Simuleret mikrotyngdekraft påvirker immunitetsrelaterede biomarkører i lungekræft

Abstrakt: Mikrotyngdekraft er en ny strategi, der kan tjene som et komplementært værktøj til at udvikle fremtidige cancerterapier. Ved lungekræft er indflydelsen af ​​mikrotyngdekraft på cellulære processer og cellers migrationskapacitet behandlet godt. Imidlertid forbliver dens virkning på de mekanismer, der driver lungekræftprogression, i sin vorden. I denne undersøgelse blev 13 differentielt udtrykte gener vist at være forbundet med prognosen for lungekræft under simuleret mikrogravitation (SMG). Ved hjælp af gensætberigelsesanalyse beriges disse gener i humorale immunitetsveje. I stedet blev alveolære basale-epitelceller (A549)-celler eksponeret for SMG via et 2D-klinostatsystem in vitro. Ud over morfologiændring og fald i proliferationshastighed, vendte SMG epitel-til-mesenchymal overgangen (EMT) fænotypen af ​​A549, en nøglemekanisme i cancerprogression. Dette blev bevist ved øget epitelial E-cadherin-ekspression og nedsat mesenchymal N-cadherin-ekspression, hvilket udviste en mindre metastatisk tilstand. Interessant nok observerede vi øget ekspression af FCGBP, BPIFB, F5, CST1 og CFB og deres korrelation til EMT under SMG, hvilket gør dem til potentielle tumorundertrykkende biomarkører. Tilsammen afslører disse resultater nye muligheder for at etablere nye terapeutiske strategier til behandling af lungekræft.

Nøgleord: simuleret mikrogravitation; EMT; lungekræft; metastase; tumor suppressor; biomarkør

Virkninger af Cistanche herb-antitumor

1. Introduktion

Rummet er kendt for at mangle tyngdekraftsvektoren, som påvirker kroppen på organ-, vævs- og celleniveau. Mikrotyngdekraft, en tilstand med tilsyneladende vægtløshed, er en betydelig rumstressfaktor, der vides at have en betydelig indvirkning på menneskers sundhed, såsom knogletab, muskelatrofi og hjertedekonditionering [1,2]. Virkningen af ​​mikrotyngdekraft på kræftceller har også været et voksende fokuspunkt for rum- og kræftforskning. Mikrotyngdekraft har vist sig at undertrykke immuncellernes aktivitet og forstyrre multi-body-systemer, hvilket kan øge risikoen for at udvikle kræft [2-4]. På grund af disse åbenlyse sundhedsproblemer har mikrotyngdekraftsmiljøet gjort det muligt for forskere at studere de biofysiske mekanismer påvirket af mikrotyngdekraft og hjulpet med at opdage terapeutiske midler til neurodegenerative lidelser, immunterapier og potentielt bedre og mere målrettede anti-cancerterapier [4-6]. Talrige undersøgelser har veldokumenteret og gennemgået den store implikation, som mikrogravitation har på cellulær progression, proliferation og apoptose i utallige tumorcellelinjer, herunder lungekræft [7-12]. Imidlertid har mange andre undersøgelser, der involverer mikrogravitation, vist sig at inducere ændringer i genekspression, der er involveret i cancercelleproliferation, metastaser og overlevelse, hvilket flytter cellerne mod en mindre aggressiv fænotype [13,14]. Dette kan kaste lys over nye forståelser af tumorbiologi og diagnose og fremhæver derfor mikrogravitation som et innovativt værktøj til at opdage nye mål i håbet om at udvikle nye forskningstilgange og forbedre terapeutiske strategier. Lungekræft, med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) som den mest fremtrædende type, er en førende dødsårsag, tegner sig for 12 % af alle kræfttilfælde og er den hyppigst diagnosticerede kræftsygdom [15]. I undersøgelser, der involverer mikrogravitation, som kan guide os til bedre at forstå den kræftfremkaldende proces, har lungekræftceller vist sig at miste deres stamme efter eksponering for mikrogravitation, hvilket påvirker kræftcellernes vækst og funktion [11]. En undersøgelse af Ahn et al. viste, at udsættelse af lungekræftceller (A549) for mikrotyngdekraft inducerede hurtig migration og spredning. Dette blev forklaret af de opregulerede niveauer af matrixmetalloproteaser (MMP-2 og MMP-9) under mikrogravitation, og spiller således en afgørende rolle i cancerinvasion og migration [10]. I en anden undersøgelse, Chung et al. fandt, at simuleret mikrogravitation ikke signifikant påvirkede lungekræftcelleproliferation, men snarere øgede migration sammenlignet med kontrolgruppen under normal tyngdekraft [16]. Tværtimod har Chang et al. viste en reduktion i migration i A549 lungecancercellelinjen efter 24 timers eksponering for mikrogravitationsforhold [17]. På trods af de betydelige virkninger af mikrotyngdekraft på cellulær adfærd, som omfatter apoptose, migration og invasivitet, er dens virkning på lungekræft endnu ikke fuldt ud klarlagt. Det er veletableret, at epitelceller gennemgår adskillige biokemiske ændringer for at etablere en mesenkymal fænotype, der øger apoptoseresistens, invasivitet og migrationsevne. En sådan biologisk proces er kendt som epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), et kendetegn for cancerprogression [18]. Forholdet mellem EMT og cancerprogression er blevet diskuteret godt. Tumorer er kendt for at aktivere EMT ved at opregulere transkriptionsfaktorer, udtrykke celleoverfladeproteiner og producere ECM-nedbrydende enzymer. Når først EMT er aktiveret, mister tumorcellerne deres celle-celle-adhæsion og erhverver migrerende og invasive egenskaber [19]. Kun to undersøgelser har vist, at simuleret mikrogravitation inducerer forbigående epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) i keratinocytter [9]. Derudover blev sådanne fænomener fremhævet i MCF-7-celler og HUVEC [20]; ingen undersøgelser har dog fokuseret på effekten af ​​mikrogravitation på EMT ved lungekræft. På trods af de mange afgørende opdagelser, der er gjort om mikrotyngdekraftens evne til at modulere tumorigeniske og metastatiske kræftprocesser, forbliver de nøjagtige mekanismer drevet af mikrogravitationsbyen relativt ukendte, hvilket giver åbne spørgsmål vedrørende de adaptive ændringer, der forekommer på molekylært niveau. I denne undersøgelse har vi identificeret en signatur af immunrelaterede gener (FCGBP, BPIFB1, F5, CFB og CST1), der signifikant udviste øget mRNA-ekspression i A549-celler under påvirkning af simuleret mikrogravitation (SMG). Derudover har vi evalueret bidraget af SMG i A549 cancerprogression via EMT-regulering. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB og CST1 og deres korrelation til EMT-nøglemarkører viste en potentielt mindre metastatisk fænotype af lungekræft under SMG. Resultaterne af denne undersøgelse giver et grundlag for fremtidige undersøgelser, der er nødvendige for at identificere underliggende mekanismer, som vil udvikle vores forståelse og hjælpe i udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier til behandling af lungekræft.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

