Opdagelse af nye STING-hæmmere baseret på strukturen af ​​musens STING-agonist DMXAA

Abstrakt:

Stimulator-of-interferon-gen-proteinet (STING) er involveret i medfødt immunitet. Lægemidlet DMXAA (5,6-dimethylxanthenon-4-eddikesyre) viste sig at være en potent murin-STING (mSTING)-agonist, men havde ringe effekt på human-STING (hSTING). I dette papir trækker vi på sammenligningen af ​​forskellige krystalstrukturer og protein-ligand-interaktionsforholdsanalyse for at vove hypotesen om, at lægemiddeldesignet af DMXAA-varianter har potentialet til at omdanne STING-agonister til inhibitorer. Baseret på vores tidligere opdagelse af to DMXAA-analoger, 3 og 4 (begge kunne binde til STING), optimerede vi dem strukturelt og syntetiserede henholdsvis nye derivater. I bindingsassays fandt vi, at forbindelser 11 og 27 repræsenterede STING-bindere, der var overlegne i forhold til de oprindelige strukturer, og diskuterede struktur-aktivitetsforhold. Alle målforbindelser var inaktive i cellulære assays til screening af STING-agonistisk aktivitet. Glædeligt identificerede vi 11 og 27 som STING-hæmmere med mikromolær aktivitet i både hSTING- og mSTING-veje. Derudover hæmmede 11 og 27 induktionen af ​​interferon og inflammatoriske cytokiner aktiveret af 20 3 0 -cGAMP uden tilsyneladende cytotoksicitet. Disse resultater bryder den rigide tankegang om, at DMXAA udgør det strukturelle grundlag specifikt for STING-agonister og åbner op for flere muligheder for at udvikle nye STING-agonister eller -hæmmere.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Nøgleord:

STIK; DMXAA; artselektivitet; STING-agonist; STING-hæmmer

1. Introduktion

Stimulator-af-interferon-genet (STING) er et essentielt signalmolekyle for iboende immunitet, der primært medierer cytoplasmatisk DNA-induceret naturlige immunresponser [1]. Når DNA-receptoren cyklisk guanosin-adenosinphosphatsyntase (cGAS) detekterer intracellulært dobbeltstrenget DNA, katalyserer cGAS syntesen af ​​2 0,30 -cGAMP (Figur 1), et cyklisk dinukleotid (CDN) i stand af direkte binding til og aktivering af STING på det endoplasmatiske retikulum [2-4]. Ved aktivering danner STING aggregater, der rekrutteres nedstrøms til TANK-bindende kinase 1 (TBK1) og binder interferon regulatorisk faktor 3 (IRF3), som phosphorylerer IRF3, aktiverer IRF3 dimerer ind i kernen, inducerer type I interferon (IFN) ekspression og initierer et interferon-immunrespons [1]. Mange undersøgelser har vist, at STING er involveret i patogenesen af ​​flere sygdomme, og at stimulering af STING inducerer effektive immunreaktioner på patogene infektioner og kræftformer; manglende modulering af kronisk inflammatorisk signalering fører imidlertid til autoimmune og inflammatoriske sygdomme [5-8]. På grund af STINGs grundlæggende rolle i reguleringen af ​​medfødt immunitet er et stort antal teams begyndt at udvikle STING-agonister eller -hæmmere.

Figur 1. Repræsentative STING-modulatorer

Forskning i førstegenerations STING-agonister fokuserede på strukturel modifikation af CDN-analoger for at omgå nogle begrænsninger af endogene CDN'er, såsom dårlig membranpermeabilitet og modtagelighed for hydrolyse af fosfataser [9,10]. Det lille molekyle STING-agonist 5,6-dimethylxanthenon-4-eddikesyre (DMXAA), som har vist terapeutisk løfte mod solide tumorer i musemodeller, kunne modvirke ulemperne ved CDN-derivater [11]. Lægemidlet fejlede imidlertid i kliniske forsøg på mennesker [12]. Det bekræftes yderligere, at DMXAA selektivt binder til murin STING (mSTING) snarere end til human STING (hSTING) [13,14], hvilket hæmmer det terapeutiske potentiale af DMXAA hos mennesker. 10-Carboxymethyl-9-acridinon (CMA) er en anden repræsentativ murin-specifik STING-agonist, der blev brugt som en potent type I IFN-inducer til antiviral terapi i begyndelsen af ​​1970'erne [15]. Derfor er artsselektivitet en afgørende faktor i udviklingen af ​​småmolekylære STING-agonister. Væsentlige nye skelet-hSTING-agonister er blevet bragt til syne af forskeres utrættelige indsats, herunder diABZI, SR717, MSA02 og andre [16-19].

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Stigende beviser viser, at STING-hyperaktivering er forbundet med autoinflammatoriske og autoimmune sygdomme. Det er nødvendigt at begrænse den overdrevne aktivering af STING-signalvejen, som fremhæver den potentielle værdi af STING-hæmmere. I modsætning til STING-agonister er udviklingen af ​​STING-hæmmere dog stadig i sin vorden, og ingen lægemiddelkandidater er gået ind i kliniske studier endnu. De kendte STING-hæmmere omfatter to typer forbindelser: kompetitive antagonister (SN-011 og Merck-18) og kovalente hæmmere (H151) [20-22]. De tidligere identificerede kovalente STING-hæmmere interagerer med Cys88/91 eller Cys91, som er placeret i det N-terminale transmembrane domæne af STING uden for den CDN-bindende lomme [22]. For nylig har to teams successivt rapporteret om to strukturelle typer af STING-antagonister, der optager 20 3 0 -cGAMP-bindingslommen for at hæmme aktiveringen af ​​20 3 0 -cGAMP, hvilket tyder på en dobbeltkantet effekt i CDN-bindingslommen [20 ,21].

Her giver vi et nyt perspektiv. Vi foreslår, at den nederste lomme, hvor DMXAA og CMA er placeret, letter udviklingen af ​​STING-hæmmere baseret på vores dybe data mining og sammenligning af co-krystalstrukturinformationen af ​​de identificerede STING-proteiner. Vores tidligere undersøgelse rapporterede en række CMA- og DMXAA-analoger og identificerede forbindelser 3 og 4, som binder til hSTING, men med svag cellulær styrke [23] (figur 2).

Figur 2. Kemiske strukturer af forbindelser 3 og 4 med data om deres biologiske aktiviteter. EC50-værdier af forbindelser 1-4 blev målt af STING-reporterceller, og de bindende IC50'er blev målt med STING-konkurrencebindingssæt.

I dette papir, vedrørende design af STING-hæmmere til at opdage mere potente bindemidler med flere kontakter i bundlommen, udførte vi strukturelle optimeringer for henholdsvis 3 og 4. Efterfølgende gennemførte vi et SAR-studie baseret på konkurrencebindende assays. Ved bioaktivitetsevaluering virkede forbindelser 11 og 27 som bredspektrede bindere og udviste mikromolære niveauer af STING-hæmmende aktivitet i flere rapporterede celler. Med hensyn til docking-struktur holder to forbindelse 11-molekyler hSTING i en inaktiv "åben" konformation, hvilket kompetitivt hæmmer endogen 20 3 0 -cGAMP-binding, som ligner krystalstrukturen af ​​Merck-18 og dockingstrukturen af SN-011 [20,21].

2. Resultater

2.1. Designstrategi for DMXAA-derivater som STING-hæmmere

2.1.1. Identifikation af designsteder for STING-hæmmere ved at sammenligne forskellige krystalstrukturer

Apo-proteinet fra STING-ligandbindingsdomænet (LBD) krystalliserede som en symmetrisk dimer i ikke-liganden, hvilket blev bevist ikke at være forårsaget af gelfiltrering og analytisk ultracentrifugeringsanalyse [24-26]. STING-dimeren antager en sommerfuglelignende konformation med ligandbindingsstedet placeret ved grænsefladen mellem de to monomerer. For det første undersøger dette papir de infrastrukturelle og aktiveringsmekanismer af hSTING- og mSTING-proteiner, sammenligner forskellene mellem dem, samt afslører nogle spændende indsigter. For apo-strukturen viser den naturlige konformation af begge proteiner, at mSTING er mere koncentreret end hSTING (figur 3). Shih et al. anvendte molekylær dynamik (MD) simuleringer til at studere forskellene mellem hSTING og mSTING, hvilket viser, at hSTING foretrækker en åben-inaktiv konformation, og mSTING foretrækker en lukket-aktiv konformation selv uden en ligand bundet [27].

