blev brugt til at undersøge cd's in vitro-virkninger på knogledannelse. Alkalisk phosphatase (ALP), knoglemorfogenetiske proteiner (BMP)-2 og osteopontin (OPN) mRNA-ekspression blev analyseret ved kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid. Virkningsmekanismen for cd-ekstrakt blev undersøgt ved hjælp af Western blotting. Den in vivo anti-osteoporotiske virkning af CD-ekstrakt blev vurderet i ovariektomiserede mus.De vigtigste resultaterCD-ekstrakt havde ingen effekt på spredning, migration eller sårheling af dyrkede osteoblaster, men øgede ALP, BMP-2 og OPN mRNA og knoglemineralisering. Mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) eller nukleare faktor (NF)-kB-hæmmere reducerede CD-ekstraktinduceret knogledannelse og ALP-, BMP-2- og OPN-ekspression. CD-ekstrakt påvirkede imidlertid ikke osteoklastogenese. Derudover forhindrede CD-ekstrakt knogletabet induceret af ovariektomi in vivo.KonklusionerCD kan være et nyt knogledannelsesmiddel til behandling af osteoporose.
Indførelsen
Knogle er et komplekst væv sammensat af flere celletyper, der gennemgår en kontinuerlig proces med fornyelse og reparation kaldet 'knogleombygning'. To hovedcelletyper, der er ansvarlige for knogleombygning, er osteoklaster, som resorberer knoglen, og osteoblaster, som danner ny knogle. Knogleombygning reguleres af flere systemiske hormoner (f.eks. Parathyreoideahormon, 1, 25-hydroxyvitamin D3, kønshormoner og calcitonin) og lokale faktorer (f.eks. Nitrogenoxid, prostaglandiner, vækstfaktorer og cytokiner). [1]
Osteoporose opstår, når resorption og dannelse af knogle er ukoordineret, og overskydende knoglenebøring overstiger knogleopbygningen. [2] Nuværende behandlinger for osteoporose omfatter bisfosfonater, calcitonin og østrogen, som er knogleresorptionshæmmere, der opretholder knoglemasse ved at hæmme osteoklastaktivitet. [3] Virkningen af disse lægemidler med hensyn til at øge eller genvinde knoglemassen er imidlertid relativt lille, bestemt ikke mere end 2% om året. [3] Der er derfor behov for knogleopbyggende midler, såsom teriparatid, der stimulerer ny knogledannelse og korrigerer den ændring i trabekulær mikroarkitektur, der er karakteristisk for etableret osteoporose. [4,5] Fordi ny knogledannelse primært er en funktion af osteoblasten, kan midler, der virker ved enten at øge spredningen af celler i osteoblastisk afstamning eller inducere differentiering af osteoblasterne, forbedre knogledannelsen. [5,6]
Selvom mekanismerne for osteoporose forbliver uklare, er de sandsynligvis relateret til den nedsatte tilgængelighed eller virkninger af knoglevækstfaktorer, såsom knoglemorfogenetiske proteiner (BMP'er). [7] BMP'er, der er strukturelt relateret til den transdannende vækstfaktor-b-superfamilie, blev oprindeligt identificeret ved deres evne til at fremkalde ektopisk knogledannelse hos gnavere. [8] BMP'er spiller en vigtig rolle i knogledannelse og knoglecelledifferentiering ved at stimulere alkalisk fosfataseaktivitet (ALP) samt syntesen af proteoglycan, kollagen og osteopontin (OPN). [9] En nylig undersøgelse fandt en sammenhæng mellem osteoporose og specifikke polymorfier i BMP-2-, ALP- og OPN-generne, hvilket tyder på, at de er forbundet med udviklingen af osteoporose. [10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; forkortet CD) er en indfødt urt i Kina og anvendes i vid udstrækning i traditionel medicin som terapeutisk middel på grund af dets beroligende, smertestillende og immunstimulerende egenskaber. [11] Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at CD-ekstrakter kan stimulere immunitet,[12] fjerne frie radikaler[13] og øge aktiviteten af superoxiddisme. [14] Antiinflammatoriske og antioxidante midler har potentiale til at behandle osteoporose ved at øge knogledannelsen og /eller undertrykke knogleresorption. [15,16] Imidlertid er effekten af CD på knoglecellefunktionen endnu ikke blevet bestemt. Her rapporterer vi, at cd-ekstrakt ikke påvirkede spredning, migration eller sårhelingsaktivitet af dyrkede osteoblaster, men øgede ALP, BMP-2 og OPN-ekspression og knoglemineralisering. Derudover viser vi, at mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og nuklear faktor (NF)-kB signalveje kan være involveret i den CD-medierede stigning i genekspression og knoglemineralisering. I modsætning hertil undertrykte cd-ekstraktet ikke osteoklastogenese in vitro. Især forhindrede behandling af mus med CD-ekstrakt knogletab induceret af ovariektomi in vivo. Vores data tyder derfor på, at CD kan bruges til at stimulere knogledannelse til behandling af osteoporose.