2. Resultater

2.1. Top almindelige differentielt udtrykte gener identificeret i lungekræftceller under simuleret mikrotyngdekraft (SMG) sammenlignet med jordtyngdekraft (GG)

For at identificere gener involveret i lungekræft under simuleret mikrogravitation (SMG) undersøgte vi indledningsvis gener, der er differentielt udtrykt under SMG sammenlignet med jordtyngdekraft (GG) for human lungekræft ved hjælp af den offentligt tilgængelige Gene Expression Omnibus (GEO) database. To datasæt blev valgt, GSE78210 og GSE36931, som inkluderer genekspression for to forskellige humane lungecancercellelinjer, A549 og Colo699, dyrket i 2D- og 3D-cellekulturbetingelser. Forskelle i genetiske ekspressionsprofiler mellem SMG- og GG-prøver blev præsenteret i vulkanplot (figur 1). De identificerede differentielt udtrykte gener (DEG'er; figur 2) for hvert datasæt blev opdelt i dem, der er opreguleret i lungekræft (21 gener i A549 og 29 gener i Colo699 i GSE78210 datasættet og 47 gener i A549 i GSE36931 datasættet) og de der er nedreguleret I-lungecancer (40 gener i A549 og 27 gener Colo699 af GSE78210-datasættet og 87 gener i A549 af GSE36931-datasættet), som repræsenteret i tabel 1. Tretten DEG'er var signifikant højt udtrykt i A549-celler i GSE78210-datasættene i GSE73690 SMG sammenlignet med GG-tilstanden. De mest almindelige gener blev identificeret ved hjælp af InteractiVienn-webværktøjet (figur 2A). Kandidatgenerne inkluderer AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP og BPIFA1. For at fastslå, om de identificerede DEG'er er involveret i fælles veje, blev kandidatgenerne uploadet til Metascape (http://metascape.org; adgang til den 11. november 2021). Interessant nok er disse gener beriget i veje, der involverer humoral immunrespons og reguleret exocytose (figur 2B).

Figur 1. Vulkanplot, der viser differentielt udtrykte gener (DEG'er) ved brug af GEO Omnibus. (A) Vulkanplot, der viser DEG'er under SMG- og GG-effekter i A549-celler ved hjælp af (A) GSE78210 og (B) GSE36931-datasæt. (C) Vulkanplot, der viser DEG'er under SMG- og GG-effekter i Colo699-cellelinje ved hjælp af GSE78210-datasæt. Den røde farve indikerer opregulerede gener, mens den blå farve indikerer nedregulerede gener.

Tabel 1. Samlede gener, der er differentielt udtrykt ved SMG sammenlignet med GG i lungecancercellelinierne A549 og Colo699. Hvert datasæt havde foldændringer justeret for at udtrække de øverste 5% af DEG'er. For GSE36931 blev fold change (FC) justeret til kun at inkludere gener med en FC større end eller lig med 4 eller mindre end eller lig med -4. For GSE78210 blev FC justeret til kun at inkludere gener med en FC større end eller lig med 3 eller mindre end eller lig med -3.

Figur 2. Tretten almindeligt delte DEG'er mellem GSE78210 og GSE36931 datasæt i lungekræft. (A) Venn-diagram, der viser 134° i GSE36931 (A549-cellelinje), 61° i GSE78210 (A549-cellelinje) og 56° i GSE78210 (Colo699-cellelinje) under SMG-betingelser sammenlignet med GG. Ud af de i alt identificerede 251 gener blev 13 DEG fundet at være fælles mellem de to datasæt, GSE78210 og GSE36931, i A549-cellelinjen. Venn-diagram blev genereret ved hjælp af InteractiVinn.

2.2. De differentielt udtrykte gener korreleret med lungeadenokarcinompatienters kliniske prognose

De differentielt udtrykte gener korreleret med lungeadenokarcinompatienters kliniske prognose For at evaluere den kliniske prognostiske værdi af kandidatgener på patienter med lungeadenokarcinom, Kaplan-Meier plotter (http://www.kmplot.com/; tilgængelig den 11. november 2{ {44}}21) blev brugt til at sammenligne den overordnede overlevelse (OS) af lungeadenokarcinom (LUAD) patienter med høj/mellem i forhold til lav ekspression af kandidatgener (figur 3). Høje mRNA-ekspressionsniveauer af NOX1 (hazard ratio (HR), 1,45; 95 % konfidensinterval (CI), 1,11-1,9; p=0.0058), GDA (HR) , 1,74; 95 % CI, 1,33-2,26; p=3.2e-05), TCN1 (HR, 1,62; 95 % CI, 1,26-2,08; p=0.00014), og BPIFA1 (HR, 1,44; 95 % CI, 1,12-1,84; p=0.0026) blev observeret at være signifikant forbundet med dårlig prognose (figur 3A-D). På den anden side var høje mRNA-ekspressionsniveauer af FCGBP (HR, 0,63; 95% CI, 0,46-0,85; p=0.0026) forbundet med bedre prognose og højere samlet overlevelse hos LUAD-patienter (Figur 3E). Der var ingen signifikant korrelation mellem mRNA'et

