Ekstraktion af phenylethanoidglycosider fra Cistanche Tubulosa ved højhastigheds-skæringshomogeniseringsekstraktion

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei og Ruili Guo

Baggrund:

Cistanche tubulosaer en velkendt traditionel kinesisk medicin med oprindelse i Xinjiang. Det er vidt udbredt i det nordlige Afrika, Indien osv. Formål: Den vigtigste bioaktive komponent afC. tubulosaer phenylethanoid glycosider (PhGs). Echinacosid og acteosid er de vejledende komponenter til bestemmelse af PhG'er og bruges hovedsageligt til leverbeskyttelse, immunbeskyttelse osv. Derfor er det meget vigtigt at udvinde phG'erne fra C. tubulosa. Metoder: I denne undersøgelse blev metoderne til ultralydsassisteret ekstraktion (UAE), mikrobølgeassisteret ekstraktion (MAE) og high-speed shearing homogenization extraction (HSHE) sammenlignet. Yderligere blev ekstraktionsbetingelserne for HSHE-metoden optimeret. Resultater: Resultaterne viste, at HSHE-metoden var bedre end både UAE- og MAE-metoderne, og de optimale ekstraktionsparametre for HSHE var en ethanolkoncentration på 50 procent, en ekstraktionstemperatur på 70 grader, en rotationshastighed på 16000 rpm, en ekstraktionstid på 2 minutter, et faststof-til-væske-forhold på 1:9 og en ekstraktionscyklus. Udbyttet af echinacosid og acteosid var henholdsvis 1,366 og 0,519 procent, og overførselshastighederne for echinacosid og acteosid nåede henholdsvis 87 og 94 procent. Konklusioner: Det kan konkluderes, at HSHE-metoden er en enkel, hurtig og effektiv teknik til at udvinde PhG'er fra C. tubulosa. Højdepunkter: En effektiv og miljøvenlig HSHE-metode er blevet undersøgt til udvinding af PhG'er fra C. tubulosa. De optimale betingelser for HSHE-metoden til ekstraktion af PhG'er fra C. tubulosa blev opnået. Denne forskning giver en ny metode til industriel udvinding af phG'er fraC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaer en almindelig traditionel kinesisk medicin, der stammer fra Xinjiang. Det er vidt udbredt i det nordlige Afrika, Den Arabiske Halvø, Pakistan og Indien og blev officielt registreret i den kinesiske farmakopé i 2010. Den vigtigste bioaktive komponent iC. tubulosaer phenylethanoidglycosider (PhGs), en klasse af vandopløselige naturprodukter, herunder echinacosid, acteosid, isoacteosid og 2-acetylacteosid (1, 2). Strukturen af ​​PhG'er består af kanelsyre- og hydroxyphenylethyldele, som begge er knyttet til en -glucopyranose gennem henholdsvis ester- og glycosidbindinger (3). Farmakologiske undersøgelser har vist, at PhG'er fra C. tubulosa har mange medicinske funktioner, såsom anti-træthed (4), neurobeskyttende (5-7), leverbeskyttende (8-10) og immunbeskyttende virkninger (11). Derfor er den effektive udvinding af PhG'er fra C. tubulosa af stor betydning for udvikling og udnyttelse af naturprodukter.

