Beregningsmæssig undersøgelse af benzalacetophenonderivater mod SARS-CoV-2 som potentielle multi-target bioaktive forbindelser Ⅱ

3.7.2. Stabilitet af 3CLpro-carmofur kompleks

Den komplekse 3CLpro-carmofur viste stabil dynamik under de 15 0 ns simulering efter en ligevægtsperiode (60 ns). Den gennemsnitlige RMSD-værdi for rygraden og komplekset var henholdsvis 2,34 Å og 2,81 Å. De N- og C-terminale rester viste maksimale resterende fluktuationer (~10 Å). Imidlertid viste resterne, der var involveret i de stabile og bevarede ikke-bundne interaktioner, relativt meget mindre udsving (~2,0 Å). Rg-værdien afslørede et foldemønster under ~30 ns (Fig. 10) og viste sig at udtrykke delvis udfoldning, hvilket indikerer stabil ligandbinding. Derudover blev det observeret, at det oprindelige og endelige gennemsnitlige overfladeareal optaget af 3CLpro og carmofur-dokkompleks var henholdsvis 145,97 nm2 og 148,49 nm2. Det gennemsnitlige hydrofobe overfladeareal optaget af komplekset var 148,32 nm2, hvilket repræsenterede en proteinudfoldning og fleksibilitet af bindingslommen. Den supplerende film (S2) repræsenterer den detaljerede bindingstilstand og stabile dynamik af carmofur til 3CLpro. Dette kompleks dannede 6 stabileH-bindinger, hvoraf 4 var konsistente gennem simuleringerne. Man mente, at disse var stabileH-bindingsinteraktioner fremmede stabil kompleksdannelse. Den estimerede relative bindingsenergi af komplekset 3CLpro-carmofurkompleks var− 16,67 kcal/mol. Yderligere blev de vigtigste rester, der bidrager til bindingsenergien, identificeret ved at beregne nedbrydningsenergi pr. rest. ResterneThr25, Met49, Cys142, Met165, Leu167, Arg188,ogGln189favoriserede den stabile kompleksdannelse. Dog resterAsn142ogGlu166favoriserede ikke interaktionerne. Blandt disse rester,Met165viste betydelige bidrag til bindingsenergien, da den havde den mindste bidragsenergi (− 9,12 kJ/mol). Bidragsenergien for andre interagerende rester varierede dog mellem− 1,42 til− 5.601 kJ/mol og deltog også i stabil kompleksdannelse.

3.7.3. Stabilitet af PLpro - 4-hydroxycordoin (c30) kompleks

PLpro–4-hydroxycordoin (c30)-komplekset viste stabil dynamik og en lignende tendens gennem 150 ns. RMSD-værdien var stabil op til ~80 ns fra ~1,2 til ~1,5 Å og ~1,8 til ~2,2 Å for henholdsvis rygrad og kompleks. Efter ~80 ns blev RMSD fundet at være relativt højere (henholdsvis ~1,5-2,3 Å og ~2,2 til 3,5 Å) på grund af det øgede overfladeareal af protein. De resterende fluktuationer plottet for C afslørede dannelsen af ​​stabile ikke-bundne kontakter i rester med færre fluktuationer observeret i 4-hydroxycordoin (c30), dvs. Val203, Met207, Tyr208, Met209, Ile223, Pro224 og Pro248 sammenlignet med andre ikke-interagerende rester. Rg-værdien viste stabil kompleksdannelse under MD-simuleringen ved at danne en kompakt kugleform som afsløret ved et konstant fald i Rg-værdien. Den supplerende film (S3) præsenterer bindingstilstanden for 4-hydroxycordoin (c30) med PLpro. Det blev observeret, at løkken dannet af rester mellem to ark var tæt på bindingslommen og havde maksimal kontakt med molekylet. På grund af denne sløjfes fleksible karakter viste den imidlertid åbningen af ​​bindingslommen, hvilket resulterede i øget SASA og ligandbevægelse under MD-simuleringen efter ~85 ns. Det indledende og endelige overfladeareal optaget af PLpro og 4-hydroxycordoin (c30)-docket kompleks var henholdsvis 169,50 nm2 og 170,29 nm2. Det gennemsnitlige overfladeareal optaget af komplekset var 170 nm2. Komplekset dannede 3H-bindinger, hvoraf 2 var konsistente. Bindingsaffiniteten af ​​4- hydroxycordoin (c30) med PLpro blev estimeret ved at beregne relativ bindingsenergi. Komplekset viste bindingsenergi på − 16,28 kcal/mol. For at få mere strukturel indsigt i de enkelte resters bidrag til bindingsenergien blev restnedbrydningsenergien analyseret. Det blev observeret, at 7 rester bidrog signifikant til den stabile kompleksdannelse og begunstigede de eksisterende ikke-bundne interaktioner, dvs. Val203, Met207, Tyr208, Met209, Ile223, Pro224 og Pro248 (fig. 11). Det vigtigste er, at resterne Tyr208, Met209, Ile223 og Pro224 viste signifikante bidrag til bindingsaffiniteten ved at score den laveste bidragsenergi på henholdsvis -2,97, -3,89, -3,82 og -2,91 kJ/mol. Supplerende video relateret til denne artikel kan findes på https://d oi.org/10.1016/j.compbiomed.2022.105668.