Figur 3. FCGBP, CST1, F5, CFB og BPIFB1 korreleret til lungeadenokarcinompatienters kliniske prognose. Kaplan-Meier overlevelseskurver for mRNA-ekspressionsniveauer af kandidatgener: (A)NOX1; (B) GDA; (C) TCN1; (D) PLUNC; (E) FCGBP; (F) AZGP1; (G) H2Bf; (H) B7X; (I) AGR3; (J) CEACAM6; (K) F5; (L) BPIFB1; og (M) CST1 hos lungeadenokarcinompatienter. HR: fareforhold.

cistanche supplement fordele-antitumor

Klik her for at se Cistanche-produkter

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.3. Ekspression af FCGBP, BPIFB1, F5, CFB og CST1 i A549-celler post-simuleret mikrogravitet

For at validere ekspressionen af ​​de in silico identificerede gener (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP og BPIFA1) blev der udført in vitro-applikation ved hjælp af qRT-PCR. Interessant nok viste vores data ved hjælp af qRT-PCR en signifikant opregulering af FCGBP mRNA-ekspression, specifikt ved 48 og 72 timer i A549-celler, post-SMG sammenlignet med GG (figur 4A). Derudover var mRNA-ekspressionerne af CFB, F5 og BPIFB1 signifikant opreguleret 72 timer efter SMG og sammenlignet med GG i A549-celler (figur 4B, C, E). En lille stigning, selvom ikke signifikant, i mRNA-ekspression blev påvist for CTS1 under SMG-betingelser sammenlignet med GG (figur 4D). Ekspressionerne af AZGP1, AGR3, GDA, VTCN1, BPIFA1, NOX1, CEACAM5 og TCN1 var ubestemte for både SMG og GG (data ikke vist).

Figur 4. Opregulering af FCGBP, CST1, F5, CFB og BPIFB1 under SMG-betingelser in vitro. mRNA-ekspressionsniveauer af (A) FCGBP, (B) CFB, (C) F5, (D) CTS1 og (E) BPIFB1, kvantificeret ved qRT-PCR og normaliseret til GAPDH i A549-celler udsat for GG- og SMG-betingelser i 24 , 48 og 72 timer. Søjlediagrammer viser resultaterne af 3 uafhængige eksperimenter (n=3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 og **** p < 0,0001.

Samlet set antyder disse data, at de differentielt udtrykte FCGBP, F5, CFB og BPIFB1 i lungekræft kan spille en vigtig rolle i lungekræftprogression.

2.4. Simuleret mikrotyngdekraft reducerer cellelevedygtighed og reverserer epitel-til-mesenkymal overgang i A549 lungekræftcellelinje

For at undersøge, om SMG påvirker spredningspotentialet af A549-celler, blev en cellelevedygtighedsassay udført under anvendelse af et trypanblåt eksklusionsassay. Vores data afslørede, at SMG signifikant inducerede et tidsafhængigt fald i celleproliferation (figur 5B). Faldet i celleproliferation var væsentligt hovedsageligt efter 48 og 72 timer efter SMG sammenlignet med GG, som viste en stigning i celleproliferation af A549-celler. Parallelt hermed blev en ændring i cellulær morfologi påvist i A549-celler under SMG. For at vurdere disse ændringer blev celler fjernet fra SMG-tilstanden, podet på 24-brøndsplader og observeret under lysmikroskopi efter 1 times SMG-påføring. Interessant nok afslørede celler udsat for SMG en granulær, sammenklumpet morfologi post-SMG. (Figur 5A).

Figur 5. Simuleret mikrotyngdekraft reducerer cellelevedygtighed og inducerer morfologiske ændringer i A549-celler på en tidsafhængig måde. (A) Repræsentative mikrofotografier af parentale A549-celler (GG) og A549-celler udsat for SMG i 24, 48 og 72 timer før så dem tilbage i 1 time under GG. Billeder blev taget med 10X forstørrelse. (B) Cellelevedygtighed af A549-celler blev vurderet under anvendelse af trypanblåt farveeksklusionsassay. Den gennemsnitlige cellelevedygtighed af 3 uafhængige eksperimenter vises som en procentvis kontrol. **** p < 0.0001. Figur 5. Simuleret mikrotyngdekraft reducerer cellelevedygtighed og inducerer morfologiske ændringer i A549-celler på en tidsafhængig måde. (A) Repræsentative mikrofotografier af parentale A549-celler (GG) og A549-celler udsat for SMG i 24, 48 og 72 timer før så dem tilbage i 1 time under GG. Billeder blev taget med 10X forstørrelse. (B) Cellelevedygtighed af A549-celler blev vurderet under anvendelse af trypanblåt farveeksklusionsassay. Den gennemsnitlige cellelevedygtighed af 3 uafhængige eksperimenter vises som en procentvis kontrol. **** p < 0,0001.

Kinesisk urt cistanche plante-Antumor

For at forstå de opnåede data om nedsat cellulær proliferation i A549 evaluerede vi bidraget fra SMG til epitel-til-mesenchymal overgangsmekanismen (EMT). EMT er et kendetegn og en vigtig mekanisme, der driver kræftprogression og metastase, og dermed forbedrer dets cellemotilitet og invasive egenskaber [19]. Nøgle EMT-markører (E-cadherin, N-cadherin, ZO-1 og Snail) og metalloproteinaser MMP-2 og MMP-9 mRNA-ekspressionsniveauer blev målt ved qRT-PCR i A549, under både GG og SMG (figur 6). Efter SMG-applikation blev der observeret en signifikant stigning i E-cadherin-mRNA-ekspression, parallelt med et signifikant fald i N-cadherin-mRNA-ekspression, 48 og 72 timer efter SMG (figur 6A, B). En ikke-signifikant stigning i ZO-1 og MMP-9 og et fald i Snail-transskriptionsfaktor blev påvist ved SMG (figur 6C-E). MMP-2 var signifikant reduceret i A549 48 timer efter SMG (Figur 6F), hvilket indikerer en mindre invasiv form. Samlet understøtter disse data en mesenkymal-epitelial overgang (MET) fænotype induceret af SMG i A549.

