Kosmeceutisk potentiale af ekstrakter afledt af restprodukter fra fiskeriindustrien: Sardinaffald og torskerammer Del 1

Abstrakt: Fiskeriindustrien genererer store mængder affald (20-75 procent (w/w) af den samlede fangede fiskevægt). Genvinding af bioaktive forbindelser fra rester og deres inkorporering i kosmetik repræsenterer en lovende markedsmulighed og kan bidrage til en bæredygtig valorisering af sektoren. I dette arbejde blev proteinrige ekstrakter opnået ved højtryksteknologier (superkritisk CO2 og subkritisk vand) fra sardin (Sardina pilchardus) affald og torskefisk (Gadus morhua) rammer karakteriseret med hensyn til deres kosmetiske potentiale. Antioxidant-, anti-inflammatoriske og antibakterielle aktiviteter blev evalueret gennem kemiske (ORAC-assay), enzymatiske (hæmning af elastase og tyrosinase), antimikrobiel modtagelighed (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus og Cutibacterium acnes) og celle-baserede (i keratinocytter-Ha-assays) . Sardinekstrakter udviste den højeste antibakterielle aktivitet, og sektionen opnået ved brug af højere ekstraktionstemperaturer (250 ◦C) og uden affedtningstrinnet viste de laveste værdier for minimum inhiberende koncentration (MIC) (1,17; 4,6; {{24} },59 mg/ml for henholdsvis K. pneumoniae, S. aureus og C. acnes). Torskeprøver ekstraheret ved lavere temperaturer (90 ◦C) var de mest effektive antiinflammatoriske midler (en koncentration på 0,75 mg/mL reducerede IL-8- og IL-6-niveauer med henholdsvis 58 procent og 47 procent . i forhold til den positive kontrol). Threonin, valin, leucin, arginin og totalt proteinindhold i ekstrakterne blev fremhævet for at korrelere højt med de rapporterede bioaktiviteter (R2 større end eller lig med 0,7). Disse resultater understøtter den potentielle anvendelse af ekstrakter fra fiskeindustriens affald i kosmetiske produkter med bioaktive aktiviteter.

Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af ​​SOD i hjerte- og levervæv og signifikant reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv, hvilket effektivt fjerner forskellige reaktive iltradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytter mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en stærk opfangningsevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af ​​SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på sædmembranens funktion. Cistanche polysaccharider kan øge aktiviteten af ​​SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af ​​SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescent mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacosid i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH frie radikaler og har evnen til at opfange reaktive oxygenarter og forhindre frie radikaler-induceret kollagen nedbrydning, og har også en god reparationseffekt på anionskader af thymin frie radikaler.

Klik på Cistanche Tubulosa Supplement

【For mere info:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Nøgleord: Valorisering af fiskeaffaldsstrømme; antioxidant aktivitet; anti-inflammatorisk aktivitet; antimikrobiel aktivitet; anti-ældning; anti-hyperpigmentering; kosmetik

1. Introduktion

Med den konstante søgen efter innovation, især efter aktive ingredienser, vokser den kosmetiske industri og har demonstreret hensigten om at erstatte råolie-afledte komponenter i retning af naturlige forbindelser [1]. Antioxidantegenskaberne af naturlige aktive ingredienser kan hjælpe med at forebygge adskillige hudproblemer forårsaget af oxidativ stress og aldring [2,3]. Hudens aldring kan induceres af både iboende (såsom inflammation eller telomerforkortelse) og ydre (miljømæssige) faktorer [4]. Hudens ældning fører til tab af modent kollagen og ændringer i den ekstracellulære matrix (ECM), som kompromitterer barrierefunktionen, hvilket resulterer i et tørt udseende og modtagelighed for eksterne aggressorer, hvilket øger risikoen for hudlidelser [5]. Denne proces kan accelereres af flere enzymer, såsom elastaser, matrix metalloproteinaser (MMP'er) og hyaluronidaser, der kan inducere ECM-nedbrydning [6], eller endda ved akkumulering af cessive reactive oxygen species (ROS), der kan kompromittere den normale cellefunktion [7]. Miljøfaktorer, såsom eksponering for UV-stråling, fører til generering af store mængder ROS, der inducerer de samme molekylære og cellulære responser som iboende aldring, men med forstærkede effekter. Det er vigtigt, at ROS kan intensivere aktiviteten af ​​enzymer relateret til hudens aldring eller hudpigmenteringsprocesser [8,9], og derfor spiller tilstedeværelsen af ​​antioxidanter n en vigtig rolle på det kosmetiske område.