Cistanche deserticola
Materialer og metoder
Cistanche deserticola ekstrakt og materialer
CD-ekstrakt blev købt hos Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Ekstraktion og isolering af CD blev fulgt som tidligere beskrevet (på grundlag af spektrale data har de identificeret den kemiske sammensætning, herunder beta-sitosterol, daucosterol, ravsyre, triacontanol, acteosid, betain og polysaccharid). [17] Kaninpolyklonale antistoffer, der er specifikke for p-ekstracellulære signalregulerede kinaser (ERK), ERK, p-p38, p38, p-c-Jun N-terminalkinaser (JNK), JNK, p-p65 og p65 blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA). Osteocalcin ELISA-sættet blev købt hos Biosource Technology (Nivelles, Belgien). De C-terminale telopeptider af type I kollagen ELISA kit blev opnået fra Cross Laps (Herlev, Danmark). Den dominerende-negative mutant p38 blev leveret af Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). JNK dominerende-negativ mutant blev leveret af Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). ERK2 dominerende-negativ mutant blev leveret af Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Alle andre reagenser blev opnået fra Sigma-Aldrich (St Louis, USA).
Cellekultur
Murine osteoblast cellelinjen MC3T3-E1 blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Cellerne blev dyrket i 95% luft, 5% CO2 med a-MEM, der blev suppleret med 20 mm HEPES og 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum, 2 mm-glutamin, penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 mg/ml).
Måling af mineraliseret knudedannelse
Mineraliseret knudedannelse blev evalueret som beskrevet. [18] Kort fortalt blev osteoblaster dyrket i et medium indeholdende C-vitamin (50 mg / ml) og b-glycerophosphat (10 mm) i to uger, og mediet blev skiftet hver tredje dag. Efter inkubation med cd-ekstrakt i 12 dage blev cellerne vasket to gange med 20 mm Tris-bufferet saltvand indeholdende
0,15 m NaCl (pH 7,4), fast i iskold 75 % (v/v) ethanol i 30 minutter og lufttørret. Calciumaflejring blev bestemt under anvendelse af alizarin rød-S farvning. Kort fortalt blev ethanol-faste celler og matrix farvet i 1 time med 40 mm alizarin rød-S (pH 4,2) og skyllet udførligt med vand. Den bundne plet blev elueret med 10% (w/v) cetylpyridiniumchlorid, og alizarin rød-S i prøverne blev kvantificeret ved at måle absorbans ved 550 nm og sammenlignet med en standardkurve. En mol alizarin rød-S binder selektivt ca. to mol calcium.
Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid
Total RNA blev ekstraheret fra osteoblaster ved hjælp af et TRIzol-kit (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Omvendt transkription blev udført under anvendelse af 2 mg total RNA og en oligo (dT) primer. [19,20] Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (qPCR) blev udført under anvendelse af TaqMan® et-trins PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Total cDNA blev tilsat (100 ng pr. 25 ml reaktion) med sekvensspecifikke primere og Taqman-sonder®. Alle målgenprimere og sonder blev købt kommercielt, herunder b-actin som en intern kontrol (Applied Biosystems). qPCR-assays blev udført i tre eksemplarer på et Ste- pOnePlus-sekvensdetekteringssystem (Applied Biosystems). Cykelbetingelserne var 10 minutters polymeraseaktivering ved 95 ° C efterfulgt af 40 cyklusser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s. Tærsklen blev sat over den ikke-skabelonkontrolbaggrund og inden for den lineære fase af målgenamplifikation for at beregne det cyklusnummer, hvor transkriptet blev detekteret (betegnet CT).