Figur 6

2.5. Epitel-til-mesenkymal overgangsvej korrelerer med udtrykket af FCGBP, BPIFB1, F5, CFB og CST1

For at få yderligere mekanistisk indsigt i den potentielle rolle af de identificerede gener i A549 og deres mulige korrelation til EMT under SMG-betingelser, blev en gen-interaktionsanalyse udført med GeneMANIA mod EMT-genmarkører. Figur 7 viser geninteraktionerne plottet mellem henholdsvis EMT-generne E-cadherin (CDH1), N-cadherin (CDH2), TJP1, CTNNB1, SNAI1 (Snail), ZO-1 og -catenin. Metalloproteinaserne MMP-2 og MMP-9 var også inkluderet i analysen, da de kendte deres væsentlige roller i cancerinvasion og migration. Noderne identificerer co-ekspressionsmønstre mellem generne af varierende styrke baseret på tykkelsen af ​​noden. Kandidatgenerne viser en grad af co-ekspression mellem hinanden; BPIFB1 er co-udtrykt med CFB og CST1; FCGBP er co-udtrykt med F5, CST1 og CFB; CST1 er co-udtrykt med CFB, og F5 er co-udtrykt med CFB, CST1 og BPIFB1. Co-ekspressionsknuder blev også identificeret mellem EMT-gener og kandidatgenerne; CDH1 er co-udtrykt med FCGBP og F5; CDH2 er co-udtrykt med F5, CST1, BPIFB1 og FCGBP; CTNNB1 er co-udtrykt med CST1 og FCGBP; SNAI1 er co-udtrykt med CST1, F5 og BPIFB1; TPJ1 er co-udtrykt med CST1, FCGBP og F5; CTNNB1 er co-udtrykt med CST1 og FCGBP; MMP2 er co-udtrykt med BPIFB1 og CST1; og MMP9 er co-udtrykt med F5, CST1, FCGBP og CFB. Disse resultater tyder på en signifikant korrelation mellem de nye identificerede gener og EMT-markører under SMG-betingelser, muligvis relateret til EMT-veje.

Figur 7. FCGBP, CST1, F5, CFB og BPIFB1 korrelerer med EMT-vejen. Gen-gen interaktionsnetværk af udvalgte kandidatgener; FCGBP, CST1, F5, CFB og BPIFB1 med EMT-gener; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 og SNAI1 samt cellemigrationsrelaterede gener MMP2 og MMP9 genereret af GeneMANIA (http://genemania.org/; adgang til den 11. november 2021) for at identificere interaktioner mellem kandidatgenerne med EMT og cellemigrationsmarkører. De forskellige farver på netværkskanten indikerer de anvendte bioinformatikmetoder: website-forudsigelse (orange), fysiske interaktioner (rød), co-ekspression (lilla), delte proteindomæner (brun), pathway (lyseblå), co-lokalisering (mørk). blå) og genetiske interaktioner (grøn)