I 2018 blev verdens fiskeforbrug anslået af FAO til at ligge på 20,5 kg pr. pita [10], hvilket fører til store mængder biprodukter, for det meste skind og knogler. De genererede rester svarer til 20-75 procent (vægt/vægt) af den samlede fangede fiskevægt, hvilket potentielt kan føre til miljøproblemer [11,12]. Disse rester indeholder dog stadig en betydelig mængde lipider, proteiner og mineraler og bør være tilstrækkeligt valoriseret. I de senere år har ekstrakter fra affald genereret af fiskeindustrien vist aktive egenskaber såsom antihypertensive, antioxidative, antimikrobielle, neurobeskyttende, antihyperglykæmiske, anti-aging og anti-inflammatoriske [13-19]. Atlantisk torsk (Gadus rhea) og sardin (Sardina pilchardus) er blandt de mest forbrugte fisk i Portugal, og områder afledt af dens rester har vist et lovende ernæringspotentiale, såsom antioxidant, antiproliferative eller antiinflammatoriske aktiviteter [11,20-22]. Men da ploiteringen og valoriseringen af ​​fiskeindustriens affald stadig er i et tidligt stadium, er der masser af plads til at udforske mulighederne for industrien for at omdanne dette affald til markedsbioprodukter af høj værdi, herunder kosmetiske ingredienser.

I tidligere arbejde undersøgte vi brugen af ​​højtryksteknologier (superkritisk CO2 og subkritisk vand) til at isolere bioaktive fraktioner fra sardinaffald og torskerammer med lovende sundhedsmæssige fordele [11,22]. For sardinaffald viste vi, at ved at anvende et første trin med superkritisk kulstof (ScCO2) (for at fjerne lipidfraktion) efterfulgt af en ekstraktionsproces med subkritisk vand (SW) var det muligt at opnå proteinhydrolysater med højt antioxidantpotentiale og antiproliferativ effekt i kolorektale cancerceller [22]. Subkritisk vandekstraktion/hydrolyse anvendte vi også for at opnå protein-, peptid- og aminosyreberigede ekstrakter fra torskefisk, og vi viste, at lavere forarbejdningstemperaturer (90 ◦C) favoriserer ekstraktion af forbindelser med anti-inflammatorisk potentiale i en human tarmepitelcelle model [11]. De fleste af de proteiner, der er til stede i torskefiskrammeekstrakter, er kollagen og kollagenfragmenter. Andre forbindelser omfatter mindre mængder af lipider, aske og nogle sukkerarter. Sardinekstrakter var rige på peptider og aminosyrer, og lipider, aske og sukker var også til stede. Da fiskeafledte proteiner og peptider kan blive en vigtig ressource for kosmetiske industrier, sigter denne undersøgelse på yderligere at evaluere det aktive potentiale af disse ekstrakter afledt af fiskeforarbejdningsaffald og biprodukter forårsaget af vurderingen af ​​deres kosmetiske potentiale [23] . Til dette formål blev der anvendt en række kemiske, enzymatiske og cellebaserede assays for at udforske antioxidant-, antialdrings-, anti-hyperpigmenterings-, anti-inflammatoriske og antimikrobielle virkninger af de ekstraherede prøver. Korrelationsundersøgelser blev også udført for at identificere de vigtigste bioaktive bestanddele med kosmetisk potentiale.