Western blot analyse
Cellelysater blev fremstillet som beskrevet tidligere. [21,22] Proteiner blev opløst af SDS-PAGE og overført til Immobilon polyvinyldifluoridmembraner (Millipore, Billerica, USA). Pletterne blev blokeret med 4% bovin serumalbumin i 1 time ved stuetemperatur og derefter undersøgt med kanin anti-humane antistoffer mod p-65 eller p-p65 (1: 1000) i 1 time ved stuetemperatur. Efter tre vaske blev blotterne inkuberet med peroxidase-konjugeret æsel-anti-kanin sekundært antistof (1: 1000) i 1 time ved stuetemperatur. Blotne blev visualiseret ved forbedret kemiluminescens ved hjælp af X-OMAT LS-film (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Ovariektomi-induceret osteoporose
Kvindelige ICR-mus, fire uger gamle, 22 ~ 28 g, blev brugt til denne undersøgelse. Mus blev ovariektomiseret bilateralt under trichlor-acetaldehyd (100 mg / kg) anæstesi og kontrolmus var sham-opereret (Sham) til sammenligning. Knoglemineraltæthed og knoglemineralindhold blev målt efter oral administration af forskellige koncentrationer af CD-ekstrakter hver anden dag i fire uger. Den samlede kropsknoglemineraltæthed og knoglemineralindhold blev bestemt af et røntgenabsorptiometer med dobbelt energi (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) ved hjælp af en tilstand til små emner som beskrevet tidligere. [18,23] Alle protokoller overholdt institutionelle retningslinjer og blev godkendt af Animal Care Committee of China Medical University.
Statistisk analyse
Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Prisme 4.01soft- ware. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). De angivne værdier er gennemsnitlige ± SEM. Statistisk analyse mellem to prøver blev udført ved hjælp af den studerendes t-test. Statistiske sammenligninger af mere end to grupper blev udført ved hjælp af envejsanalyse af varians med Bonfer-Ronis posthoc-test. I alle tilfælde er P< 0.05="" was="" considered="">
Cistanche deserticola ekstrakt
Resultater
Cistanche deserticola ekstrakt øger knoglemineralisering ved osteoblaster
Tilsætningen af CD-ekstraktet i 24 eller 48 timer påvirkede ikke spredningen af museosteoblast MC3T3-E1-celler i et MTT-assay (data ikke vist). Fordi osteoblastdifferentiering er en kompleks proces, der involverer celleproliferation og migration, testede vi også MC3T3-E1-cellernes migrationsevne efter behandling med cd-ekstrakt. Ved hjælp af Transwell og sårhelingsassays fandt vi, at cd-ekstrakt ikke påvirkede osteoblastmigration (data ikke vist). Dannelsen af mineraliserede knuder er en af markørerne for osteoblastmodning. Alizarin rød S-farvning viste, at mineraliserede knuder dannes, når osteoblaster dyrkes i to uger i et medium indeholdende C-vitamin (50 mg / ml) og b-glycerophosphat (10 mm), og dette blev øget på en koncentrationsafhængig måde ved tilsætning af CD (figur 1a). Derfor inducerede CD-ekstrakt knogleknudedannelse ved dyrkede osteoblaster, men ikke deres spredning eller migration. Vi undersøgte også CD-ekstraktets rolle i RANKL-induceret osteoklastogenese, men fandt ingen effekt (data ikke vist).
Cistanche deserticola ekstrakt øger alkalisk phosphatase, knoglemorfogenetisk protein-2 og osteopontinekspression i dyrkede osteoblaster
Differentierede osteoblaster udviser forhøjet ALP-aktivitet, hvilket korrelerer med høje niveauer af enzymekspression. [18] Vi fandt ud af, at behandling med cd-ekstrakt i 72 timer signifikant øgede osteoblast ALP-aktiviteten (figur 1b). I betragtning af BMP-2's, ALP's og OPN's afgørende rolle i osteoblastdifferentiering testede vi, om cd-ekstrakt udøver sin virkning på osteoblastdifferentiering ved at regulere BMP-2, ALP og OPN-ekspression. Behandling af celler med CD-ekstrakt øgede mRNA-ekspressionen af ALP, BMP-2 og OPN på en koncentrationsafhængig måde (figur 1c), hvilket viste, at CD-ekstrakt inducerede differentiering af osteoblaster ved at opregulere ALP, BMP-2 og OPN-ekspression.