3. Diskussion

Cistanche te

Diskussion Lungekræft, en af ​​de betydelige og verdensomspændende truende sygdomme, har for nylig vundet meget opmærksomhed i "Rumforskningen". På trods af fremskridt på dette område forbliver lungekræftprogression og dens reaktion på behandling kontroversielle på grund af manglen på definitive vurderingsstrategier, der hjælper med at forebygge eller behandle kræft [21]. Så vidt vi ved, er dette den første rapport, der identificerer et sæt gener som en signatur for lungekræftprogression under et mekanisk miljø induceret af simuleret mikrotyngdekraft (SMG). Vi fremhæver den øgede ekspression af immunrespons-relaterede gener FCGBP, BPIFB, F5, CST1 og CFB og deres korrelation til epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) under SMG, hvilket gør dem til potentielle biomarkører for lungekræftprogression. Heri fremhæver vi også effekten af ​​induceret SMG på EMT-regulering, et kendetegn for cancerprogression [18,22], til at understøtte en mesenkymal-til-epitelial overgang (MET) fænotype. Samlet set giver denne undersøgelse grundlaget for associeringen af ​​de identificerede gener med EMT; der er imidlertid behov for yderligere undersøgelser for at afdække de nøjagtige mekanismer, der hjælper med at udvikle ny målrettet terapi for lungekræft. I denne undersøgelse viste vi tretten gener (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP og BPIFA1) for at blive signifikant udtrykt i lungekræft under simuleret mikrogravitation (SMG) som sammenlignet med jordens tyngdekraft i silico. Vores data viste, at disse differentielt udtrykte gener er beriget i veje relateret hovedsageligt til humoral immunitet og reguleret exocytose. Interesse parallelt med vores resultater, selvom hovedfunktionen af ​​FCGBP stadig er uklar [23]. Dette kan til dels skyldes de modstridende roller, det udviser i forskellige tumorer [25]. For eksempel er det vist, at FCGBP er signifikant forbundet med en bedre overordnet prognose og sygdomsspecifik overlevelse hos patienter med hoved-halskræft, tyktarmskræft og osteosarkom [25-27], mens det i ovarie- og prostatacancer er det høje udtryk for FCGBP var forbundet med dårligere samlet overlevelse [28]. Det skal bemærkes, at rollen som FCGBP-rolle er blevet tilskrevet immunforsvarsmekanismer, antiinflammatoriske responser samt cellebeskyttelse [29,30], hvilket gør det til en væsentlig prognostisk markør [31]. Ved hjælp af in vitro-applikationer har vi evalueret ekspressionen af ​​de identificerede gener i lungekræft og under SMG-betingelser via en 2D-klinostat. Der er et bredt udvalg af klinostattyper og andre mikrogravitationsplatforme, der er blevet udviklet. Disse omfatter 1/2/3 D klinostatsystemer, tilfældige positioneringsmaskiner udstyret med skydeflasker (hovedsageligt til skjoldbruskkirtelkræftceller) og NASA-udviklede roterende vægkar. Hver er designet til at tjene et bestemt forskningsmål, hvor nogle er designet til at dyrke adhærente eller suspensionsceller, og andre bruges til online måling af kinetiske responser. Bemærk, at klinostaten er en af ​​de enkleste og mest tilpasningsdygtige platforme, der bruges af forskellige eksperimentelle applikationer. I princippet er 2D-klinostaten kendetegnet ved en rotationsakse, der roterer kontinuerligt med en justeret konstant hastighed og i en retning, der er vinkelret på retningen af ​​Jordens tyngdekraftsvektor, hvilket skaber centrifugalkræfter, der efterligner virkelig mikrotyngdekraft [14,32,33 ]. Interessant nok steg FCGBP-, BPIFB-, F5-, CST1- og CFB-ekspressionerne af de tretten gener signifikant som respons på 2D-klinostat-induceret SMG i A549-celler. Ekspressionerne af FCGBP og BPIFB var de mest påvirkede og viste en signifikant stigning på alle vurderede tidspunkter: 24, 48 og 72 timer efter SMG. I lighed med FCGBP er BPIFB1 kendt for at bidrage til medfødte immunitetsresponser [34]. BPI-folden indeholdende familie B medlem 1-protein (BPIFB1), som primært produceres af luftvejsepitel, har vist sig at deltage i værtsforsvarsmekanismer sammen med bakteriedræbende og antiinflammatoriske virkninger [35]. I luftvejssygdomme er BPIFB1 vist at udvise anti-tumor og anti-metastatiske virkninger; dog forbliver de nøjagtige mekanismer uklare, hvilket berettiger yderligere undersøgelse [34,36]. En undersøgelse af Wei et al. fandt, at BPIFB1 hæmmer migration og invasion af nasopharyngeal carcinom [37]. I betragtning af det blev det fundet, at mutationer, der forekommer i BPIFB1, fremmer risikoen for lungekræft, og dens nedregulering fører til dårlig prognose hos lungekræftpatienter [38,39]. Ud over rollen som FCGBP og BPIFB er komplementfaktor B (CFB) og den kimære tumorsuppressor 1 (CST1) vist at udøve beskyttende roller i cancer. For eksempel blev det rapporteret, at høj ekspression af CFB var forbundet med øget patientens samlede og sygdomsfri overlevelse hos lungekræftpatienter [40]. Ydermere tjener komplementsystemet som den første forsvarslinje mod patogener, der tjener som en vigtig komponent i både det medfødte og erhvervede immunsystem [41]. Med hensyn til CST1 fremhævede forskellige undersøgelser dets interessante egenskaber, såsom dets evne til at undertrykke cellevækst, inducere apoptose og dets modstandsdygtighed over for inaktivering af onkogene former af p53, hvilket gør det til et attraktivt, men alternativt terapeutisk mål for vildtype p{ {74}}resistente humane tumorer [42]. Ud over den øgede ekspression af FCGBP, BPIFB1, F5, CFB og CST1 viste vores data interessant to cellulære-relaterede fænotyper af A549-celler under SMG - en morfologiændring til aggregater og klumpformede celler og et signifikant fald i proliferationen sats efter SMG. Dette er parallelt med nogle andre undersøgelser, hvor celler, der blev udsat for SMG, udviste små klumper eller flerlags celleaggregater [43,44]. Disse morfologiske forskelle afspejles af de samtidige dramatiske funktionelle ændringer i cellulære processer, hvoraf en del er EMT. EMT er et kendetegn for den metastatiske proces, der er forbundet med undslippet af immunovervågningen og invasionen af ​​vaskulaturen, hvilket tillader cellerne at sprede sig til sekundære organer [19,22]. I princippet gennemgår ondartede epitelceller en EMT-mekanisme i de primære stadier af tumorudviklingen, hvor disse celler har en tendens til at udtrykke mesenkymale egenskaber, der udviser øget motilitet, der letter deres flugt fra den primære niche, hvorimod de metastatiske celler dannet ved den sekundære side viser sig. mindre dedifferentierede egenskaber sammenlignet med deres tilsvarende primære tumorer. Heri er en MET-proces (mesenchymal-til-epitel) en del af en sådan progression af metastatisk tumordannelse. Det forsømmer dog ikke deltagelse af EMT'er på forskellige stadier af cancerprogressionen, fordi cancerceller på sekundære steder enten vil fortsætte med at vokse og proliferere eller undergå dvale [45,46]. Sådan multipel genkoordination og fremkomsten af ​​specifikke migrerende markører, der regulerer den metastatiske progression af cancerceller, kan resultere i forskellige resultater ved SMG-eksponering [47]. For eksempel under mikrogravitationsforhold udviste forskellige brystkræftceller forskellige morfologier, celleadhæsion og migrerende egenskaber ved eksponering for mikrogravitation [5]. Det skal bemærkes, at hovedkarakteristikken ved EMT er tabet af celleadhæsionsmolekylet, E-cadherin, hvilket således påvirker hvilen i cellernes integritet. På den anden side fører stigningen i neuralt cadherin, N-cadherin, til celleadhæsionsændringer. Dette induceres hovedsageligt af transformerende vækstfaktor (TGF-), som aktiverer pleiotropisk udtrykte transkriptionsfaktorer, såsom Snail-, Twist- og Zeb-proteiner og andre signalveje implementeret i metastatiske veje [18,48,49]. Heri rapporterer vi forbedringen af ​​epitelmarkøren E-cadherin (CDH1) og nedreguleringen af ​​de mesenkymale N-cadherin (CDH2) mRNA-niveauer, nøglemarkører for EMT [49]. Dette indebærer, at i kombination med vores data om den reducerede proliferationshastighed af A549, udviser cellerne en mindre metastatisk tilstand. Interessant nok blev den ændrede ekspression af nøgle-EMT-markører også ledsaget af en signifikant nedregulering af matrixmetalloproteinase MMP-2, som er en hovedkomponent af basalmembranen, der normalt adskiller epitellaget fra det omgivende mesenchym, hvilket fører til tabet af basalmembranen [50]. Dette er parallelt med en undersøgelse foretaget af Chang et al., hvor de rapporterede deres resultater om at reducere det metastatiske potentiale af humane lungeadenokarcinomceller gennem ændringen af ​​MMP2-ekspression [17]. Generelt har MMP's rolle været godt impliceret i malignitetsprogression, herunder metastase, hvor en reduceret MMP (MMP-2 og MMP-9) ekspression og enzymatisk aktivitet er karakteristisk for en mindre metastatisk fænotype [ 50-52]. Med den betydelige rolle af EMT i metastase fremhæver vores data en signifikant korrelation af FCGBP, BPIFB, F5, CST1 og CFB med EMT-genmarkører såvel som cellemigrationsrelaterede gener MMP2 og MMP9. Interessant nok, Xiong et al. har vist, at FCGBP er en hovedregulator af EMT i galdeblæren [53]. Dette betyder, at de identificerede gener kan tjene som potentielle biomarkører for fremtidige undersøgelser, der kan forudsige og yderligere forstå udviklingen af ​​lungekræft. Samlet klassificerer vores resultater de identificerede gener som nøgleregulatorer af EMT, hvilket fremmer en potentiel forbedring af en mindre metastatisk fænotype via en mesenkymal-til-epitelial overgang (MET) af lungekræftceller.