2. Materialer og metoder

2.1. Reagenser

3,4-dihydroxy-l-phenylalanin (L-DOPA), svampetyrosinase, porcin pancreas elastase (PPE) type III, N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAAPVN), Tris ({ {11}}amino- 2-hydroxymethylpropan-1,3-diol), 2,20 -azobis (2-methylpropionamidin)dihydrochlorid (AAPH) og 20 ,70 -dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Calcium-justeret Mueller Hinton bouillon (CAMHB) blev købt fra BD (Sparks, MD, USA). Hjerne-hjerte-infusion (BHI) blev købt fra Avantor (Radnor, PA, USA). AnaeroGen™ Compact-poser blev købt fra Oxoid (Hampshire, UK). PrestoBlue™, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og Penicillin-Streptomycin blev opnået fra Invitrogen (San Diego, CA, USA). Human udødeliggjort ikke-tumorigen keratinocytcellelinje HaCaT blev opnået fra Cell Line Service (Eppelheim, Tyskland). Human IL-8 og IL-6 Mini TMB ELISA Development Kits blev opnået fra Peprotech (London, UK). Alle andre reagenser og opløsningsmidler anvendt i denne undersøgelse var af analytisk kvalitet og købt fra tilgængelige leverandører.

2.2. Prøver

De ekstrakter, der blev brugt i dette arbejde, var dem, der blev udviklet i vores tidligere undersøgelser med fokus på procesoptimering [11,22]. Kort fortalt blev torskerammer leveret af Pascoal og Filhos SA (Gafanha da Nazaré, Portugal) og bestod af fiskerygben og vedhæftet muskel. Sardinaffald, lavet af hoveder, pigge og indvolde, blev leveret af Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim, Portugal). Den nærliggende sammensætning af de anvendte råmaterialer er blevet præsenteret i vores tidligere værker [11,22]. Protein (47 vægtprocent) og aske (39 vægtprocent) var hovedkomponenterne i torskefiskestel med små mængder lipider og kulhydrater (henholdsvis 2 vægtprocent og 0,3 vægtprocent). Kollagen har vist sig at være det vigtigste protein i torskerammer, og i dette tilfælde tegner det sig for ca. 65 procent af det samlede proteinindhold i originalt affald. I modsætning hertil er sardin en fedtet fisk, så dens affald er meget rigere på lipider end torskerammer. Sardinaffald viste et lipidindhold på 26 vægtprocent og et proteinindhold på 52 vægtprocent, resten var aske (17 vægtprocent) og kulhydrater (3 vægtprocent).

Ekstrakterne fra torskerammer (Cf1, Cf2, Cf3 og Cf4) og sardinaffald (S1, S2 og S3) udvalgt til dette arbejde blev opnået ved højtryksteknologi i et apparat i laboratorieskala som tidligere beskrevet [11,22 ,24] under anvendelse af betingelserne opsummeret i tabel 1. Kort fortalt blev 60 g formalet torskerammer eller sardinaffald (affedtet eller ikke-affedtet) fyldt i en højtryksreaktor, der blev sat inde i en ovn. Vandpumpen blev tændt ved ønsket flowhastighed (ca. 10 ml/min), og trykket blev indstillet til 100 bar. Så snart trykket nåede denne værdi, blev den elektriske ovn tændt, og forsøget startede. De forskellige ekstrakter blev opsamlet i 30 minutter ved forskellige temperaturer (90-250 ◦C). S1- og S3-ekstrakter blev opnået efter en affedtningsproces af sardinaffaldet med ScCO2 før SW-ekstraktion. Subkritiske vandekstraktionsforsøg blev duplikeret. For hver ekstraheret prøve blev 25 ml taget i tre eksemplarer, lyofiliseret og vejet for at beregne det tilsvarende ekstraktionsudbytte. Analytiske data - proteinindhold - udtrykkes som middel ± standardafvigelse (SD) af triplikater. Informationen vedrørende karakteriseringen af ​​disse ekstrakter med hensyn til proteinindhold, aminosyreprofil, vigtige mineralforbindelser eller giftige og tungmetaller er beskrevet i vores tidligere værker [11,22].

Stamopløsninger af Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 og S2 blev fremstillet i Milli-Q H2O i en koncentration på 100 mg/ml. De andre prøver, nemlig S1 og S3, blev opløst i DMSO (henholdsvis 300 og 550 mg/ml) på grund af deres lavere opløselighed i vand. Prøver blev frosset og opbevaret ved -20 ◦C indtil videre brug. Til cellulære assays blev prøverne tidligere steriliseret ved varme (121 ◦C, 15 min) i en autoklave (Tuttnauer 3870 el, Breda, Holland).