De nuværende traditionelle ekstraktionsmetoder for phG'er er varm-refluksekstraktion, ultralydsassisteret ekstraktion (UAE) og mikrobølgeassisteret ekstraktion (MAE; 12-16). Disse metoder har forskellige ulemper, såsom lav effektivitet, lange ekstraktionstider og høje omkostninger. Sammenlignet med de traditionelle metoder er high-speed shearing homogenization extraction (HSHE) metoden en ny, ny ekstraktionsmetode og har fordelene ved hurtigere ekstraktionstider, mindre spild af opløsningsmidler, højere udbytter, enklere anordning og lettere betjening (17). Arbejdsprincippet for HSHE-metoden er baseret på en roterende indre fræser drevet af en højhastighedsmotor. En kraftig forskydningskraft frembringes af de indre og ydre skær for at forstyrre og blande prøverne. I mellemtiden forårsager skæreren med højhastighedsrotation trykforskelle mellem skærerens indre og ydre hulrum, hvilket resulterer i en masseoverførsel mellem prøverne og opløsningsmidlerne. Med kombinationen af ​​høj forskydningskraft, kollisionskraft, tryk og andre kræfter kan en opløselig balance mellem faste prøver og opløsningsmidler hurtigt opnås (18). Således kan ekstraktionsprocessen af ​​HSHE afsluttes på få minutter, og endda så hurtigt som dusinvis af sekunder (19-22).

For nylig er HSHE blevet udforsket i udvinding af bioaktive komponenter fra forskellige naturlige produkter (23-25). Cheng et al. brugt HSHE til at udvinde fem lignaner fra frugten af ​​Schisandra Chinensis (26). Resultaterne viste, at de optimale forhold var en ethanolkoncentration på 75 procent, en ekstraktionstid på 1 min, et faststof-til-væske-forhold på 1:19, en ekstraktionsspænding på 180 V og en prøvepartikel størrelse på 120 masker. Det samlede udbytte af de fem lignaner var 13,89 ± 0,014 mg/g under de optimerede betingelser. Tang et al. brugt HSHE til at opnå bioaktiv olie fra perilla frø (27). De optimale betingelser var en ekstraktionstid på 2 minutter, et faststof-til-væske-forhold på 1:10, en ekstraktionsspænding på 150 V og to ekstraktionscyklusser. Udbyttet af perilla frøolie nåede 59,3 procent. Ovenstående resultater indikerer, at HSHE har fordelene ved korte ekstraktionstider, lave omkostninger og høje udbytter. Der mangler dog forskning i HSHE's udvinding af phG'er.

I denne undersøgelse blev HSHE brugt til at udforske dets potentielle anvendelse i udvinding af phG'er fraC. tubulosa. Udbyttet af PhG'er blev bestemt ved HPLC. De tre ekstraktionsmetoder, HSHE, UAE og MAE, blev sammenlignet under de samme betingelser. Virkningerne af ethanolkoncentration, ekstraktionstemperatur, rotationshastighed, ekstraktionstid, faststof-til-væske-forhold og antallet af ekstraktionscyklusser af udbyttet blev undersøgt. Fordele og ulemper ved dette arbejde og referencerne sammenlignes og diskuteres.

Materialer og metoder

Materiale og kemiske reagenser

C. tubulosablev købt fra Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Kina). Standarderne for echinacosid (renheder større end eller lig med 98 procent) og acteosid (renheder større end eller lig med 98 procent) blev købt fra Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, Kina). Acetonitril, methanol og eddikesyre var af HPLC-kvalitet (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Ethanol af analytisk kvalitet blev købt fra Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Kina). Deioniseret vand blev brugt gennem eksperimenterne.

HPLC-analyse

En HPLC-analyse blev udført på en Waters e2695 væskekromatografi (Waters, Milford, MA) udstyret med en 2489 UV/Visible Detector og en Symmetry C18-søjle (Waters), 250 × 4,6 mm, 5 μm partikelstørrelse. Koncentrationerne af echinacosid og acteosid blev analyseret ved HPLC-metoden. Den mobile fase bestod af (1) acetonitril og (2) en 2% vandig iseddikeopløsning. Gradientelueringsprogrammet er vist i tabel 1.

Den detekterede bølgelængde var 330 nm, flowhastigheden var 1 ml/min, injektionsvolumenet var 10 μL, og ovntemperaturen blev indstillet til 30 grader. Den kromatografiske top af analytten blev bekræftet ved at sammenligne dens retentionstid med den for standarderne. Kvantificering blev udført ved at integrere toppen ved hjælp af en ekstern standardmetode.