Når den er bundet til 20,30 -cGAMP, er den konformationelle overgang af hSTING fra åben (apo-protein, lateral afstand ~57 Å) til lukket (cGAMP-bundet protein, lateral afstand ~40 Å), hvorimod det modsatte er sandt for mSTING (29 Å til 40 Å). Strukturen af ​​apo-hSTING adskiller sig dramatisk fra strukturen af ​​apo-mSTING, men strukturerne af STING kompleks med 20,30 -cGAMP overlapper hinanden. DMXAA, CMA og cGAMP er STING-agonister med forskellige strukturelle stilladser, men deres aktiveringskonformationer ved binding til mSTING-proteiner er også i det væsentlige de samme (figur 3). Scenarierne beskrevet ovenfor vidner om, at stimuleringsmekanismerne for hSTING og mSTING er slående divergerende; de konformationer, der aktiveres af STING, er imidlertid relativt konstante, uafhængige af arts-selektivitet og agonist-rygradstype (medens de er begrænset til STING-agonister, der medfører konformationelle ændringer). Bindingslommevolumen af ​​de forskellige krystalkomplekser er generelt konvergent (~300 Å3, tabel S1), hvilket er yderligere bevis på stabiliteten af ​​STING-proteinaktiveringskonformationen.

Figur 3. Sammenligning af apo- og forbindelsesbundne STING-krystalstrukturer. mSTING-proteinet er hvede (afstand testet med rød linje), PDB-kode: 4KC0 (apo), 4LOJ (bundet-cGAMP), 4LOL (bundet-DMXAA) og 4JC5 (bundet-CMA)

For det andet, baseret på ovenstående resultater af aktiveringskonformationel stabilitet, overlejrede vi co-krystalstrukturer af cGAMP, DMXAA, CMA, SR717 og MSA02, som er lukkede konformationelle STING-agonister, for at udforske positionen af ​​de forskellige strukturelle agonister i STING-proteinbindingssteder. Proteinlommen kan opdeles i to regioner: bundlommen og toplommen efter fordelingen af ​​STING-agonister i proteinlommen (figur 4a). Bortset fra at mSTING-agonister DMXAA og CMA er helt i bundlommen, kunne de andre agonister aktivere hSTING-vejen og ligge i den øvre region. Vi kortlagde derefter interaktionerne mellem de fem STING-agonister med aminosyrerester bundet til STING-proteinet (inden for 5 Å fra liganden; figur S1), hvilket viste, at de primære aminosyrer inkluderede R238, Y167, R232, S162, T263 og T267 (de mSTING-tilsvarende restsekvensnummer minus en). Tilpasning af resterne sekventielt til lommerne viste, at T267, T263 og S162 ligger i bundlommen; den øverste lomme indeholder R238, R232 og Y167 (Figur 4b). Som rapporteret er R238, Y167 og R232 essentielle for agonistbinding til STING, især R238 (mSTING-proteinet svarer til R237), hvis mutation ville resultere i et fuldstændigt tab af stabilisering (ligandbinding) [28-30]. Che et al. afslørede også, at nøgleresten R238 dominerer bindingen af ​​DMXAA, og punktmutationerne (S162A/E260I) kan forbedre interaktionen mellem R238 og DMXAA ved MD-simuleringer [31].

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

For at besætte mSTING-proteinlommen vedtog DMXAA eller CMA en unik bindingstilstand, hvor to småmolekylære agonister binder til en enkelt mSTING-homodimer. DMXAA'erne monteres solidt i bundlommen ved hjælp af hydrogenbindinger mellem ketogruppen og T266-sidekæden (hSTING svarer til 267), mens carboxylatgruppen interagerer med R237- og T262-sidekæderne (Figur 5a). Interaktionen mellem DMXAA og R237 (den eneste nøgleaminosyre i toplommen) er afgørende for mSTING-aktivitet. En ofte overset detalje er, at DMXAA kun kan virke på R237 af symmetriske monomere proteiner, for eksempel DMXAA (molekyle A), der påvirker R237B (figur 5a). Fordi DMXAA sidder i bunden, er afstanden mellem molekyle A og R237B 3,06 Å, mens afstanden til R237A er større end 5 Å (figur 5b). Ved at drage fordel af den mere kompakte lomme af mSTING-proteinet interagerer DMXAA ubesværet med R237 af den symmetriske mSTING-monomer, men der er ingen måde for DMXAA at associere med nogen af ​​R238 i det konformationelt åbne apo-hSTING-protein (figur 3). Derfor forringer lommepositionen af ​​DMXAA stimuleringen af ​​hSTING-vejen. For nylig har Merck, inspireret af DMXAA's bindingsforhold på 2:1, opdaget STING-antagonister, der er i stand til at optage bindingslommen [21]. Krystalkomplekset af Merck 18 og hSTING protein viser, at forbindelsen hovedsageligt er placeret under proteinlommen og interagerer med S162, T263 og T267, som alle matcher egenskaberne af DMXAA (figur 5c). Ud fra dette blev der genereret hypoteser: den øverste lomme er et fremragende hulrum til at designe STING-agonister; bundlommen er en mere velegnet rede til inhibitorer, og strukturen af ​​DMXAA eller CMA er optimeret til at have potentiale til at blive en STING-antagonist.

Figur 4. Underinddeling af STING-bindingsstederne og fordeling med nøgleaminosyrer. (a) Placering af to regioner i STING monomer. Den nederste lomme er farvet magenta og den øverste lomme er grøn. PDB-koderne for de overlappende krystalkomplekser er som følger: 4LOH (cGAMP, grøn), 6UKV (MSA-02, gul), 6XNP (SR717, orange), 4LOL (DMXAA, magenta) og 4JC5 (CMA, lilla). (b) Fordelinger af nøgleaminosyrer i de øverste og nederste regioner. Resterne i den nederste lomme er vist i magenta, og de grønne er i det øverste område.

Figur 5. Krystalkomplekser af DMXAA og Merck 18. (a) Intermolekylære kontakter i komplekset af DMXAA og mSTING. Den bundne DMXAA er vist i grå farve med individuelle STING-underenheder i den symmetriske dimer vist i grøn og lilla. A- og B-overskriften angiver proteinmonomer eller individuel ligandidentitet. (b) Afstande mellem nøgleresterne henholdsvis R237A og R237B og DMXAA (molekyle A). R237A til carboxyl af DMXAA er 6,02 Å, R237B til carboxyl af DMXAA er 3,06 Å. (c) Krystalstruktur af Merck 18 bundet til hSTING-protein (PDB 6MXE) og detaljer om dets intermolekylære kontakter. Den bundne ligand er vist i grå farve med individuelle STING-underenheder i den symmetriske dimer vist i grøn og lilla. A- og B-overskriften angiver proteinmonomer eller individuel ligandidentitet

Figur 6. Forskningsgrundlag og vores optimerede hotspots for DMXAA- og CMA-derivater. (a) Superposition af strukturen af ​​DMXAA bundet til mSTING (PDB: 4LOL, vist som mørkeblå) med strukturen af ​​DMXAA bundet til hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, vist som orange). (b) Detaljer om DMXAA bundet til muteret hSTING (PDB: 4QXR). De stiplede felter repræsenterer de potentielle modifikationssteder. Aminorester vist med grønt er muterede rester (S162A/Q266I).

Vi fandt ud af, at DMXAAs manglende evne til at aktivere hosting-vejen var relateret til placeringen af ​​DMXAA i bundlommen (i henhold til afsnit 2.1.1), hvilket også gav os designideen om STING-hæmmere: øge kontakterne for DMXAA-derivater med bundregionen gennem strukturelle modifikationer for at holde STING i en ikke-aktiveret konformation. S162 og Q266 ligger passende i bunden af ​​bindingsstedet, så DMXAA'er kan placeres godt i direkte kontakt med begge, hvilket letter udforskningen af ​​effekten af ​​bundlomme-aminosyrer på ligander. Analysen af ​​struktur-aktivitetsforhold (SAR'er) afslørede, at 5,6-dimethyldelen og C7--positionens methoxy var afgørende for den biologiske aktivitet af 3 og 4. Som vist i figur 6b er de 5 ,6-dimethylgruppe skabte hydrofobe interaktioner med flere aminosyrer i bundlommen; på grund af nærheden af ​​C7-positionen af ​​DMXAA til aminosyre Q266 tillod den tilsvarende methoxymodifikation 3 og 4 at binde til hosting. Derfor forudsatte vores strukturelle uddybninger låsning af 5,6-dimethyl og C7 methoxy, og designet af nye derivater fokuserede på at modificere den polære gruppe i C1/C2-positionen (påvirker S162) og ændre carboxylsyregruppen ( udvidelse af den strukturelle mangfoldighed). Vi designede og syntetiserede en række derivater ved hjælp af forbindelser 3 og 4 som stilladser, og validerede dermed vores foreslåede inhibitorformodning.