2.3. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) analyse

ORAC-assay blev udført for at evaluere prøvernes antioxidantkapacitet over for peroxylradikaler (ROO• ), efter metoden udviklet af Huang et al. [25], med nogle justeringer som tidligere rapporteret [26]. Kort fortalt blev 150 µL dinatriumfluorescein (0,3 µM) i en sort 96-brøndsmikroplade tilsat til 25 µL prøvefortyndinger og inkuberet i 10 minutter ved 37 ◦C. Bagefter blev reaktionen initieret ved tilsætning af 25 µL 2,20 - Azobis (2-amidinopropan) dihydrochlorid (AAPH, 153 mM) og fluorescens (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20) nm) blev målt i 40 minutter ved 37 ◦C i en FLx800 fluorescens mikropladelæser (FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). En standardkurve blev fremstillet under anvendelse af 5, 10, 20, 30 og 40 µM (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylsyre (Trolox) )). Alle opløsninger blev fremstillet i phosphatpufret saltvand (PBS), 75 mM, pH 7,4. Resultaterne er udtrykt som mikromol Trolox-ækvivalent antioxidantkapacitet pr. gram ekstrakt (µmol TEAC/g ekstrakt).

2.4. Enzymatiske analyser

2.4.1. Elastaseinhiberingsassay

Dette assay var baseret på arbejde af Wittenauer et al. [27] med nogle modifikationer som beskrevet tidligere [6]. Elastaseinhiberende aktivitet bestemmes ved en spektrofotometrisk metode ved anvendelse af porcin pancreatisk elastase (PPE) og N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAAPVN) som enzym-substrat, ved at overvåge frigivelsen af ​​p-nitroanilin ved 41{ {19}} nm. PPE blev opløst i 100 mM Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-propan-1,3-diol)-HCl-buffer (pH=8.0) til en koncentration på 1 mg/ml og opbevaret ved 20 ◦C i alikvoter. På dagen for assayet blev en aliquot udtaget og fortyndet i bufferen til en koncentration på 0,03 U/ml, 10 µL blev fyldt i brøndene på mikrotiterpladerne sammen med 100 µL af Tris-HCl bufferen og 30 µL af hver prøve. Efter 20 minutters præ-inkubation ved 25 ◦C blev reaktionen initieret ved tilsætning af 40 µL af substratet AAAPVN (0,55 mM). Absorbans blev målt i 20 minutter efter tilsætning af AAAPVN ved en BioTek Instruments EPOCH 2 spektrofotometer mikropladelæser. Beregningerne blev foretaget som beskrevet i ligning (1), hvor A-kontrol og A-prøve repræsenterer absorbansen ved 410 nm i henholdsvis fravær eller tilstedeværelse af prøven. Da DMSO blev brugt til at opløse prøverne S1 og S3, blev dette opløsningsmiddel også testet og brugt som kontrol for disse prøver. Ekstrakternes potentiale til at inhibere elastase blev evalueret med stigende koncentrationer, for at bestemme dosisafhængige relationer og etablere de halvmaksimale inhiberende koncentrationer (IC50) værdier, hvilket indikerer kapaciteten af ​​hver prøve i enzymatisk aktivitetsinhibering i et omfang på 50 procent.

Alle resultater er udtrykt som IC50-middelværdier med de nedre og øvre grænser for et 95 procents konfidensinterval, opnået fra mindst tre uafhængige eksperimenter.