Præcisionstesten blev udført ved at injicere de samme ekstraktionsprøver fem gange. Til stabilitetstesten blev de samme prøver analyseret i intervaller på 0, 1, 2, 4, 12, 24 og 48 timer. Genfindingstestene af echinacosid og acteosid blev udført ved at tilføje standarderne til ekstraktionsprøverne. Alle toparealer og retentionstider for echinacosid og acteosid blev registreret. Resultaterne af kalibreringskurverne for echinacosid og acteosid er anført i tabel 2.

Beregning af Udbyttet

Echinacosid og acteosid blev brugt som de vejledende komponenter til bestemmelse af PhG'er. Udbyttet af echinacosid eller acteosid blev beregnet ved hjælp af følgende ligning:

Y=CV/B×100 procent (1)

hvor Y=udbytte af echinacosid eller acteosid (procent); C=koncentrationer af echinacosid eller acteosid (mg/ml); V=volumen af ​​ekstraktionsopløsningen (ml); og W=vægt af C. tubulosa-pulveret (mg).

Ekstraktionsmetoder for PhG'er

Stænglerne af C. tubulosa blev først fræset af en elektrisk kværn (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Kina) og filtreret med en filtersigte (ca. 380 μm). Derefter blev C. tubulosa-pulveret tørret i ovnen ved 70 grader, indtil vægten var konstant. Fem gram C. tubulosa-pulver blev blandet med ekstraktionsopløsningsmidlet og anbragt i en ekstraktionsflaske. Derefter blev den flydende blanding forvarmet (30-80 grader) i 5 minutter i et vandbad med konstant temperatur (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Kina).

(a) HSHE-metoden.-HSHE ​​blev udført af et FA25-system (FLUKO Co., Ltd, Shanghai, Kina), som bestod af den roterende fræser, højhastighedsmotor og controller. Rotationshastigheden af ​​den indre fræser blev reguleret i området 10000-28000 rpm, og ekstraktionstiderne blev justeret i området 2-15 min.

(b) UAE-metoden. Fem gram tørret prøve og 300 ml methanol blev nøjagtigt vejet og tilsat en ekstraktionsflaske. Ekstraktionsflasken blev nedsænket i et ultralydsbad og udført ved en ultralydseffekt på 300 W i 10 min. Ekstraktionstemperaturen blev indstillet til 30 grader.

(c) MAE-metoden. - Fem gram tørret prøve og 300 ml methanol blev nøjagtigt vejet og tilsat en ekstraktionsflaske. Ekstraktionsflasken blev sat i mikrobølgereaktoren og udført ved 180 W i 10 min. Ekstraktionstemperaturen blev indstillet til 30 grader.

HSHE-metoden blev sammenlignet med UAE- og MAE-metoderne med samme ekstraktionsopløsningsmiddel, ekstraktionstid, ekstraktionstemperatur, faststof-til-væske-forhold og ekstraktionscyklusnummer. Ekstraktionsopløsningen blev filtreret af en 0.22 μm membran og analyseret via HPLC for at bestemme koncentrationerne af echinacosid og acteosid. Alle ekstraktionsprocesserne blev gentaget tre gange

Fastsættelse af overførselssatser

Baseret på standardmetoden i 2015 China Pharmacopoeia blev echinacosid- og acteosidindholdet i C. tubulosa-pulver bestemt (28). Et gram C. tubulosa-pulver og 50 ml 50 procent methanol blev nøjagtigt vejet og tilsat til en 50 ml brun målekolbe. Den flydende blanding blev vejet og udblødt i 30 min. Derefter blev den brune målekolbe nedsænket i et ultralydsbad og udført ved en ultralydseffekt på 250 W og frekvens på 35 kHz i 40 min. Den flydende blanding blev vejet igen, og 50% methanol blev tilsat for at tilføre opløsningsmiddeltab. Ekstraktionsopløsningen blev filtreret af en 0,22 μm membran og blev analyseret ved hjælp af HPLC for at bestemme koncentrationerne af echinacosid og acteosid. Ekstraktionsprocesserne blev gentaget tre gange.