2.2. Kemi

Fremstillingen af ​​alle mellem- og målforbindelser er beskrevet i skema 1. 1-methoxy-2,3-dimethyl-4-nitrobenzen (5) og 2-brombenzoesyre ( 7) var kommercielt tilgængelige. Oprindeligt blev 1-methoxy-2,3-dimethyl-4-nitrobenzen omdannet til 4-methoxy- 2,3-dimethylanilin (6) via reduktion med jernpulver. Derefter blev 6 og 7 underkastet Ullmann-reaktion med kaliumcarbonat med katalyse med kobber og kobber(I)oxid i N,N-dimethylformamid for at tilvejebringe det tilsvarende mellemprodukt 8. Den intramolekylære kondensationsreaktion af 8 blev udført med Eatons reagens for at give mellemprodukt 2-methoxy-3,4-dimethylacridin-9(10H)-on (9). Den efterfølgende substitution af 9 blev udført med ethylbromacetat, og tabet af 1 ækv. HBr gav ethyl 2-(2-methoxy-3,4-dimethyl-9- oxoacridin-10(9H)-yl)acetat (10). Til sidst blev ethylacetat i 10 hydrolyseret til carboxylsyre med natriumhydroxid, hvilket gav 2-(2-methoxy-3,4- dimethyl-9-oxoacridin-10 (9H)-yl)eddikesyre (11).

Skema 1. a. EtOH, Fe, NH4Cl; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; c. Eatons reagens; d. BrCH2COOC2H5, NaH; e. NaOH; f. CCI3CH(OH)2, NH2OH; g. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.

Til den efterfølgende syntese af flere målforbindelser skal vi først syntetisere forbindelsen 2-amino-5-methoxy-3,4-dimethylbenzoesyre (14). 6 blev omsat med chloralhydrat og hydroxylamin under dannelse af acetamid og hydroxyamino med mellemproduktet (E)-2-(hydroxylamin)-N-(4-methoxy-2,3-dimethylphenyl Acetamid (12). Den efterfølgende Beckmann-omlejringsreaktion af hydroxyaminoen af ​​12 blev udført med svovlsyre for at give lactamderivat 13. Til sidst blev mellemprodukt 13 hydrolyseret med hydrogenperoxid og natriumhydroxid i ethanolopløsning, hvilket gav 14. Ved at bruge 14 som udgangsmateriale for reaktionen syntetiserede yderligere en serie af 8-methoxy-9,10-dimethyl-6Hpyrrolo[3,2,1-de]acridin-1,6( 2H)-dionderivater med substituenter ved R1 og R2. Indledningsvis blev 14 og 15-19 udsat for Ullmann-reaktion med kaliumcarbonat med katalyse af kobber og kobber(I)oxid i N,N-dimethylformamid for at give tilsvarende mellemprodukter 20-24. De intramolekylære kondensationsreaktioner på 20-24 blev udført med Eatons reagens for at give 8-methoxy-9,10-dimethyl-6H-pyrrolo[3,2,{{46} }de]acridin-1,6(2H)-dionderivater (25-29). På samme måde syntetiserede vi yderligere en række 7-methoxy-5,6-dimethyl-9-oxo-9, 6-dimethyl-9-oxo-9, ved at bruge 14 som udgangsmateriale for reaktionen 59}}dihydroacridin-4- carboxylsyrederivater med substituenter ved R. Indledningsvis blev 14 og 7 eller 30 underkastet Ullmann-reaktion med kaliumcarbonat med katalyse med kobber og kobber(I)oxid i N,N-dimethylformamid for at give tilsvarende mellemprodukter 31 og 32. De intramolekylære kondensationsreaktioner af 31 og 32 blev udført med Eatons reagens for at give 7-methoxy-5,6-dimethyl-9-oxo-9 ,10-dihydroacridin-4-carboxylsyrederivater (33,34). Således designet, syntetiserede og screenede vi 16 acridonanaloger, hvis strukturer er opsummeret i tabel 1.

Tabel 1. Strukturer af de nye analoger af den nuværende undersøgelse.

2.3. Bindingsevne af nye forbindelser til STING og deres SAR'er

Bindingsstyrker af nye forbindelser til STING og deres SAR'er For direkte at bekræfte effektiviteten af ​​den strukturelle modifikation screenede vi først alle de syntetiserede forbindelser ved cGAMP-fortrængningsassays. Ud over artsselektivitet er der fem varianter af STING, der er polymorfe hos mennesker, R232 (WT, 58 % af befolkningen), HAQ (20 %), H232 (13 %), AQ (7 %) og Q ( 2%) [32]. Derfor brugte vi de kommercielle konkurrenceassay-sæt ved homogen tidsopløst fluorescens (HTRF) teknologi til at teste den biokemiske styrke af nye forbindelser på mSTING og forskellige hSTING isoformer (WT, H232 og AQ) og sammenlignede dem med kontrollen. Som forventet var kontrolforbindelserne 1-4 alle bundet til mSTING; fra hSTING-screeningen havde forbindelser 3 og 4 IC50-værdier på det mikromolære niveau.

Tabel 2. Resultaterne af forbindelser med forskellige hSTING-isoformer og mSTING-konkurrencebindingsassays.

Først, baseret på forbindelse 3, blev et halogenatom eller en methoxygruppe indført på C1/C2-stedet (tabel 1). Forbindelse 27, som det optimale derivat af forbindelse 3 (Cl-position substitueret med F), har bedre samlet aktivitet end forbindelse 3 (encifret mikromolær aktivitet i alle biokemiske assays, tabel 2). Den R1-modificerede forbindelse 25 har en bredspektret bindingseffekt, men er ikke så aktiv som den F-substituerede eller usubstituerede version. Sammenlignet med forbindelse 3 viste forbindelserne (26, 28 og 29) med C2--stedet indført gruppe alle forskellige grader af fald i bindingsaffinitet, især forbindelse 29. For det andet, bevarelse af rygraden af ​​forbindelse 4 og erstatning halogenatomet mod C1/C2-stedet, opnåede vi forbindelser 35-38 (tabel 1). Disse forbindelser var inaktive i alle fire fortrængningsassays ved koncentrationer op til 100 µM, hvilket viser, at substitution med et halogenatom på C1/C2-stedet ikke tolereres. Derefter omdannede vi acetatgruppen på forbindelse 4 til en carboxylgruppe (33) og introducerede methoxy på C2-stedet (34). Desværre var denne ændring en fiasko, da begge forbindelser forblev inaktive. Ved at lære af vores fiasko udforskede vi yderligere SAR'erne for forbindelse 4-derivaterne ved at flytte acetatgruppen til N-positionen og efterlade C1/C2-positionerne umodificerede. Forbindelse 11 viser binding til en lang række STING-varianter, alle med IC50'er under 20 µM; aktiviteten er overlegen i forhold til forbindelse 4 og sammenlignelig med forbindelse 27. Derudover er forbindelse 9 (ingen carboxylgruppe på N-stedet) og forbindelse 10 (N-acetatethyl) syntetiske forstadier til forbindelse 11, der ikke kan binde til STING, hvilket indirekte demonstrerer betydningen af ​​carboxylsyregruppen.