2.4.2. Tyrosinaseinhiberingsassay

Det tyrosinaseinhiberende potentiale af ekstrakterne blev evalueret spektrofotometrisk under anvendelse af svampetyrosinase og L-DOPA som substrat [28]. Tyrosinase omdanner L-DOPA til dopaquinon, som sekventielt vil cyklisere for at danne dopakrom. Dopachromdannelsen kan observeres ved måling af absorbansen ved 475 nm. Substratet blev tilsat til enzymet i nærværelse af prøvefortyndingerne til en slutkoncentration på 3 0 U/mL tyrosinase og 2,5 mM L-DOPA. Da DMSO blev brugt til at opløse prøverne S1 og S3, blev dette opløsningsmiddel også testet og brugt som kontrol for disse prøver. Efter inkubation ved 37 ◦C i 30 minutter blev absorbans målt ved 475 nm på et BioTek Instruments EPOCH 2 mikropladespektrofotometer. Alle reagenser blev fremstillet i natriumphosphatbuffer (SPB; 0,1 M, pH 6,8), fremstillet ved at blande dibasisk natriumphosphatdihydrat og monobasisk natriumphosphatmonohydrat, og beregningerne blev foretaget som beskrevet i ligning (1). Alle resultater er udtrykt som IC50-middelværdier med de nedre og øvre grænser for et 95 procents konfidensinterval, opnået fra mindst tre uafhængige eksperimenter.

2.5. Antimikrobiel følsomhedstest

Målmikroorganismerne udvalgt til de antibakterielle aktivitetsassays var de gram-negative bakterier Klebsiella pneumoniae CECT 8453 og de gram-positive bakterier Staphylococcus aureus ATCC 6538 og Cutibacterium acnes ATCC 6919T. For K. pneumoniae CECT 8453 og S. aureus ATCC 6538 blev assays udført i henhold til bouillon-mikrofortyndingsmetoden i CLSI M07-A10-retningslinjer som tidligere beskrevet af Rodrigues et al. [29]. Kort sagt blev ekstraktstamopløsninger fordelt i en rundbundet mikrotiter-96-brøndplade og 2-foldet seriefortyndet i calcium-justeret Mueller Hinton-bouillon (CAMHB; BD, Sparks, MD, USA) for at opnå en koncentrationsområde af opløsninger. Podestoffet blev fremstillet under anvendelse af vækstmetoden for at opnå en homogen suspension i en saltvandsopløsning. Det justerede inokulum blev yderligere fortyndet i CAMHB for at garantere, at hver brønd efter inokulering indeholdt omkring 5 x 104 CFU. Pladerne blev inkuberet under aerobe betingelser ved 37 ◦C i 16 til 20 timer. For C. acnes blev assays udført som tidligere beskrevet med brug af hjerne-hjerte-infusion (BHI) (Avantor, Radnor, PA, USA) bouillon i stedet for CAMHB og ved at inkubere mikrotiterpladerne i 70-74 timer ved 37 ◦ C i anaerobe krukker indeholdende atmosfæregenereringssystemet AnaeroGen™ Compact (Oxoid, Hampshire, UK).

For hver analyseret stamopløsning, en positiv kontrol (CAMHB eller BHI og fortyndet podestof), en medium sterilitetskontrol (uinokuleret CAMHB eller BHI) og en ekstraktsterilitetskontrol (uinokuleret 2-fold ekstraktstamopløsning i CAMHB eller BHI) blev udført i overensstemmelse hermed. Minimum hæmmende koncentration (MIC) værdier var den laveste koncentration af en prøve, der synligt hæmmede mikrobiel vækst efter inkubation. Når det var nødvendigt, blev MIC-værdier bekræftet ved hjælp af cellelevedygtighedsreagenset PrestoBlue™ (Invitrogen, San Diego, CA, USA) efter producentens retningslinjer. En yderligere MIC-værdi, betegnet MIC*, blev også etableret og defineret som den laveste koncentration af en prøve, ved hvilken bakterievækst var visuelt og differentielt påvirket i sammenligning med den positive kontrol. Minimum bakteriedræbende koncentration (MBC) værdier blev rapporteret som den laveste koncentration af en prøve, hvilket førte til mindst en 99,9 procent reduktion i levedygtige bakterietal sammenlignet med det oprindelige inokulum og for samme inkubationstid. Resultaterne blev udtrykt som en median af værdierne opnået efter tre biologiske gentagelser. Da DMSO blev brugt til at opløse prøverne S1 og S3, blev dette opløsningsmiddel også testet for at sikre, at den anvendte endelige koncentration ikke interfererede med målmikroorganismen, derfor analysen.