4. Materialer og metoder

4.1. Datasæt til identifikation af almindelige differentielt udtrykte gener (DEG'er) i lungekræftcellelinjer udsat for simuleret mikrotyngdekraft

Relevante datasæt fra den offentligt tilgængelige Gene Expression Omnibus (GEO) database blev udtrukket til indledende analyse. Denne database bruges som en offentligt tilgængelig funktionel genomisk analyse af genekspressionsdata og mikroarrays med høj kapacitet. De udvalgte datasæt opfyldte følgende kriterier: datasæt, der udelukkende brugte humane lungecancercellelinjer, undersøgelser, der inkluderer matchende kontroller i jordens tyngdekraft (GG), datasæt med defineret klassificering af lungecancercellelinjer og datasæt med humane lungecancercelle-genekspression ved hjælp af microarray. To datasæt passer til dette kriterium, GSE78210 og GSE36931. I alt blev 25 prøver inkluderet i undersøgelserne, og 14 lungekræftcellelinjeprøver i simuleret mikrogravitation (SMG) blev sammenlignet med 11 GG-kontroller, som vist i tabel 2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) /geo/; tilgået den 11. november 2021).

Tabel 2. Detaljer om datasæt ekstraheret fra Gene Expression Omnibus (GEO) brugt til indledende identifikation af DEG mellem simuleret mikrogravitation (SMG) og Ground Gravity (GG) lungekræftceller.

4.2. GEO2R-gensætberigelsesanalyse for at generere DEG'er i hver datase

GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r; tilgået den 11. november 2021), et interaktivt onlineværktøj, der bruges til at sammenligne GEO-serier, blev brugt i hvert datasæt til gruppering og identificere opregulerede og nedregulerede gener i SMG-betingelser sammenlignet med GG-betingelser. Generne med p-værdier mindre end 0,05 og foldændringer større end 2 blev udvalgt som differentielt udtrykte gener DEG'er under SMG-betingelser. Følgelig krydsede DEG'erne for hvert datasæt hinanden, og fælles gener blev identificeret

4.3. Kvantificering af klinisk patologisk involvering af de identificerede gener

Dernæst blev de resulterende kortlistede gener valideret ved hjælp af Kaplan-Meier Plotter (http://www.kmplot.com/; adgang til den 11. november 2021), en online offentlig database, der evaluerer effekten af ​​udvalgte gener på patientens kliniske resultater. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som varigheden fra diagnosetidspunktet (i måneder) til døden. Genekspressionsdata og overlevelsesinformation stammer fra Gene Expression Omnibus (GEO), The Cancer Genome Atlas (TCGA) og European Genome-phenome Atlas (EGA). Patienterne blev kategoriseret i to grupper: (1) høj ekspression (med TPM-værdier over den øvre kvartil) og (2) lav/medium ekspression (med TPM-værdier under den øvre kvartil). Kaplan-Meier-plot blev brugt til at sammenligne OS af lungeadenokarcinom (LUAD)-patienter med høj/intermediær versus lav ekspression af kandidatgener.

4.4. Beriget ontologiklynger for de identificerede gener

For at undersøge, om de identificerede gener deler fælles veje, blev Gene Ontology (GO) pathway-berigelsesanalyse for de identificerede gener udført ved hjælp af Metascape-webværktøjet (https://metascape.org/; adgang til den 11. november 2021) til omfattende genlisteannotering og analyseressource sammen med GEO2R

4.5. Cellelinje og cellekultur

Den humane adenokarcinom alveolære basale epitelcelle (A549) cellelinje, der er meget brugt som model for lungeadenokarcinom, blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)-1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Sigma, St. Louis, MO, USA) og 100 enheder/ml penicillin/streptomycin (P/S; Sigma, St. Louis, MO, USA). Cellelinjen blev dyrket i en 37 ◦C befugtet inkubator i en atmosfære på 5 % CO2. Når cellerne nåede sammenløb, blev de høstet under anvendelse af 0,5% trypsin, centrifugeret ved 100 x g i 5 minutter og brugt efter behov.

4.6. Mikrotyngdekraft

Lungekræftceller (A549) blev dyrket i et 2D-klinostatsystem, der efterlignede tyngdekraftsmiljøet næsten nul (mikrogravitation). Denne Rotary Culture Max (RCMW™; Synthecon® Inc—Houston, TX, USA) er en bioreaktor udstyret med en cellekulturbeholder, der inkorporerer en mikroporøs perfusionskerne og et in-line oxygenatorsystem, som giver næringsstof og ekstern gasning af mediet, dermed sikre korrekt gasudveksling og et cellekulturmiljø med lav forskydning. Kammeret blev pakket med dyrkningsmediet indeholdende cellerne. Dette kammer roterede vandret omkring en akse vinkelret på tyngdekraften med en hastighed på 10 rpm. 2D-klinostaten blev placeret inde i den 37 ◦C befugtede inkubator i en atmosfære på 5 % CO2. A549-celler blev høstet post-simuleret mikrogravitet (SMG) ved 24, 48 og 72 timer. For at skabe et sammenligneligt lungekræftmiljø blev A549-celler dyrket i kulturplader ved GG, i en ikke-roteret eller statisk tilstand, og blev holdt i nærheden af ​​enheden inde i den befugtede inkubator (37 ◦C). Disse celler omtales som kontrolgruppen og blev også høstet efter 24, 48 og 72 timer.