2.4. Cellulær biologisk evaluering

2.4.1. In vitro-screening af nye analoger med STING-agonistaktiviteter

Vi screenede systematisk alle forbindelser for STING-agonistaktivitet ved hjælp af 293T hSTING-WT-, 293T-mSTING- og THP1-KO-STING-reportercellelinjerne (leveret af Invivo Gen). Ved hjælp af 293T-hSTING-R232-celler og 293T-mSTING-celler viste vi aktivering af IRF-vejen som et indirekte mål for type I IFN-induktion ved at overvåge sekretorisk embryonal alkalisk phosphatase (SEAP) aktivitet, hvilket bidrager til vores undersøgelse af artsselektiviteten af forbindelser. THP1-KO-STING-celler blev genereret fra THP1-dobbelte celler ved stabil knockout af STING-genet, og vi brugte THP1-KO-STING-celler til at bekræfte, om forbindelsen udviser funktionen af STING-afhængig cytokininduktion. Vi sammenlignede STING-agonistaktiviteterne for alle de målrettede derivater med dem af referenceagonisterne for murin (DMXAA) og human (20,30 -cGAMP) STING. Overraskende nok kunne ingen af ​​de syntetiserede forbindelser aktivere hverken hSTING- eller mSTING-vejene (maksimal koncentration ved 200 µM), hvilket er alvorligt inkonsistent med resultaterne af bindingsassays. Derfor kan vores screenede STING-bindingsmidler have potentielle bindingsmønstre som nye STING-antagonister.

2.4.2. In vitro-screening af STING-bindere med STING-hæmmeraktiviteter

Først lavede vi præ-eksperimenter: med den 1 µM kovalente inhibitor H151 som en positiv reference, udforskede vi dens hæmmende niveauer i mSTING- og hSTING-reportercellelinjer co-dyrket med forskellige koncentrationer af 20 3 0 -cGAMP for at bestemme de optimale betingelser til screening af inhibitoren (se afsnit 4.2.3 for protokoldetaljer). For det andet screenede vi indledningsvis den inhiberende styrke af de nye forbindelser ved behandling med de præ-eksperimentelle metoder i en koncentration på 100 µM. Vi fandt, at de bredspektrede STING-bindende forbindelser 11 og 27 udviste fremragende inhibering i både murine og humane STING-reporterceller, hvor forbindelser 3 og 4 og de andre forbindelser ikke var så effektive. For det tredje satte vi koncentrationsgradienter for forbindelser 11 og 27 for at teste begge IC50-værdier og sammenligne dem med H151. Forbindelser 11 og 27 var aktive ved mikromolære koncentrationer, der inhiberede 20 3 0 -cGAMP-induceret IFN-ekspression i både hSTING- og mSTING-veje.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Med IC50-værdier overgik forbindelse 11 (hSTING 19,93 µM og mSTING 15,47 µM) forbindelse 27 (hSTING 38,75 µM og mSTING 30,81 µM) (figur 7a). Til sammenligning var IC50-værdierne for H-151 i 293T-hSTING- og 293T-mSTING-celler 1,04 og 0,82 µM (figur 7a), hvilket indikerer, at den kovalente inhibitor H-151 udviser en bedre hæmmende effekt på STING -afhængig signalering i cellebaserede assays. For yderligere at bekræfte den hæmmende egenskab af forbindelser 11 og 27, anvendte vi en anden THP-1 human monocytreportercellelinje THP1-Dual-hSTING-R232, som bruger et dobbeltrapportersystem til at rapportere om IRF-aktivering som et indirekte mål for type I IFN-induktion og på NF-KB-aktivering som et indirekte mål for proinflammatorisk cytokininduktion. Efter THP-1-reportercellelinjestimuleringen med 20,30 -cGAMP tilføjede vi STING-hæmmere med passende koncentrationer til at hæmme induktionen af ​​I IFN og proinflammatorisk cytokin. Som forventet hæmmede forbindelser 11, 27 og H151 signifikant STING-udløste IRF- og NF-KB-vejaktiveringer (figur 7b). Derudover brugte vi CellTiter-Glo-kittet til at analysere cellulær aktivitet for at udelukke virkningen af ​​forbindelsernes cytotoksicitet på den inhiberende aktivitet. Glædeligt viste forbindelser 11 og 27 ingen tegn på cytotoksicitet for 293T- og THP-1-celler ved cellelevedygtighedsassay, når de blev tilsat i koncentrationer (5 til 100 µM), der hæmmer STING, i modsætning til H151, som allerede viste signifikant cytotoksicitet ved 10 µM (figur 7c). Disse undersøgelser identificerede forbindelser 11 og 27 som moderate STING-hæmmere, bryder artsfølsomhed og hæmmer IRF- og NF-KB-dobbeltvejene uden tilsyneladende cytotoksicitet.

2.5. Det strukturelle grundlag for aktiviteten af ​​forbindelse 11 blev undersøgt ved docking

Mekanismen for konkurrerende STING-antagonister er at optage bindingsstedet og forstyrre aktiveringskonformationen af ​​STING-proteinet [20,21]. Specifikt for hSTING forlader antagonister hSTING-dimeren i en "åben" konformation. Vi brugte Glide docking til at bestemme interaktionen mellem human STING CTD (PDB ID kode 6MXE) og den bedste aktive forbindelse 11. I docking strukturen er de to forbindelser 11 delvist parallelle med hinanden og ligger i bunden af ​​kløften af hSTING-dimeren (figur 8a), der låser hSTING i en inaktiv åben konformation (figur S2). Forbindelse 11 producerer hovedsageligt hydrofobe interaktioner, hvor den tricykliske struktur af liganden tillader mere kontakt med grænsefladen i bundlommen. Som med DMXAA eller CMA danner carboxylgruppen en hydrogenbinding med sidekæden af ​​T263, mens ketogruppen danner en hydrogenbinding med sidekæden af ​​T267. Methoxyen i position C2 interagerer intimt med S162, hvilket resulterer i ligand-ligand nærhed mod hinanden. Bis-methyl-substituenterne genererer ikke kun ligand-ligand-interaktioner, men er også bekvemt placeret ved indgangen til den øverste lomme, hvilket forhindrer bindingen af ​​naturlige STING-agonister til nøglerester (figur 8b).

Figur 7. Bredspektrede STING-bindere 11 og 27 er STING-antagonister. (a) Kemiske strukturer af forbindelser 11 og 27 og den hæmmende aktivitet af STING-hæmmere mod både m- og h-STING-veje. 293T-celler (mSTING eller hSTING), forbehandlet med forskellige koncentrationer af forbindelser, blev stimuleret af 20,30 -cGAMP; inhibering af IRF-pathway-aktiviteten blev indirekte målt ved optisk densitet (OD) værdier. Den dosisafhængige inhiberende kurve blev tilpasset til at beregne IC5-0-værdierne for forbindelser. (b) Forbindelser 11 og 27 kan inhibere aktiveringen af ​​hSTING-dobbeltveje. THP1-hSTING-R232-reportercellelinjer blev stimuleret med 20,30 -cGAMP og behandlet med forbindelserne, hvilket hæmmer IFN-induktionen (vurderer aktiviteten ved de relative lysenheder (RLU) af Lucia luciferase ) og proinflammatorisk cytokininduktion (overvågning af aktiviteten af ​​SEAP målt ved OD-værdier). (c) Nye analoger udviser lav cytotoksicitet i sammenligning med den kovalente inhibitor. 293T (eller THP-1-celler) blev inkuberet med den angivne koncentration af inhibitorer i de angivne tidsperioder. Cellelevedygtighed blev målt med CellTiter-Glo-kits. De viste data er gennemsnittet fra tre uafhængige eksperimenter. NS (ingen signifikant) p > 0,05, *** p < 0,001. p-værdier blev beregnet ved en to-halet t-test.

Figur 8. Dockingstruktur af forbindelse 11 bundet til STING-protein. (a) Bindingsmåde for forbindelse 11. Den bundne ligand er vist i grå farve med individuelle STING-underenheder i den symmetriske dimer vist i grøn og lilla. I bindingslommerne på STING-monomeren er bunden farvet magenta, og toppen er grøn. (b) De intermolekylære kontakter af forbindelse 11 er bundet til STING. Forbindelse 11 og kontaktede STING-aminosyrer er vist som en stick-model. De intermolekylære kontakter og hydrogenbindinger er vist med en gul stiplet linje. A- og B-overskriften angiver proteinmonomer eller individuel ligandidentitet.

3. Diskussion

I lyset af de omfattende rapporter om mekanismen og krystalstrukturen af ​​STING, har vi mulighed for at forklare det videnskabelige problem, hvorfor DMXAA ikke besidder human STING agonistisk aktivitet. I denne undersøgelse, ved sammenligning af forskellige STING-krystalstrukturer, opnåede vi nogle interessante resultater: 1. STING-aktiveringskonformationen er stabil; 2. Der er forskellige aktiveringsmekanismer for hSTING og mSTING; 3. DMXAA og CMA er i bunden af ​​bindingsstedet, hvilket adskiller dem fra andre agonister. I betragtning af de forskellige aktiveringsmekanismer af mSTING og hSTING kan mSTING-agonisterne DMXAA eller CMA placeret i bundlommen ikke udøve en aktivering i hSTING, fordi apo-hSTING har et større bindingshulrum, der forhindrer liganden i at associere med R238.