Cistanche deserticola ekstrakt øger knogleknudedannelsen gennem mitogenaktiveret proteinkinasevej
Det er blevet rapporteret, at MAPK spiller en vigtig rolle i knogledannelse[24,25], så vi undersøgte derefter, om denne signalvej er involveret i CD-ekstraktinduceret knoglemineralisering. Forbehandling af celler med ERK-hæmmer U0126, p38-hæmmer SB203580 eller JNK-hæmmer SP600125 reduceret CD-ekstrakt-øget knoglemineralisering (figur 2a, 3a og 4a). Desuden blokerede hæmmerne også CD-ekstraktinduceret ALP, BMP-2 og OPN-ekspression (figur 2b-4c). Transfektion af celler med ERK2-, p38- eller JNK-mutant reducerede CD-ekstraktforøgelsen i ALP-, BMP-2- og OPN-mRNA-ekspression (figur 2c, 3c og 4c). Dernæst undersøgte vi direkte ERK-, p38- og JNK-aktiveringen efter CD-ekstraktbehandling. Inkubation af celler med CD-ekstrakt induceret ERK, p38 og JNK fosforylering (figur 2d, 3d og 4d). Derfor formidler ERK, p38 og JNK den øgede knogledannelse induceret af CD-behandling af osteoblaster.
Cistanche deserticola ekstrakt øger knogleknudedannelsen gennem den nukleare faktor-kB-vej
Som tidligere nævnt er NF-kB-aktivering nødvendig for knogledannelse. [26,27] Vi behandlede derefter osteoblaster med NF-kB-hæmmerne pyrrolidin dithiocarbamat (PDTC) og N-tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TPCK) blev købt fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland) for at afgøre, om NF-kB-aktivering er involveret i CD-ekstraktinduceret knoglemineralisering. Figur 5a viser, at forbehandling af osteoblaster med PDTC eller TPCK hæmmede CD-ekstraktinduceret knogleknudedannelse og også reducerede stigningen i ALP,BMP-2 og OPN-ekspression (figur 5b og 5c). Fosforylering af NF-kB p65-underenheden er en indikator for NF-kB-aktivering; [28] I overensstemmelse med dette fandt vi, at cd-ekstrakt øgede p65-fosforylering i osteoblasterne (figur 5d). Disse resultater viste, at NF-kB-aktivering er vigtig for CD-ekstraktinduceret ALP, BMP-2 og OPN-ekspression og knogleknudedannelse.
Inhibering af knogletab ved Cistanche deserticola-ekstrakt i ovariektomiserede mus
For at undersøge effekten af CD-ekstrakt på knogletab blev osteoporose induceret hos hunmus ved ovariektomi. Som forventet viste ovariektomiserede mus nedsat total kropsknoglemineraltæthed og knoglemineralindhold (figur 6a og 6b). Behandling med cd-ekstrakt i fire uger hæmmede tabet af knoglemineraltæthed og knoglemineralindhold på en dosisafhængig måde (figur 6a og 6b). Blodkoncentrationer af ALP kan afspejle osteoblastisk aktivitet. [29] Som vist i figur 6c hæmmede CD-ekstrakt faldet i serum-ALP-aktivitet induceret af ovariektomi. Derudover øgede CD-ekstrakt også niveauet af osteocalcin, en markør for knogledannelse, og reducerede niveauet af C-terminale telopeptider af type I-kollagen, en markør for knogleresorption (figur 6d og 6e). Disse resultater understøtter således styrken og effektiviteten af CD-ekstrakt til forebyggelse af knogletab in vivo.
Diskussion
Cistanche deserticolaMa, en indfødt urt i Kina, anvendes i vid udstrækning i traditionel medicin til forskellige terapeutiske behandlinger på grund af dets beroligende, smertestillende og immunstimulerende aktivitet. [11–15] Her viste vi, at cd-ekstrakt inducerede knoglemineralisering i dyrkede osteoblaster, men ikke påvirkede deres cellemigration eller proliferation. Derudover fandt vi, at ALP, BMP-2 og OPN er målproteiner af CD-ekstraktinduceret signalering, hvilket kræver aktivering af ERK, p38, JNK og NF-kB.
Knogle er et komplekst væv sammensat af flere celletyper, der kontinuerligt gennemgår en proces med fornyelse og reparation. [30] Når resorption og dannelse af knogle er ubalanceret, tilsidesætter knoglenedbrydning knogledannelse og osteoporoseresultater. [30] Vi brugte ovariektomiserede mus til at undersøge den anti-osteoporotiske virkning af CD-ekstrakt. Ovariektomiserede mus havde reduceret den samlede kropsknoglemineraltæthed og knoglemineralindhold, hvilket blev lindret ved behandling med cd-ekstrakt. CD-ekstrakt øgede også serumniveauerne af den osteogene markør ALP og osteocalcin. Derfor er CD'en et knogledannelsesmiddel, der forhindrer knogletab forårsaget af ovariektomi in vivo.