4.7. Cellelevedygtighedsanalyse

For GG-betingelserne blev A549-celler podet i 24-brøndcellekulturplader ved en tæthed på 3.0 × 104 celler pr. 500 µL. Celler blev høstet ved trypsinisering 24, 48 og 72 timer efter podning og derefter centrifugeret ved 200 x g i 5 minutter. Opnåede cellepelleter blev rekonstitueret i dyrkningsmedier. Til SMG-betingelserne blev A549-celler podet i 2D-klinostat-rotationssystemet ved en tæthed på 6,0 × 104 celler pr. 1 ml. Celler blev høstet ved 24, 48 og 72 timer efter SMG-eksponering og derefter centrifugeret ved 200 x g i 5 minutter. Opnåede cellepelleter blev rekonstitueret i dyrkningsmedier. Trypanblåt (Sigma, USA) farveeksklusionsassay blev udført. Celletallet blev bestemt ved hjælp af CellDrop™ Automated Cell Counter.

4.8. Kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion (qRT-PCR)

Genekspressionsniveauer (mRNA-niveauer) af de in silico identificerede gener (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP og BPIFA1) sammen med EMT-genmarkører (tabel 3) blev også bestemt i A549-celler ved qRT-PCR. Kort fortalt blev ekstraktion af totalt RNA fra celler udført under anvendelse af RNEasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) ved 24, 48 og 72 timer ved GG og efter eksponering for SMG ved at følge producentens protokoller. Ét µg totalt RNA blev omvendt transskriberet til et enkeltstrenget komplementært DNA (cDNA) i et 20 µL reaktionsvolumen under anvendelse af et iScript™ cDNA-syntesekit (Thermo, Waltham, MA, USA). qRT-PCR blev udført ved hjælp af PowerUp™ Sybr™ Green mastermix (Thermo, USA) i en Quant Studio 5 pcr-maskine (Thermo, USA). PCR-amplifikationstrin var som følger: et indledende denatureringstrin ved 95 ◦C i 3 minutter, en annealingstemperatur for målgenet i 30 s og derefter 72 ◦C i 30 s. Fluorescenstærskelcyklusværdien blev opnået for hvert gen. ∆∆Cq-metoden blev brugt til at beregne den relative foldændring i genekspression efter normalisering til husholdningsgenet, Glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH).

Tabel 3. Liste over humane primere. NOX1, NADPH Oxidase 1; GDA, guanin-deaminase; TCN1, Transcobalamin 1; FCGBP, Fc Gamma Binding Protein; BPIFA1, BPI Fold indeholdende Familie A Medlem 1; AZGP1, Alpha-2-Glycoprotein 1; CFB, komplementfaktor B; VTCN1, V-Set-domæne indeholdende T-celleaktiveringsinhibitor 1; AGR3, anterior gradient 3; CTS1, kimær tumorsuppressor 1; F5, koagulationsfaktor V; CEACAM6, CEA celleadhæsionsmolekyle 6; BPIFB1, BPI-fold indeholdende familie B-medlem 1; ZO-1, Zonula occludens protein 1; MMP-9, Matrix metalloproteinase 9; MMP-2, Matrix metalloproteinase 2; og GAPDH, Glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase

4.9. Gen-gen interaktionsanalyse

Data fra in vitro qRT-PCR blev implementeret i gen-gen interaktionsanalyse ved hjælp af in silico webværktøj GeneMANIA (http://genemania.org/; adgang til den 11. november 2021), en netværksalgoritme til at forudsige genfunktioner ved hjælp af et stort sæt af funktionelle foreningsdata. Dette blev udført for yderligere at evaluere interaktioner mellem/blandt de udvalgte kandidatgener; FCGBP, CST1, F5, CFB og BPIFB1 med EMT-gener; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 og SNAI1, samt cellemigrationsrelaterede gener, MMP2 og MMP9.

4.10. Statistisk analyse

GraphPad Prism-software blev brugt til at udføre statistisk analyse. Resultaterne er udtrykt som individuelle data eller som middel ± standardafvigelse (SD). Elevens t-test blev brugt til at sammenligne forskellige grupper. Forskelle mellem grupper blev vurderet ved en-vejs ANOVA of varians (ANOVA). p-værdier blev bestemt, og værdier af p < 0.05, p < 0.01, p < 0,001 (henholdsvis *, ** og ***) blev betragtes som væsentlig. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer (n=3).

Referencer

1. Hvid, RJ; Averner, MJN Mennesker i rummet. Nature 2001, 409, 1115–6828. [CrossRef]

2. Bradbury, P.; Wu, H.; Choi, JU; Rowan, AE; Zhang, H.; Poole, K.; Lauko, J.; Chou, J. Modellering af virkningen af ​​mikrogravitation på cellulært niveau: Implikationer for menneskelig sygdom. Foran. Cell Dev. Biol. 2020, 8, 96. [CrossRef] [PubMed]

3. Yuan, M.; Liu, H.; Zhou, S.; Zhou, X.; Huang, Y.-E.; Hou, F.; Jiang, W. Integrativ analyse af regulatorisk modul afslører associationer af mikrogravitation med dysfunktioner af multi-body-systemer og tumorigenese. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7585. [CrossRef] [PubMed]

4. Crucian, BE; Chouker, A.; Simpson, RJ; Mehta, S.; Marshall, G.; Smith, SM; Zwart, SR; Heer, M.; Ponomarev, S.; Whitmire, A.; et al. Dysregulering af immunsystemet under rumflyvning: Potentielle modforanstaltninger til dybe rumudforskningsmissioner. Foran. Immunol. 2018, 9, 1437. [CrossRef] [PubMed]