Gao et al. rapporterede, at enkelte mutationer (G230I, S162A og Q266I) giver hSTING den samme DMXAA-følsomhed som mSTING [33]. MD-simuleringer afslørede, at lågregionsmutationen G230I-sidekæden er tilstrækkelig til at danne en sterisk barriere for at forhindre DMXAA-udskillelse, hvorimod DMXAA let forlader hSTING WT [27]. Baseret på den strukturelle modifikation svarende til hSTING-punktmutationer (S162A/Q266I) i bindingsstedet, har væsentlige DMXAA- og CMA-analoger været tilgængelige, men ingen potente hSTING-agonister. Årsagen bag dette kan være, at den subtile strukturelle uoverensstemmelse mellem "naturlige" og "muterede" hSTING'er kan spille en afgørende rolle i genkendelsesprocessen. Gennem MD-simuleringer har Che et al. fandt, at de unaturligt muterede hSTING'er forstyrrer de koordinerede bevægelser af vandmolekyler og ændrer mængden af ​​vand, der udstødes ved ligandbinding, hvilket er mere befordrende for at genoprette DMXAA-aktivering af hSTING [31].

Opmuntret af undersøgelsens opdagelse af STING-hæmmere ved det nederste bindingssted [21], vover vi at forestille os, at DMXAA, der ligger i samme region, har potentialet til at blive transformeret til nye STING-hæmmere. I en tidligere undersøgelse fusionerede vi strukturerne af DMXAA og CMA med subtile strukturelle modifikationer og opdagede med succes 3 og 4, der kunne binde til hSTING, men deres svage STING-agonistiske aktivitet matcher ikke deres bindingsstyrke. I dette papir er designidéen yderligere at forbedre kontakterne mellem DMXAA-analoger med bundlommen for konkurrencedygtigt at modstå bindingen af ​​20,30 -cGAMP, så vi designede og syntetiserede optimerede strukturer af forbindelser 3 og 4.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Det første screeningstrin var at teste den biokemiske aktivitet under anvendelse af bindingssæt af flere STING-varianter for at karakterisere bindingsstyrken af ​​de nye derivater. Resultaterne af bindingsassays beviste, at vores designanvisninger var fornuftige; vi identificerede 11 og 27 som bredspektrede STING-bindere (overlegne end 3 og 4) og diskuterede SAR'er. For analogerne af forbindelse 3 forbedrede modifikationerne ved C1-positionen signifikant bindingen til forskellige STING-varianter, mens de C2-modificerede forbindelser ikke havde nogen effekt. Forbindelse 4 blev imidlertid ikke godt tolereret for strukturelle modifikationer i C1/C2. Efter at have flyttet carboxylsyrepositionen (C4 til N), fandt vi det bedre STING-bindemiddel 11 og bestemte, at carboxylsyregruppen var essentiel for aktivitet. Dernæst screenede vi alle forbindelser for aktivitet på cellulært niveau under anvendelse af tre reportercellelinjer, og ingen af ​​målforbindelserne var aktive. Derefter etablerede vi en screeningsmetode for STING-hæmmere og genscreenede alle nye analoger. STING-bindingsmidler 11 og 27 udviste mikromolære hæmmende aktiviteter med data, der kan sammenlignes med det konkurrerende bindingsassay. Den kovalente inhibitor H151 viste lidt bedre STING-hæmmende aktivitet end 11 og 27 in vitro. Derudover validerede vi yderligere, at 11 og 27 effektivt kan inhibere 20,30 -cGAMP-induceret aktivering af STING-dobbeltveje. Mest imponerende er det, at 11 og 27 opretholder et højt niveau af cellelevedygtighed ved høje koncentrationer, hvilket ikke er muligt med H151. Cytotoksicitet er et almindeligt problem med kovalente inhibitorer og begrænser anvendelsen af ​​H151.

Ved docking-analyse har vi opnået indsigt i det strukturelle grundlag for bedste aktive stof 11-aktivitet. Forbindelse 11 optager den nederste lomme perfekt og holder hSTING i en inaktiv åben konformation og dermed kompetitivt hæmmer 20,30 -cGAMP-binding. Strukturen af ​​den tricykliske ring af acridin er nøglen til at generere hydrofobe interaktioner, hvor carboxylsyregruppen og ketondelen forankrer forbindelsen i bunden af ​​lommen. Vi spekulerer i, at methoxy producerer intime associationer med S162, hvilket trækker proteinkonformationen marginalt lukket, men ikke nok til at gøre den til en agonistisk konformation. Bis-methyl-strukturen skaber en rumlig sted-blokering, der forbedrer ligand-ligand-interaktioner og forringer agonist-indtrængen i den øverste lomme. I øjeblikket er der ingen rapporterede co-krystal strukturer af mSTING og STING antagonister, så vi kan ikke forklare virkningsmekanismen af ​​forbindelse 11 med mSTING ved hjælp af en docking tilgang. Vi formoder dog, at der er to muligheder: Den ene er, at handleprincippet er identisk med hSTING; den anden er, at forbindelse 11 holder mSTING i en mere aggregeret apo-konformation, og 20,30 -cGAMP kan ikke komme ind i lommen for at udøve den agonistiske effekt. Sammenfattende har vores subtile strukturelle optimeringer af de svagere STING-agonister med succes vendt den biologiske funktion for at opdage STING-hæmmere. Disse resultater illustrerer kompleksiteten af ​​STING-bindingslommerne og giver ny forskningsindsigt i lægemiddeludviklingen af ​​STING-agonister eller -hæmmere.

4. Materialer og metoder

4.1. Kemi

Opløsningsmidler og reagenser anvendt i syntesen blev opnået fra Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, Kina). Produkternes strukturer blev identificeret ved 1H- og 13C-NMR-spektroskopi (JNM-ECA-400, Japan). Produkternes molekylvægte blev målt ved højopløsningsmassespektrometri (HRMS) med elektrosprayionisering (ESI) som ioniseringstilstand (Agilent 1260-G6230A, Tyskland). NMR og massespektre for forbindelserne er angivet i de supplerende materialer. Forbindelser 35-38 blev syntetiseret og identificeret af os; Se venligst den tidligere rapporterede artikel for detaljer [23].