3.7.4. Stabilitet af PLpro-GRL-0617 kompleks

PLpro-GRL-0617-komplekset var stabilt og udviste lignende RMSD-værdier op til 120 ns. RMSD-værdien for rygraden varierede fra ~1,3 Å til ~3.0 Å og ~1,8 Å til ~4,5 Å for komplekset. Det konstante fald i RMSD-værdien for rygraden blev observeret efter ~120 ns (fra ~3.{{20}} Å til 2.0 Å) og forblev stabil gennem hele MD-simuleringsperiode (150 ns). Tilsvarende viste den komplekse RMSD-værdi et lignende konstant fald i RMSD-værdien fra ~4,5 Å til ~3,0 Å. Efter ~120 ns steg RMSD-værdien yderligere op til 3,8 Å indtil 150 ns. De resterende fluktuationer af Gly164, Asp165, Thr211, Leu212, Asn216, Ile223, Ala247, Pro248 og Tyr265 var relativt mindre sammenlignet med andre ikke-interagerende rester. Selvom Cys225, Val226 og Cys227 viste maksimale resterende udsving op til 6 Å på grund af øget lokal fleksibilitet, blev ligandinteraktion observeret under simuleringen. Yderligere viste Rg-værdien en stabil kompleksdannelse op til ~70 ns. På grund af fleksibiliteten af ​​en loop-region, der støder op til ligandbindingslommen "Lys158 til Val166", blev ligandbevægelsen observeret mod andre bindingslommer (supplerende film S4), som også blev bevist ved en stigning i Rg-værdien ~70 ns. Derudover dannede GRL-0617 de stabile ikke-bundne kontakter gennem 150 ns MD-simuleringen som understøttet af det stabile Rg-mønster. I starten viste SASA en fleksibel bindingslomme og øget SASA-værdi. Dette kan have udløst reorienteringen af ​​liganden GRL- 0617. Det indledende og endelige overfladeareal optaget af PLpro- og GRL- 0617-docket kompleks blev noteret til henholdsvis 164,32 nm2 og 162,263 nm2. Det gennemsnitlige overfladeareal optaget af komplekset var 165,02 nm2. Tilsvarende indikerede de øgede SASA-værdier bindingslommeåbningen for stabil kompleksdannelse, som blev favoriseret hovedsageligt på grund af den fleksible natur af bindingslommeresterne. Komplekset dannede 4 H-bindinger, hvoraf 2 H-bindinger var konsistente under simuleringsperioden. Yderligere viste PLpro-GRL-0617-komplekset en bindingsenergi på -11,83 kcal/mol. Derudover blev den strukturelle indsigt i de enkelte resters bidrag til bindingsenergien kvantificeret ved at beregne nedbrydningsenergien pr. rest. Det blev observeret, at 9 rester havde et signifikant bidrag til den stabile kompleksdannelse og begunstigede de eksisterende ikke-bundne interaktioner, dvs. Thr211, Leu212, Asn216, Ile223, Cys225, Val226, Cys227, Ala247 og Pro248 (fig. 12). Vigtigst er det, at resterne Ile223, Cys225, Val226 og Cys227 viste signifikante bidrag til bindingsaffiniteten ved at score den laveste bidragsenergi på henholdsvis − 0,91, − 0,74, − 1.86 og − 1,08 kJ/mol. .