5. Nassef, MZ; Melnik, D.; Kopp, S.; Sahana, J.; Infanger, M.; Lützenberg, R.; Relja, B.; Wehland, M.; Grimm, D.; Krüger, M. Brystkræftceller i mikrogravitation: Nye aspekter for kræftforskning. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7345. [CrossRef]

6. Takamatsu, Y.; Koike, W.; Takenouchi, T.; Sugama, S.; Wei, J.; Waragai, M.; Sekiyama, K.; Hashimoto, M. Beskyttelse mod neurodegenerativ sygdom på Jorden og i rummet. NPJ Microgravity 2016, 2, 16013. [CrossRef]

7. Nassef, MZ; Kopp, S.; Wehland, M.; Melnik, D.; Sahana, J.; Krüger, M.; Corydon, TJ; Oltmann, H.; Schmitz, B.; Schütte, A. Virkelig mikrotyngdekraft påvirker cytoskelettet og fokale adhæsioner i humane brystkræftceller. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3156. [CrossRef]

8. Dietz, C.; Infanger, M.; Romswinkel, A.; Strube, F.; Kraus, A. Apoptose-induktion og ændring af celleadhærens i humane lungecancerceller under simuleret mikrogravitation. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3601. [CrossRef]

9. Ricci, G.; Cucina, A.; Proietti, S.; Dinicola, S.; Ferranti, F.; Cammarota, M.; Filippini, A.; Bizzarri, M.; Catizone, A. Microgravity inducerer forbigående EMT i humane keratinocytter ved tidlig nedregulering af E-cadherin og celleadhæsionsremodellering. J. Appl. Sci. 2020, 11, 110. [CrossRef]

10. Ahn, CB; Lee, J.-H.; Han, DG; Kang, H.-W.; Lee, S.-H.; Lee, J.-I.; Søn, KH; Lee, JW Simuleret mikrotyngdekraft med flydende miljø fremmer migration af ikke-småcellet lungecancer. Sci. Rep. 2019, 9, 14553. [CrossRef] [PubMed]

11. Pisanu, ME; Noto, A.; De Vitis, C.; Masiello, MG; Coluccia, P.; Proietti, S.; Giovagnoli, MR; Ricci, A.; Giarnieri, E.; Cucina, A. Lungekræftstamceller mister deres standardtilstand efter udsættelse for mikrogravitation. BioMed Res. Int. 2014, 2014, 470253. [CrossRef] [PubMed]

12. Infanger, M.; Kossmehl, P.; Shakibaei, M.; Bauer, J.; Kossmehl-Zorn, S.; Cogoli, A.; Curcio, F.; Oksche, A.; Wehland, M.; Kreutz, RJC; et al. Simuleret vægtløshed ændrer cytoskelettet og ekstracellulære matrixproteiner i papillære thyreoideacarcinomceller. Cell Tissue Res. 2006, 324, 267-277. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, J.; Mikrotyngdekraft, L. Tumorceller i mikrotyngdekraft. In Into Space: A Journey of How Humans Adapt and Live in Microgravity; IntechOpen: London, Storbritannien, 2018; Bind 139, s. 259–268.

14. Grimm, D.; Schulz, H.; Krüger, M.; Cortés-Sánchez, JL; Egli, M.; Kraus, A.; Sahana, J.; Corydon, TJ; Hemmersbach, R.; Wise, PM Kampen mod kræft ved mikrogravitation: Den flercellede sfæroid som en metastasemodel. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 3073. [CrossRef]

15. Schabath, MB; Cote, ML Kræftfremskridt og prioriteter: Lungekræft. Kræftepidemiol. Biomark. Prev. 2019, 28, 1563-1579. [CrossRef] [PubMed]

16. Chung, JH; Ahn, CB; Søn, KH; Yi, E.; Søn, HS; Kim, H.-S.; Lee, SH Simulerede mikrogravitationseffekter på ikke-småcellet lungecancercelleproliferation og migration. Aerosp. Med. Hum. Udføre. 2017, 88, 82-89. [CrossRef]

17. Chang, D.; Xu, H.; Guo, Y.; Jiang, X.; Liu, Y.; Li, K.; Pan, C.; Yuan, M.; Wang, J.; Li, T.; et al. Simuleret mikrotyngdekraft ændrer det metastatiske potentiale af en human lungeadenokarcinomcellelinje. Vitr. Celle. Dev. Biol. Anim. 2013, 49, 170-177. [CrossRef]

18. Hanahan, D.; Weinberg, R. Kræftens kendetegn: Den næste generation. Cell 2011, 144, 646-674. [CrossRef]

19. Ribatti, D.; Tamma, R.; Annese, T. Epitel-mesenchymal overgang i cancer: Et historisk overblik. Overs. Oncol. 2020, 13, 100773. [CrossRef]

20. Shi, S.; Li, Q.; Cao, Q.; Diao, Y.; Zhang, Y.; Yue, L.; Wei, L. EMT-transkriptionsfaktorer er involveret i den ændrede celleadhæsion under simuleret mikrogravitationseffekt eller overbelastning ved regulering af E-cadherin. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1349. [CrossRef]

21. Topal, U.; Zamur, C. Mikrotyngdekraft, stamceller og cancer: Et nyt håb for kræftbehandling. Stamceller Int. 2021, 2021, 5566872. [CrossRef]

22. Ksiazkiewicz, M.; Markiewicz, A.; Zaczek, AJ Epitel-mesenchymal overgang: Et kendetegn i metastasedannelse, der forbinder cirkulerende tumorceller og cancerstamceller. Patobiologi 2012, 79, 195-208. [CrossRef] [PubMed]

23. Yan, T.; Tian, ​​D.; Chen, J.; Tan, Y.; Cheng, Y.; Ja, L.; Deng, G.; Liu, B.; Yuan, F.; Zhang, S. FCGBP er en prognostisk biomarkør og associeret med immuninfiltration i gliom. Foran. Oncol. 2021, 11, 769033. [CrossRef] [PubMed]