Ethyl {{0}}(2-methoxy-3,4-dimethyl-9-oxoacridin-10 (9H)-yl)acetat (1{ {25}}): Til en opløsning af 4-methoxy{{10}},3-dimethylanilin (6) (0,97 g, 6,4 mmol) og 2-brom-benzoesyre (7) (1,29 g, 6,4 mmol) i DMF (6 ml) ved stuetemperatur, vi tilsatte efterfølgende pulveriseret Cu (0.05 g), Cu2O ({{60}}.05 g) og K2CO3 ({{186}},71 g, 5,1 mmol). Reaktionsblandingen blev opvarmet til 11 0 ◦C i 12 timer. Efter fjernelse af opløsningsmidlerne under et vakuum blev remanensen opløst i 1 N NaOH-opløsning (25 ml). Råproduktet blev opnået ved udfældning efter syrning af filtratet med kone. HCl. Efter tørring blev råproduktet tilsat til Eatons reagens (5 ml) ved stuetemperatur, hvorefter blandingen blev opvarmet til 90 ◦C i 1 time. Den afkølede reaktionsblanding blev tildryppet i mættet vandig NaHC03-opløsning. Bundfaldet blev filtreret for at opsamle det ru produkt. Oprensning af remanensen ved silicagelsøjlekromatografi gav 9, et bleggult fast stof (0,61 g, 37,7 % udbytte). En opløsning af NaH (1,43 mmol) og 9 (0,33 g, 1,3 mmol) i DMF (5 ml) ved stuetemperatur blev omrørt i 1 time og derefter afkølet til 5-7 ◦C. Ethylbromacetatet (0,43 g, 2,6 mmol) blev tilsat til den resulterende blanding og kontinuerligt omrørt ved stuetemperatur i 20 timer. Efter afslutning af reaktionen (TLC) blev reaktionsblandingen hældt i isvand (15 ml). De resulterende præcipitater blev filtreret fra, tørret og derefter ekstraheret med chloroform. Afdampning af opløsningsmidlet gav en rå ester, som blev oprenset ved omkrystallisation, hvilket gav 10, et gult fast stof (0,33 g, 76 % udbytte). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,30 (d, J=8,4 Hz, 1H), 8,08 (d, J=8,6 Hz, 1H), 7,75-7,67 (m 1H), 7,57-7,50 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 4,22 (q, J=7,1 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H) 2,77 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,21 (t, J=7,1 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) 5 (ppm): 169,25, 157,87, 155,96, 147,46, 146,72, 135,46, 132,15, 130,17, 129,15, 8, 8, 129,15, 8. 19,46, 95,26, 72,06, 61,28, 56,06, 14,59 , 14,34, 13,77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beregnet for C20H21NO4: 339,3910 fundet: 340,1546. 2-(2-methoxy-3,4-dimethyl-9-oxoacridin-10(9H)-yl)eddikesyre (11): En opløsning af 10 (0,37 g, 1,1 mmol) og NaOH (0,05 g, 1,3 mmol) i ethanol (20 ml) og vand (2 ml) blev opvarmet til 60 ◦C i 1 time. Efter fjernelse af opløsningsmidlerne blev den resulterende remanens opløst i vand og filtreret. Efter neutralisering af filtratet med konc. HCI, blev blandingen filtreret til opnåelse af det rå faste stof, efterfølgende omkrystalliseret med methanol til opnåelse af 11, et bleggult pulver (0,29 g, 85,7 % udbytte). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 10,51 (s, 1H), 8,33 (d, J=6,9 Hz, 1H), 8,04 (d, J=8,5 Hz, 1H 7,69 (s, 1H), 7,67-7,62 (m, 1H), 7,45 (t, J=6,8 Hz, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,31 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) 5 (ppm): 159,04, 155,63, 147,47, 146,64, 134,86, 131,52, 129,56, 128,98, 125,218, 5,91218, 5,91218, 91215. 01.77, 96.02, 74.81, 55.69, 14.42, 13.33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beregnet for C18H17NO4: 311,3370 fundet: 312,1229.

{{0}}chlor-8-methoxy-9,10-dimethyl-6H-pyrrolo [3,2,1-de]acridin{ {9}},6(2H)-dion (25): Til en opløsning af 6-carboxy-4-methoxy-2,3-dimethylbenzenaminium (14) (1,3 g, 6,4 mmol) og 2-(2-brom-4-chlorphenyl)eddikesyre (15) (1,6 g, 6,4 mmol) i DMF (6 ml) ved stuetemperatur, tilsatte vi efterfølgende pulveriseret Cu (0.05 g), Cu2O (0.05 g) og K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Reaktionsblandingen blev opvarmet til 110 ◦C i 12 timer. Efter fjernelse af opløsningsmidlerne under et vakuum blev remanensen opløst i 1 N NaOH-opløsning (25 ml). Råproduktet blev opnået ved udfældning efter syrning af filtratet med kone. HCl. Efter tørring blev råproduktet tilsat til Eatons reagens (5 ml) ved stuetemperatur, hvorefter blandingen blev opvarmet til 90 ◦C i 1 time. Den afkølede reaktionsblanding blev tildryppet i mættet vandig NaHC03-opløsning. Bundfaldet blev filtreret for at opsamle det ru produkt. Oprensning af remanensen ved silicagelsøjlekromatografi gav 25, et gult fast stof (0,80 g, 38,6 % udbytte). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,17 (d, J =8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,86 (d, J=6,9 Hz, IH), 7,51 (s, IH), 3,84 (s, 3H), 3,78 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beregnet for C18H14CIN03: 327,7640 fundet: 328,0734. 4-chlor-8-methoxy-9,10-dimethyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]acridin-1 ,6(2H)-dion (26): Syntesen af ​​denne forbindelse svarede til 25. 15 blev erstattet med 2-(2-brom-5-chlorphenyl)eddikesyre (16). Vi opnåede 0,82 g 26 som et bleggult fast stof med et udbytte på 38,7%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 7,73 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,64 (s, 2H), 2,36 (s, 3H), 2,13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beregnet for C18H14CIN03: 327,7640 fundet: 328,0734.

{{0}}fluor-8-methoxy-9,10-dimethyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]acridin{ {9}},6(2H)-dion (27): Syntesen af ​​denne forbindelse svarede til 25. 15 blev erstattet med 2-(2-brom-4-fluorphenyl)eddikesyre (17). Vi opnåede et dybt gult fast stof 27 med 0,84 g (42,1 % udbytte). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,21 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,23 (d, J {{39} },5 Hz, IH), 3,88 (s, 3H), 3,81 (s, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beregnet for C18H14FNO3: 311,3124 fundet: 312,1030. 4-fluor-8-methoxy-9,10-dimethyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]acridin-1 ,6(2H)-dion (28): Syntesen af ​​denne forbindelse svarede til 25. 15 blev erstattet med 2-(2-brom-5-fluorphenyl)eddikesyre (18). 0,81 g dybgult fast stof blev opnået (40,5 % udbytte). 1H NMR (400 MHz, DMSOD6) δ 7. 86 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,77 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beregnet for C18H14FNO3: 311,3124 fundet: 312,1030.

4,8-dimethoxy-9,10-dimethyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]acridin-1,6(2H )-dion (29): Syntesen af ​​denne forbindelse svarede til 25. 15 blev erstattet med 2-(2-brom-5-methoxyphenyl)eddikesyre (19). {{20}},73 g gult fast stof blev tilvejebragt med et udbytte på 35,2%. 1H NMR (400 MHz, DMSO D6) δ 7,93 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 ( s, 3H), 3,67 (s, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beregnet for C19H17NO4: 323,348 0 fundet: 324,1230. 7-methoxy-5,6-dimethyl-9-oxo-9,10-dihydroacridin-4-carboxylsyre (33): Til en opløsning af 6-carboxy-4-methoxy-2,3-dimethylbenzenaminium (14) (1,30 g, 6,4 mmol) og 2-brombenzoesyre (7) (1,29 g, 6,4 mmol) i DMF (6 ml) ved stuetemperatur tilsatte vi efterfølgende pulveriseret Cu (0,05 g), Cu2O (0,05 g) og K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Reaktionsblandingen blev opvarmet til 110 ◦C i 12 timer. Efter fjernelse af opløsningsmidlerne under et vakuum blev remanensen opløst i 1 N NaOH-opløsning (25 ml). Råproduktet blev opnået ved udfældning efter syrning af filtratet med kone. HCl. Efter tørring blev råproduktet tilsat til Eatons reagens (5 ml) ved stuetemperatur, hvorefter blandingen blev opvarmet til 90 ◦C i 1 time. Den afkølede reaktionsblanding blev tildryppet i mættet vandig NaHC03-opløsning. Bundfaldet blev filtreret for at opsamle det ru produkt. Oprensning af remanensen ved silicagelsøjlekromatografi gav 33, et bleggult fast stof (1,00 g, 52,7 % udbytte). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 13,00 (s, 1H), 10,28 (s, 1H), 8,01 (d, J=9,7 Hz, 1H), 7,69 (d , J=8,5 Hz, 1H), 7,48 (t, J=9,0 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,32 (s, 3H) 2,10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beregnet for C17H15NO4: 297,3100 fundet: 298,1073. 2,7-dimethoxy-5,6-dimethyl-9-oxo-9,10-dihydroacridin-4-carboxylsyre (34): syntese af denne forbindelse svarede til 33. 7 blev erstattet med 2-brom-5- methoxybenzoesyre (30). Det gule faste stof gav 1,05 g med et udbytte på 50,2%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 12,96 (s, 1 H), 10,45 (s, 1 H), 7,84 (s, 1 H), 7,54 (s, 1 H), 7,50 (s, 1 H), 3,84 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beregnet for C18H17NO5: 327,3360 fundet: 328,1179.