Overførselshastighederne for echinacosid eller acteosid blev beregnet ved hjælp af følgende ligning:

X= M1/M2 ×100 procent (2)

hvor X=overførselshastighed af echinacosid eller acteosid (procent); M1=kvalitet af echinacosid eller acteosid i ekstraktet (mg); og M2 =-kvalitet af echinacosid eller acteosid i C. tubulosa-pulver (mg).

Resultater og diskussion

Validering af HPLC-metoden

HPLC-profilerne for echinacosid og acteosid fra C. tubulosa ved anvendelse af HSHE er vist i figur 1. RSD for topområderne for echinacosid og acteosid var henholdsvis 1,89 og 1,40 procent. Resultaterne viste, at HPLC-metoden har god præcision i den kvantitative analyse af echinacoside og acteoside. På forskellige tidspunkter (0–48 timer) var RSD'erne for topområderne for echinacosid og acteosid henholdsvis 1,71 og 1,70 procent, hvilket indikerer, at prøven var stabil i 48 timer. Genfindelsen af ​​echinacosid og acteosid var henholdsvis 99,3 og 99,1 procent, og deres RSD var henholdsvis 0,70 og 0,67 procent, hvilket bekræftede HPLC-metodens pålidelighed.

Sammenligning af de forskellige ekstraktionsmetoder

En sammenligning af HSHE-metoden med MAE- og UAE-metoderne vedrørende udbytterne af echinacosid og acteosid blev udført, hvis resultater er vist i figur 2. Det blev observeret, at udbytterne af echinacosid og acteosid opnået med HSHE var højere end de opnåede af både MAE og UAE. Sammenlignet med MAE var udbyttet af echinacosid og acteosid opnået ved HSHE højere med henholdsvis 20,5 og 20,8 procent. Og sammenlignet med UAE var udbyttet af echinacosid og acteosid opnået af HSHE højere med henholdsvis 6,6 og 7,4 procent. Disse resultater indikerer, at HSHE betydeligt kan øge udbyttet af phG'er.

Optimering af HSHE-metoden

Ekstraktionsparametrene for PhG'er af HSHE inkluderer ethanolkoncentration, ekstraktionstemperatur, rotationshastighed, ekstraktionstid, faststof-til-væske-forhold og antallet af ekstraktionscyklusser (26, 29).

Effekt af ethanolkoncentration på udvinding af phG'er

Ethanolkoncentration er en vigtig faktor, der påvirker udbyttet af PhG'er. Som vist i figur 3 blev udbyttet af echinacosid og acteosid fra C. tubulosa under forskellige ethanolkoncentrationer undersøgt. Det afslørede, at udbyttet af echinacosid steg fra 0 til 30 procent og faldt derefter fra 30 til 90 procent med stigende ethanolkoncentrationer. Udbyttet af acteosid steg fra 0 til 70 procent og faldt derefter fra 70 til 90 procent med stigende ethanolkoncentrationer. Når ethanolkoncentrationen var 50 procent, var summen af ​​echinacoside- og acteosid-udbyttet på sit maksimum. De forskellige ethanolkoncentrationer har forskellige polariteter, hvilket fører til forskellige opløseligheder af echinacosid og acteosid. Den optimale ethanolkoncentration var således 50 procent.

Effekt af rotationshastighed på udvinding af phG'er

Figur 5 viser virkningerne af forskellige rotationshastigheder på udbyttet af PhG'er. Udbyttet af echinacosid og acteosid steg med stigende rotationshastigheder. Forøgelsen af ​​rotationshastigheden kan øge forskydningskraften af ​​den indre og ydre fræser og dermed øge udbyttet af PhG'er. Den optimale omdrejningshastighed var 16000 rpm.