Supplerende video relateret til denne artikel kan findes på https://d oi.org/10.1016/j.compbiomed.2022.105668.

Fig. 5. GO-analyser af regulerede proteiner med benzalacetophenonderivater, der præsenterer cellulære komponenter, molekylær funktion og biologiske processer.

3.7.5. Stabilitet af spidsprotein - mallotophilippen D (c42) Kompleks

Spike protein-mallotophilippen D (c42) komplekset viste stabil dynamik efter en ækvilibreringsperiode på 100 ns svarende til de andre undersøgte komplekser. RMSD-værdien varierede mellem ~1,2 Å til 3 Å og 1,8 Å til ~4 Å for henholdsvis rygrad og kompleks. Simuleringen blev yderligere udvidet til 200 ns, da dette kompleks nåede en ækvilibreringstilstand efter 100 ns. Den gennemsnitlige rygrad og komplekse RMSD-værdier, der blev observeret, var henholdsvis ~2,6 Å og ~3,8 Å. De resterende fluktuationer plottet for C afslørede færre fluktuationer for resterne, der deltager i de ikke-bundne kontakter med mallotophilippen D (c42) sammenlignet med andre ikke-interagerende rester. Den fleksible sløjferegion dannet af resterne Alal344-Trp353 og Glu516-Thr523 var imidlertid yderst dynamisk og viste højere udsving (~3 Å). Rester aktivt engageret i ligand-protein-interaktionerne inklusive Phe342, Leu368 og Ile434 viste de mindste udsving (supplerende film S5). Yderligere blev et stabilt kompleks dannet under MD-simuleringen og etablerede en kompakt kugleform som afsløret af et fald i Rg-værdien efter 10 ns. Komplekset fulgte en stabil Rg-værdi efter 100 ns, hvilket indikerer den korrekte foldning, der var påkrævet for at danne et stabilt kompleks mellem ligand og protein. Det indledende og endelige overfladeareal optaget af spidsprotein og mallotophilippen D (c42)-docket kompleks var henholdsvis 112,38 nm2 og 112,6 nm2. Det gennemsnitlige overfladeareal optaget af komplekset var 111,4 nm2. Den supplerende film (S5) demonstrerer den detaljerede bindingsmåde for mallotophilippen D (c42) med spikeprotein. Komplekset dannede 6 H-bindinger, hvoraf 3 var konsistente. Bindingsaffiniteten af ​​mallotophilippen D (c42) til spidsprotein blev estimeret ved at beregne relativ bindingsenergi. Derudover viste komplekset en bindingsenergi på -34,10 kcal/mol. Yderligere afslørede energien pr. rest bidrag 12 rester fra bindingslommen, nemlig Phe342, Ala363, Asp364, Tyr365, Leu368, Leu371, Ala372, Phe374, Ile434, Trp436, Val511 og Leu513 for at bidrage signifikant til kompleksdannelsen (Fig. 13). Resterne Phe342, Leu368, Ile434 og Trp436 fra bindingslommen viste signifikante bidrag til bindingsaffiniteten ved at score den mindste restnedbrydnings-/bidragsenergi på henholdsvis - 5,78, - 9,39, - 4,71 og - 4,20 kJ/mol.