2.6. Cellebaserede analyser

2.6.1. Cellekultur

Human keratinocytcellelinje HaCaT (CLS, Tyskland) blev dyrket i et standard Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10 procent (v/v) føtalt bovint serum (FBS) og 1 procent (v/v) penicillin-streptomycin. Cellerne blev rutinemæssigt opretholdt som monolag i 75 cm2 kulturkolber og inkuberet ved 37 ◦C med 5 procent CO2 i en fugtig atmosfære.

2.6.2. In vitro cytotoksicitet

Cytotoksicitetsassays blev udført i henhold til tidligere værker [6]. Kort fortalt blev HaCaT-celler podet ved en tæthed på 1,4 × 1 05 celler/cm2 i 96-brøndsplader. Efter 3 dage blev celler inkuberet med forskellige koncentrationer af hver prøve (Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2—50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, {{30} }.78, 0.39; S1—3, 1.5, 0.75, 0.38, {{40}}.19, {{51 }}.09, 0.05, 0.02; S3—5.5, 2.75, 1.38, 0.69, 0.34, 0.17, 0,09, 0,04 mg/ml) fortyndet i dyrkningsmedium (DMEM-medium indeholdende 0,5 procent FBS). Brønde indeholdende celler kun inkuberet med dyrkningsmedium suppleret med 0,5% (v/v) FBS blev anvendt som kontrol. Opløsningsmiddelkontroller med 50 procent vand eller 1 procent DMSO i et dyrkningsmedium blev også udført for at udelukke opløsningsmiddeltoksicitet. Efter 24 timers inkubation blev cellelevedygtigheden evalueret ved hjælp af PrestoBlue® (5 procent v/v i dyrkningsmedium) i 2 timer ved 37 ◦C, 5 procent CO2 i henhold til producentens instruktioner. Herefter blev fluorescensen af ​​hver brønd målt (eks./em. 560 ± 20/590 ± 20 nm) i en FLx800 fluorescens mikropladelæser (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Cellelevedygtighed blev udtrykt som procentdelen af ​​levedygtige celler i forhold til kontrollen. Tre uafhængige eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.

2.6.3. Cellulær antioxidantaktivitet

Cellulær antioxidantaktivitet blev evalueret ved at følge tidligere beskrevne metoder [6,30], med nogle modifikationer. Kort fortalt blev HaCaT-celler podet ved en tæthed på 1,4 × 105 celler/cm2 i plader med 96 brønde, og dannelsen af ​​intracellulær ROS blev overvåget ved hjælp af 20,70 -dichlorfluoresceindiacetat ( DCFH-DA) som en fluorescerende probe. 72 timer efter podning blev celler vasket med PBS og inkuberet med ikke-toksiske koncentrationer af prøverne (0,1875 mg/ml; 0,375 mg/ml; 0,75 mg/ml) plus 25 µM DCFH-DA i PBS i 1 time. Efterfølgende blev cellerne vasket igen med PBS og inkuberet med stressinduceren (600 µM AAPH i PBS) i 1 time. Derefter blev fluorescens målt i en FL800 mikropladefluorescenslæser (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm). Resultaterne er udtrykt som ROS-procent i forhold til den ubehandlede kontrol (celler behandlet med DCFH-DA og AAPH). Tre uafhængige eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.

2.6.4. Evaluering af IL-6 og IL-8 sekretion

Eksperimenter blev udført som tidligere beskrevet [31], med flere modifikationer. Kort fortalt blev HaCaT-celler podet ved en tæthed på 1 × 1 05 celler/cm2 i 12-brøndsplader. Efter 3 dage blev celler stimuleret med 15 µg/mL lipopolysaccharider (LPS) fra Escherichia coli og co-inkuberet med tre forskellige koncentrationer af hver ekstrakt ({{10}}.1875 mg/mL; {{ 14}},375 mg/ml; 0,75 mg/ml) fortyndet i dyrkningsmedium (DMEM-medium indeholdende 0,5 procent FBS). Celler kun inkuberet med LPS og celler inkuberet med kun dyrkningsmedier blev anvendt som henholdsvis positive og negative kontroller. Efter 24 timer blev supernatanter opsamlet, centrifugeret i 10 minutter ved 2000 g og opbevaret ved -80 ◦C indtil videre analyse. IL-6- og IL-8-niveauer blev vurderet ved hjælp af enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits (PeproTech; London, UK), i henhold til producentens instruktioner, med absorbans målt ved 450 nm med bølgelængdekorrektion indstillet til 620 nm i et mikropladespektrofotometer (EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Resultaterne er udtrykt som IL-6 eller IL-8 procent i forhold til den positive kontrol (celler stimuleret med LPS). Tre uafhængige eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.