Effekt af ekstraktionstid på ekstraktion af phG'er

Udbytterne af echinacosid og acteosid under de forskellige ekstraktionstider er vist i figur 6. Udbyttet af echinacosid og acteosid var stabile med stigende ekstraktionstider. Det kan derfor konkluderes, at PhG'er kan ekstraheres fuldstændigt fra C. tubulosa på 2 min, og den optimale ekstraktionstid var 2 min.

Virkning af faststof-til-væske-forhold på udvinding af phG'er

Som vist i figur 7 blev udbyttet af echinacosid og acteosid under de forskellige faststof-til-væske-forhold diskuteret. Udbyttet af echinacosid og acteosid steg fra 1:3 til 1:9 og blev stabilt fra 1:9 til 1:24. Fordi en lille mængde ekstraktionsopløsningsmiddel ikke fuldstændigt kan opløse echinacosid og acteosid, blev masseoverførselshastighederne reduceret. Den overdrevne udvinding af opløsningsmidler forårsagede unødvendigt spild. Derfor var det optimale forhold mellem faststof og væske 1:9.

Effekt af antallet af ekstraktionscyklusser på udvindingen af ​​phG'er

Figur 8 viser, at virkningerne af en række ekstraktionscyklusser på udbyttet af PhG'er. Udbyttet af echinacosid og acteosid steg med det stigende antal ekstraktionscyklusser. Ekstraktionstiderne steg dog bemærkelsesværdigt med stigende ekstraktionscyklusser, og der blev forbrugt mere energi. Det optimale antal ekstraktionscyklusser var én.

Sammenligning af HSHE-metoden med andre ekstraktionsmetoder til udvinding af phG'er

Resultaterne af HSHE-metoden sammenlignet med andre ekstraktionsmetoder til ekstraktion af phG'er fra C. tubulosa er anført i tabel 3. HSHE er enklere og nemmere end koblingsmetoderne såsom ultralydsassisteret vandig tofaseekstraktion og ultralydsmikrobølgeekstraktionsteknologi metoder. Derudover er ekstraktionstrykket for HSHE lavere end den tryksatte væskeekstraktionsmetode, og driftsbetingelserne for førstnævnte er sikrere. Endnu vigtigere kan det ses af tabel 3, at HSHE viser den korteste ekstraktionstid og det mindste opløsningsmiddelforbrug blandt alle ekstraktionsmetoderne. Det kan konkluderes, at HSHE-metoden har mange fordele såsom høj effektivitet, milde driftsforhold, lave forbrugsniveauer, enkelt udstyr og nem betjening til udvinding af naturprodukter.

Konklusioner

I denne undersøgelse er en effektiv og miljøvenlig HSHE-metode blevet undersøgt til udvinding af PhG'er fra C. tubulosa. Sammenlignet med UAE- og MAE-metoderne producerer den nye HSHE-metode et højere udbytte af PhG'er under de samme betingelser. Sammenlignet med MAE-metoden blev udbyttet af echinacosid og acteosid øget med henholdsvis 20,5 og 20,8 procent. Og sammenlignet med UAE blev udbyttet af echinacosid og acteosid øget med henholdsvis 6,6 og 7,4 procent. Ekstraktionsparametrene for HSHE af PhG'er fra C. tubulosa blev optimeret. Under de optimerede parametre nåede udbyttet af echinacosid og acteosid henholdsvis 1,366 og 0,519 procent, og overførselshastighederne for echinacosid og acteosid nåede henholdsvis 87 og 94 procent. HSHE-metoden har fordelene ved høj effektivitet, milde driftsforhold, lave forbrugsniveauer, enkelt udstyr, nem betjening og lave omkostninger. Denne forskning giver en ny metode til industriel udvinding af PhG'er fra C. tubulosa.