Selvom mekanismerne for osteoporose ikke er helt klare, er de sandsynligvis relateret til den nedsatte tilgængelighed eller nedsatte virkninger af knoglevækstfaktorer, såsom ALP, BMP-2 og OPN. Disse tre faktorer spiller vigtige roller i processen med knogledannelse og ombygning,[31] og det er veldokumenteret, at stimulering af osteoblastcelledifferentiering hovedsageligt er karakteriseret ved øget ekspression af ALP, BMP-2 og OPN. [32] I denne undersøgelse fandt vi, at CD-ekstrakt øgede ALP-, BMP-2- og OPN-ekspression og forbedrede knoglemineralisering. Derfor medierer CD-ekstrakt knogledannelse delvist ved at opregulere ekspressionen af ALP, BMP-2 og OPN.
Det er blevet rapporteret, at p38 er involveret i reguleringen af ALP-ekspression under differentieringen af osteoblastiske celler; [33] På samme måde er ERK1/2 vigtig for spredning og differentiering af osteoblaster. [34,35] JNK er involveret i osteoklastdannelse. [36] Vi viste her, at CD-ekstrakt inducerede ERK-, p38- og JNK-fosforylering, og hæmmere af disse enzymer antagoniserede CD-ekstraktmedieret potensering af knoglemineralisering, hvilket tyder på, at ERK-, p38- og JNK-aktivering spiller en obligatorisk rolle i CD-ekstraktinduceret knogledannelse ved osteoblaster. Derudover reducerede enzymhæmmere og dominerende-negative mutanter af ERK, p38 og JNK CD-ekstraktforstærket ALP-, BMP-2- og OPN-ekspression. Disse data tyder på, at aktivering af ERK-, p38- og JNK-veje er nødvendig for at øge ALP-, BMP-2- og OPN-ekspression og modning forårsaget af CD-ekstrakt i osteoblaster. ERK er blevet rapporteret at øge osteoblast proliferation og differentiering. [34,35] Vi opdagede imidlertid ikke en effekt af cd-ekstrakt på osteoblastproliferation. Derfor kan andre veje have modvirket ERK-effekten efter CD-ekstraktstimulering eller være nødvendige for spredning. I denne henseende har vi fundet ud af, at PI3K- og Akt-hæmmere også reducerer CD-ekstraktinduceret knoglemineralisering og ALP-, BMP-2- eller OPN-mRNA-ekspression (data ikke vist). Derfor kan disse veje være nødvendige for CD-ekstrakt-induceret knogledannelse.
NF-kB har vist sig at kontrollere osteoblastfunktionen i knoglen. [37] Resultaterne af denne undersøgelse viser, at NF-kB-aktivering bidrager til CD-ekstraktinduceret knoglemineralisering og ALP-, BMP-2- og OPN-ekspression i dyrkede osteoblaster, og at hæmmere af den NF-kB-afhængige signalvej (PDTC og TPCK) hæmmede CD-ekstraktinduceret knoglemineralisering og ALP-, BMP-2- og OPN-ekspression. p65 fosforyleres ved Ser536 af en række kinaser i flere signalveje, hvilket forbedrer p65-transaktiveringspotentialet. [38] Resultaterne af denne undersøgelse viste, at CD-ekstrakt øgede fosforyleringen af p65. Samlet set tyder disse resultater på, at NF-kB-aktivering er nødvendig for CD-ekstraktinduceret knogledannelse i dyrkede osteoblaster. Vi fandt også, at ERK-, p38- og JNK-hæmmere vendte CD-ekstraktinduceret NF-kB luciferaseaktivitet (data ikke vist), i overensstemmelse med at disse enzymer var opstrøms mediatorer af CD-ekstraktinduceret NF-kB-aktivering. Derfor inducerer CD-ekstrakt knogledannelse gennem ERK / p38 / JNK / og NF-kB veje.
Konklusioner
Denne undersøgelse viste, at cd-ekstrakt inducerer osteoblastdifferentiering og modning, men ikke spredning eller migration. CD-ekstrakt øgede også ALP, BMP-2 og OPN ekspression og knoglemineralisering. Vi viste, at ERK-, p38-, JNK- og NF-kB-vejene er involveret i CD-ekstraktmedieret knogledannelse og ALP-, BMP-2- og OPN-ekspression. Desuden forhindrede CD-ekstrakt in vivo knogletab induceret af ovariektomi. Derfor kan CD være gavnligt til at stimulere knogledannelse i behandlingen af osteoporotiske sygdomme.