4.2. Biologisk assay

Muse STING-bindingssæt, humane STING WT-bindingssæt, humane AQ STING-bindingssæt og humane H232 STING-bindingssæt blev købt fra Cisbio. 293T mSTING (ISG/KI-IFNb) celler, 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb) celler, THP1-KI-hSTING-R232 celler, THP1-KO-STING celler blev købt fra Invivogen. 293T mSTING-celler og 293T hSTING-R232-celler blev dyrket under anvendelse af DMEM (Gibco, Waltham, MA, USA), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 4,5 g/L glucose (Sigma- Aldrich), 10 % FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen, San Diego, CA, USA) og suppleret med selektive antibiotika (Invivogen ) blasticidin (10 µM), hygromycin (100 µM) og zeocin (100 µM). THP1-KO-STING-celler og THP1-KI-hSTING-R232-celler blev dyrket under anvendelse af RPMI-1640 (Gibco), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich), 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich), 10 % varmeinaktiveret FBS (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen) og suppleret med selektive antibiotika (Invivogen) blasticidin ( 10 µM) og zeocin (100 µM). QUANTI-Blue-opløsningen, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP blev købt fra Invivogen. H151 blev opnået fra Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, Kina). CellTiter-Glo luminescerende cellelevedygtighedsanalysekit blev opnået fra Promega.

4.2.1. HTRF STING Binding Competitive Assay

I henhold til instruktionerne fra STING-bindingssæt blev følgende opløsninger successivt tilsat til hver brønd i 384-brøndpladen: 5 µL af detektionsforbindelserne eller 2 0,30 -cGAMP (positiv kontrol ) med forskellige koncentrationer eller fortyndingsmiddel (negativ kontrol); 5 µL humant STING 6His-mærket protein (negativ kontrolbrønd blev tilsat til detektionsbuffer); 10 µL STING-ligand d2 og Anti 6His-Tb3+ forblandet arbejdsopløsning. Efter forsegling af pladen og inkubation ved stuetemperatur i 3 timer blev fluorescensværdierne ved 665 nm og 620 nm aflæst. Forholdet mellem de to fluorescensintensiteter (665 nm/620 nm) blev anvendt til at estimere forbindelsernes bindingsstyrke. IC50-værdierne (50 % hæmmende koncentration) blev beregnet ved hjælp af softwaren GraphPad Prism.

4.2.2. Cellulært assay til screening af forbindelser for den agonistiske aktivitet

180 µL mængder af 293T mSTING-celler, 293T hSTING-R232-celler og THP1-KOSTING-cellesuspension blev fordelt i 96-brønds fladbundede plader med en tæthed på ~50,000 celler /brønd (293T) eller ~100,000 celler/brønd (THP1). En mængde på 20 µL af enten saltvand eller en saltvandsopløsning af en testforbindelse eller 20,30 -cGAMP som positiv reference blev tilsat, og cellerne blev inkuberet ved 37 ◦C med 5 % CO2 i 48 timer. Efterfølgende blev en mængde på 20 µL supernatant tilsat til en 96-brønd fladbundet plade, efterfulgt af 180 µL QUANTI-Blue-opløsning til hver brønd. Pladen blev inkuberet ved 37 ◦C i 3 timer, og SEAP-niveauer (IRF-pathway-aktiviteten) blev bestemt ved hjælp af et spektrofotometer ved 620-655 nm.

4.2.3. Cellulært assay til screening af forbindelser for inhiberende aktivitet

Præ-eksperiment: 180 µL 293T mSTING-celler, 293T hSTING-R232-celler (~50,000 celler/brønd) blev stimuleret i 48 timer ved 37 ◦C i en 5 % CO2-inkubator med 10 µL 20,30 -cGAMP (3,125 µM, 6,25 µM) og 10 µL H151 (1,0 µM ). Efterfølgende blev en mængde på 20 µL supernatant tilsat til en 96-brønd fladbundet plade, efterfulgt af 180 µL QUANTI-Blue-opløsning til hver brønd. Pladen blev inkuberet ved 37 ◦C i 3 timer, og SEAP-niveauer (IRF-pathway-aktiviteten) blev bestemt ved hjælp af et spektrofotometer ved 620-655 nm. 180 µL 293T mSTING-celler, 293T hSTING-R232-cellesuspension blev fordelt i 96-brønds fladbundede plader med en tæthed på ~50,000 celler/brønd. En mængde på 10 µL 2 0,30 -cGAMP (3,125 µM) og forbindelse 11 eller forbindelse 27 (0,78 µM, 1,56 µM, 3,13 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 5 µM, µM, µM, µM, µM, µM, µM, µM, µM, µM, 1,56 µM, 3,13 µM, µM) eller H151 (0,08 µM, 0,16 µM, 0,31 µM, 0,63 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM) blev tilsat, og cellerne blev inkuberet ved 37 ◦C i 4 t C02. Efterfølgende blev en mængde på 20 µL supernatant tilsat til en 96-brønd fladbundet plade, efterfulgt af 180 µL QUANTI-Blue opløsning til hver brønd. Pladen blev inkuberet ved 37 ◦C i 3 timer, og SEAP-niveauer (IRF-pathway-aktiviteten) blev bestemt ved hjælp af et spektrofotometer ved 620-655 nm. IC50-værdier blev beregnet med GraphPad-software.

4.2.4. Cellulær analyse for inhibering af STING-dobbeltveje

180 µL THP1-KI-hSTING-R232 cellesuspension blev fordelt i 96-brønds fladbundede plader med en tæthed på ~100,000 celler/brønd. En mængde på 10 µL 20,30 -cGAMP og 10 µL forbindelse 11 (20 µM) eller forbindelse 27 (33 µM) eller H151 (2 µM) blev tilsat, og cellerne blev inkuberet ved 37 ◦C med 5 % CO2 i 24 timer. Efterfølgende blev en mængde supernatant tilsat til en 96-brønd hvid (ugennemsigtig) plade, efterfulgt af QUANTI-Luc eller QUANTI-Blue opløsning til hver brønd, og luminescensniveauer eller SEAP-niveauer blev aflæst i henhold til producentens instruktioner. Dette muliggør den samtidige undersøgelse af IFN regulatory factor (IRF) pathwayen ved at vurdere aktiviteten af ​​Lucia luciferase og NF-KB pathwayen ved at overvåge aktiviteten af ​​SEAP.

4.2.5. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay

Cellelevedygtighed blev målt med CellTiter-Glo luminescerende cellelevedygtighed assay-kit ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev celler inkuberet med tre forskellige koncentrationer (5 µM, 10 µM, 100 µM) af forbindelse 11 forbindelse 27 eller H-151 i 48 timer. 100 µL CellTiter-Glo-reagens blev tilsat til en 96-brøndanalyseplade i 10 minutter, hvorefter luminescens blev registreret.

4.3. Molekylær docking af forbindelse 11

Krystalstrukturen af ​​STING-komplekset (PDB ID: 6MXE) blev taget fra en Protein Data Bank-indgang og brugt som udgangspunkt. Protein blev fremstillet ved hjælp af proteinpræparatet fra Maestro og opdelt i kæde A og kæde B. Vi genererede et bindingssted i LBD af STING-monomeren baseret på den originale ligand (Merck-18) ved anvendelse af Receptor Grid Generation. Vi brugte SP-præcisionen af ​​Glide-docking til den molekylære docking-del, hvilket tillod forbindelse 11 at generere højst 20 positurer. Vi producerede til sidst 16 bundne konformationer (alle i den nederste lomme) og testede kompleksernes bindingsfrie energi ved hjælp af Prime MM-GBSA-modulet i Schrödingers software. Baseret på docking-score, glidemodel-score og MMGBSA dG Bind-score valgte vi desuden den optimale konformation, der scorede først i to og rangeret som tredje i én (set i tabel S2). Til sidst slog vi de bedste konformationer af A- og B-kæderne sammen for at opnå den komplette dockingstruktur.