2.7. Statistisk analyse

ORAC og cellebaserede assayresultater er udtrykt som middelværdien ± SD, opnået fra mindst tre uafhængige eksperimenter. For de enzymatiske og cytotoksiske assays blev IC50-værdierne bestemt ud fra dosis-respons-kurver gennem log10-plot ved hjælp af GraphPad Prism 8.4.3. software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Resultater præsenteres som IC50 med et 95 procents konfidensinterval. Statistisk analyse af resultaterne blev udført under anvendelse af den tidligere software. Når homogen varians og en normal fordeling af dataene blev verificeret, blev resultaterne analyseret ved en-vejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Tukey-testen for flere sammenligninger. I tilfælde af heterogene varianser, eller hvis dataene ikke var normalfordelte, blev der udført en passende uparret Students t-test for at bestemme, om middelværdierne var signifikant forskellige. En p-værdi mindre end eller lig med 0,05 blev accepteret som statistisk signifikant i alle tilfælde. Resultater af antimikrobiel modtagelighedstest er udtrykt som medianværdien, opnået fra mindst tre uafhængige eksperimenter.

3. Resultater og diskussioner

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>45,7 g/100 g) blev valgt. Resultaterne vedrørende det samlede proteinindhold i hver ekstrakt er vist i tabel 1.

3.1. Antioxidant-, anti-aldrings- og anti-hyperpigmenteringsaktiviteter

Den potentielle kosmetiske effekt af ekstrakterne blev oprindeligt screenet ved hjælp af kemiske og enzymatiske assays for at evaluere deres antioxidant-, anti-aldrings- og anti-hyperpigmenteringseffekter. For antioxidantkapaciteten blev ORAC-assayet valgt, da det måler prøvers evne til at opfange biologisk relevant ROS, nemlig peroxylradikaler, som betragtes som en af ​​de vigtigste inducere af hudældning [2,32]. Anti-aldringseffekten blev også evalueret gennem elastasehæmning, da dette enzym rapporteres at være ansvarligt for nedbrydningen af ​​elastin og andre ECM-proteiner [6]. Til anti-hyperpigmenteringseffekten blev tyrosinase-assayet brugt til at evaluere prøvernes kapacitet til at inhibere melaninproduktion. Tabel 2 opsummerer ORAC- og IC50-værdierne for alle ekstrakter.

Vores resultater viser, at sardin- og torskeekstrakter udviste antioxidantaktivitet og hæmmende virkninger på elastase- og tyrosinase-enzymers aktivitet. Blandt sardinprøver viste S1 den højeste ORAC-værdi (1,94 ± 0,08 µmol TEAC/mg ekstrakt) efterfulgt af S3 og S2. Disse resultater er af en tidligere antioxidant-evaluering gennem en alternativ metode (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl-DPPH-assay), hvor ekstraktet S1 præsenterede de laveste IC50-værdier [22]. Den højere opfangningskapacitet over for peroxylradikaler i S1-prøven kunne være afledt af peptider med forskellige aminosyresekvenser til stede i ekstrakterne, da interaktioner mellem dem kan påvirke radikalopfangningsevnen [33]. Derudover kan forbindelser genereret i Maillard eller andre termooxidationsreaktioner påvirke prøvernes antioxidantaktivitet [34]. På trods af den laveste ORAC-værdi var prøverne S2 og S3 dem, der havde den højeste kapacitet til at hæmme henholdsvis tyrosinase- og elastaseaktiviteter.

Blandt torskeekstrakter blev Cf4 vist at have de højeste antioxidant- og antihyperpigmenteringsaktiviteter. SEC-GPC-analyse af ekstrakterne har vist, at peptider med faldende molekylvægt blev opnået ved at øge ekstraktionstemperaturen op til 250 ◦C [11]. Elastaseinhiberingskapaciteten af ​​denne prøve er inden for rækkevidden af ​​værdier fundet for andre Cf-ekstrakter, nemlig Cf1 og Cf3. For de testede koncentrationer viste disse to ekstrakter imidlertid ingen inhiberingsaktivitet over for tyrosinase.

I litteraturen viser nogle rapporter, at ekstrakter fra marine biprodukter har relevant antioxidantaktivitet og hæmning af tyrosinase. For eksempel har ekstrakter afledt af marine (Scophthalmus maximus) biprodukter ved alkalisk hydrolyse demonstreret antioxidantaktivitet, der opnås ved hjælp af forskellige kemiske assays: 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) radikalopfangende evne ( 36,12 procent omkring kontrol), ABTS (2,20 -azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre)-metode (12,81 µg BHT/ml) og crocinblegningsassay (8.{ {28}}3 µg Trolox/mL) [35]. I en anden undersøgelse viste enzymatisk ekstraktion af alunsaltede vandmænd (Lobonema smithii) at producere hydrolysater med høj antioxidantaktivitet (IC{{20}}. 9 mg/mL for ABTS e DPPH-assays) og tyrosinaseinhiberende potentiale, med IC50-værdier på mellem 14,1 og 24,5 mg/ml [36], som er i samme størrelsesorden som dem, der er opnået i dette arbejde Yderligere blev ekstrakter med lignende antioxidantværdier (ORAC-værdier – 0,4 til 3,5 µmol TEAC/mg ekstrakt) opnået fra en anden type restprodukter fra fødevareindustrien, nemlig affaldsstrømme fra vinfremstilling [6]. Disse vinrestekstrakter udviste imidlertid højere hæmmende kapaciteter for tyrosinase (IC50 fra 4,0 til 0,14 mg ekstrakt/ml) og elastase (IC50 fra 3,4 til 0,1 mg ekstrakt/ml) end dem opnået i dette arbejde, sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af ​​phenoliske forbindelser der er anerkendt for at have flere bioaktiviteter. Det er vigtigt at nævne, at vi i vores undersøgelse brugte svampetyrosinase til at screene ekstrakters anti-hyperpigmenteringseffekt, da dette enzym er blevet brugt i vid udstrækning i high throughput assays [37]. Ikke desto mindre, da der er nogle kontroverser vedrørende ligheden og homologien af ​​dette enzym med pattedyr/human tyrosinase [38-40], bør fremtidige undersøgelser, der involverer pattedyrscellelinjer, overvejes for at evaluere den potentielle anti-hyperpigmenteringseffekt af sardin- og torskeekstrakter.

For at identificere hvilke forbindelser, der kunne være ansvarlige for det bioaktive respons af ekstrakter, blev der udført korrelationsundersøgelser mellem bioaktivitetsdata og ekstrakternes aminosyresammensætning rapporteret tidligere [11,22] (tabel S1). For antioxidantaktivitet blev de højeste korrelationer (R2 større end eller lig med 0.7) opnået mellem ORAC-værdi og total threonin, fri valin samt fri og total leucin for alle ekstrakter. I tilfælde af sardinprøver blev der også opnået en høj korrelation (R2 større end eller lig med 0.94) for frit og totalt tryptofanindhold. Derfor er alle disse aminosyrer tidligere blevet rapporteret at have antioxidantegenskaber i flere modelsystemer [41-43]. For elastase- og tyrosinaseinhiberingsaktiviteter blev de højeste korrelationskoefficienter (R2 større end eller lig med 0.8) opnået for henholdsvis totalt proteinindhold og frit arginin, hvilket tyder på, at disse forbindelser kunne have en vigtig rolle i potentialet anti-aging og anti-hyperpigmenteringseffekt af fiskeindustriens affaldsstrømme ekstrakter.

【For mere info:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】