Referencer

1. Abe, T.; Harashima, A.; Xia, T.; Konno, H.; Konno, K.; Morales, A.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING Anerkendelse af cytoplasmatisk DNA sætter gang i cellulært forsvar. Mol. Celle 2013, 50, 5-15. [CrossRef]

2. Wu, J.; Sun, L.; Chen, X.; Du, F.; Shi, H.; Chen, C.; Chen, ZJ Cyklisk GMP-AMP er en endogen anden budbringer i medfødt immunsignalering af cytosolisk DNA. Science 2013, 339, 826-830. [CrossRef]

3. Abe, T.; Barber, GN Cytosolic-DNA-medieret, STING-afhængig proinflammatorisk geninduktion nødvendiggør kanonisk NF-KB-aktivering gennem TBK1. J. Virol. 2014, 88, 5328-5341. [CrossRef]

4. Cai, X.; Chiu, Y.-H.; Chen, ZJ cGAS-cGAMP-STING-vejen for cytosolisk DNA-sansning og signalering. Mol. Cell 2014, 54, 289-296. [CrossRef] [PubMed]

5. Gao, D.; Li, T.; Li, X.-D.; Chen, X.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, M.; Chen, ZJ Aktivering af cyklisk GMP-AMP-syntase af selv-DNA forårsager autoimmune sygdomme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]

6. Li, TJ; Cheng, H.; Yuan, H.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, P.; Tan, J.; Rui, Y.; Li, PJSR Antitumoraktivitet af cGAMP via stimulering af cGAS-cGAMP-STING-IRF3 medieret medfødt immunrespons. Sci. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]

7. Motwani, M.; Pesiridis, S.; Fitzgerald, KA DNA-sansning ved cGAS-STING-vejen i sundhed og sygdom. Nat. Rev. Genet. 2019, 20, 657-674. [CrossRef]

8. Zhang, H.; Du, QD; Xu, XL Targeting Stimulator of Interferon Geners (STING): A Medicinal Chemistry Perspective. J. Med. Chem. 2020, 63, 3785-3816. [CrossRef]

9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, M.; Du, X.; Cui, S.; Duan, H.; Kan, B.; Su, X.; Jiang, Z. Identifikation og karakterisering af phosphodiesteraser, der specifikt nedbryder 30 3 0 -cyklisk GMP-AMP. Cell Res. 2015, 25, 539-550. [CrossRef] [PubMed]

10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubensky, TW; Gajewski, TF Værts STING-vejen ved grænsefladen mellem cancer og immunitet. J. Clin. Undersøg. 2016, 126, 2404-2411. [CrossRef] [PubMed]

11. Baguley, BC; Ching, LM DMXAA: Et antivaskulært middel med flere værtsresponser. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 54, 1503-1511. [CrossRef]

12. Lara, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, K.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, I.; Losonczy, G.; Reck, M.; Heo, D.-S.; Fan, X.; et al. Randomiseret fase III placebokontrolleret forsøg med carboplatin og paclitaxel med eller uden det vaskulært forstyrrende middel Vadimezan (ASA404) ved avanceret ikke-ikke-småcellet lungekræft. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965-2971. [CrossRef]

13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, N.; Thompson, M.; Jiang, Z.; Rathinam, VAK; Munke, B.; Jin, T.; Xiao, TS; et al. Mus, men ikke menneskelig STING, binder og signalerer som reaktion på det vaskulære forstyrrende middel 5,6-dimethylxanthenon-4-eddikesyre. J. Immunol. 2013, 190, 5216-5225. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Z.; Yin, Q.; Wu, H.; Mitchison, TJ Anticancer-flavonoider er museselektive STING-agonister. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1396-1401. [CrossRef] [PubMed]

15. Cavlar, T.; Deimling, T.; Ablasser, A.; Hopfner, K.-P.; Hornung, V. Artsspecifik påvisning af den antivirale lille molekyle forbindelse CMA ved STING. EMBO J. 2013, 32, 1440-1450. [CrossRef]

16. Ramanjulu, JM; Pesiridis, GS; Yang, J.; Concha, N.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, P.; Lehmann, S.; Eberl, HC; et al. Design af amidobenzimidazol STING-receptoragonister med systemisk aktivitet. Nature 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]

17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedian, VF; Jia, Y.; Kumar, M.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, M.; Lazar, DC; et al. Antitumoraktivitet af et systemisk STING-aktiverende ikke-nukleotid cGAMP-mimetikum. Science 2020, 369, 993-999.

18. Pan, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Trotter, BW; Altman, MD; Buevich, AV; Kontanter, B.; et al. En oralt tilgængelig ikke-nukleotid STING-agonist med antitumoraktivitet. Science 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]

19. Sali, TM; Pryke, KM; Jinu, A.; Andrew, L.; Iris, A.; Rebecca, B.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmed, AS; Lisi, AJPP Karakterisering af en ny menneske-specifik STING-agonist, der fremkalder antiviral aktivitet mod nye alfavira. PloS Pathog. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]

20. Hong, Z.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Maimaiti, M.; Hu, H.; Yu, W.; Sun, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; et al. STING-hæmmere retter sig mod den cykliske dinukleotidbindingslomme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]

21. Siu, T.; Altman, MD; Baltus, GA; Childers, M.; Ellis, JM; Gunaydin, H.; Hatch, H.; Hed.; Jewell, J.; Lacey, BM; et al. Opdagelse af en ny cGAMP-kompetitiv ligand af den inaktive form af STING. ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 92-97. [CrossRef] [PubMed]

22. Haag, SM; Gulen, MF; Reymond, L.; Gibelin, A.; Abrami, L.; Decout, A.; Heymann, M.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; et al. Målretning mod STING med kovalente små molekyle inhibitorer. Nature 2018, 559, 269–273. [CrossRef]

23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, X.-H.; Sun, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Design, syntese og biologisk evaluering af acridonanaloger som nye STING-receptoragonister. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, S.; Sang, X.; Wang, Y.; Ru, H.; Shaw, N.; Jiang, Y.; Niu, F.; Zhu, Y.; Qiu, W.; Parvatiyar, K.; et al. Strukturel analyse af STING-adapterproteinet afslører en hydrofob dimergrænseflade og tilstand for cyklisk di-GMP-binding. Immunitet 2012, 36, 1073-1086. [CrossRef] [PubMed]

25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, T.; Kao, CC; Li, P. Struktur af STING bundet til cyklisk di-GMP afslører mekanismen for cyklisk dinukleotid-genkendelse af immunsystemet. Nat. Struktur. Mol. Biol. 2012, 19, 722-724. [CrossRef]

26. Huang, Y.-H.; Liu, X.-Y.; Du, X.-X.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. Det strukturelle grundlag for sansning og binding af cyklisk di-GMP ved STING. Nat. Struktur. Mol. Biol. 2012, 19, 728-730. [CrossRef]

27. Shih, AY; Damm-Gnamet, KL; Mirzadegan, T. Dynamiske strukturelle forskelle mellem menneske og mus STING fører til forskellig følsomhed over for DMXAA. Biofys. J. 2018, 114, 32-39. [CrossRef]

28. Gao, P.; Ascano, M.; Zillinger, T.; Wang, W.; Dai, P.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Shuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; et al. Struktur-funktionsanalyse af STING-aktivering ved c[G(20,50)pA(30,50)p] og målretning ved antiviral DMXAA. Cell 2013, 154, 748-762. [CrossRef] [PubMed]

29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, X.; Zhang, X.; Bai, X.; Chen, ZJN Strukturelt grundlag for STING-binding med og phosphorylering ved TBK1. Nature 2019, 567, 394–398. [CrossRef]

30. Vavˇrina, Z.; Gutten, O.; Smola, M.; Zavrel, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, M.; Boura, E.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Protein-ligand-interaktioner i STING-bindingsstedet undersøgt af rationelt designede enkeltpunktsmutationer: eksperiment og teori. Biokemi 2021, 60, 607-620. [CrossRef] [PubMed]

31. Che, X.; Du, X.-X.; Cai, X.; Zhang, J.; Xie, WJ; Long, ZR; Ye, Z.-Y.; Zhang, H.; Yang, L.; Su, X.-D.; et al. Enkelte mutationer Omform det strukturelle korrelationsnetværk i DMXAA-Human STING Complex. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 2073-2082. [CrossRef] [PubMed]

32. Diner, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, M.; Hayakawa, Y.; Hammond, MC; Vance, RE Den medfødte immune DNA-sensor cGAS producerer et ikke-kanonisk cyklisk dinukleotid, der aktiverer menneskelig STING. Cell Rep. 2013, 3, 1355-1361. [CrossRef] [PubMed]

33. Gao, P.; Zillinger, T.; Wang, W.; Ascano, M.; Dai, P.; Hartmann, G.; Tuschl, T.; Deng, L.; Barchet, W.; Patel, DJ Binding-Pocket og Låg-Region Substitutioner gør menneskelig STING følsom over for det artsspecifikke lægemiddel DMXAA. Cell Rep. 2014, 8, 1668-1676. [CrossRef] [PubMed]

34. Hwang, J.; Kang, T.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. Design, syntese og biologisk evaluering af C7-funktionaliserede DMXAA-derivater som potentielle human-STING-agonister. Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 1869-1874. [CrossRef] [PubMed]