Fig. 7. Forudsagtantivirale spektreaf benzalacetophenonderivater mod flere vira. Det blev forudsagt, at størstedelen af ​​benzalacetophenonderivaterne var aktive mod herpesvirus (12,57 procent) og mindst mod trakom (0,57 procent).

3.7.6. Stabilitet af spike protein - DRI-C23041 kompleks

Spikeprotein-DRI-C23041-komplekset viste også stabil dynamik efter en ækvilibreringsperiode på 100 ns svarende til spikeproteinet mallotophilippen D (c42)-komplekset. Indledningsvis steg rygraden og komplekse RMSD-værdier gradvist fra ~1,8 Å til 5 Å og ~2 Å til ~5,1 Å for henholdsvis rygrad og kompleks. Resterne Val367, Leu368, Asp339, Asp364, Asp389 og Leu441 viste relativt færre fluktuationer (~4,0 Å), da de deltager i stabile ikke-bundne interaktioner med DRI-C23041. Den fleksible sløjfe dannet af resterne Ala475 til Asn487 viste maksimale resterende fluktuationer (~11,0 Å). Derudover blev et stabilt kompleks dannet af en stabil Rg-værdi på ~18 Å. Derudover blev ligandens rotation mod uret observeret ved ca. ~63 ns efter den delvise udfoldning af komplekserne, hvilket også blev bevist af den øgede Rg-værdi til 19,5 Å (supplerende film S6). Liganden genvandt imidlertid sin oprindelige position og optog stabile konformationer, og komplekset dannede kompakte kugleformede former som understøttet af et fald i Rg-værdien til 18,3 Å. Denne strukturelle overgang af ligand begunstigede den stabile kompleksdannelse under 150 ns MD-simuleringen. Det indledende og endelige overfladeareal optaget af spidsprotein og DRI-C23041-docket kompleks var 109.379 nm2 og 107.334 nm2. Det gennemsnitlige overfladeareal optaget af komplekset var 110,57 nm2. Komplekset dannede 4 H-bindinger, hvoraf 2 var konsistente. Den relative bindingsenergi mellem DRI-C23041 til spikeprotein blev fundet at være -3,10 kcal/mol. Bidragsenergien pr. rest afslørede 11 rester fra bindingslommen, nemlig Asp339, Glu340, Asp364, Asp389, Asp398, Asp405, Glu406, Asp427, Asp428, Asp442 og Glu516 for at bidrage væsentligt til dannelsen af ​​disse stabile komplekser (fig. rester scorede det mindste pr. restnedbrydning/bidragsenergi, der varierede fra henholdsvis -11,90 kJ/mol til -27,17 kJ/mol.

3.7.7. Hovedkomponent og dynamisk krydskorrelationsmatrix

Vi udførte hovedkomponentanalyse for at udforske den konformationelle fleksibilitet og diversitet af konformationer, der fremkommer fra den stabile bane opnået fra 150 ns MD-simuleringer, dvs. 100-150 ns for fem komplekser og 150-200 ns for spike protein-mallotophilippen D-kompleks. Den maksimale kollektive bevægelse fanges af de første 10 egenvektorer/hovedkomponenter. Derfor studerede vi præcist de to første egenvektorer/pc'er (Principal komponenter) i detaljer. Fig. 15 repræsenterer 2D-projektionen af ​​de første to egenvektorer. Det blev observeret, at standardmolekyler, der blev brugt i denne undersøgelse, nemlig Carmofur, GRL-0617 og DRI-C23041, rettet mod henholdsvis 3CLpro, PLpro og spikeprotein, viste større diversitet af konformationer under simuleringerne (vist som en rød linje) i fig. 15A-C) Udvalgte ligander, nemlig 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4′-O- -D-glucopyranosyl{{22} },2'-dihydroxychalcone, 4-hydroxycordoin og mallotophilippen D rettet mod henholdsvis 3CLpro, PLpro og spikeprotein viste mindre diversitet af konformationer under simulering. Dette afslører, at komplekser 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4′-O- -D-glucopyranosyl-4,2'-dihydroxychalcon med 3CLpro, 4-hydroxycordoin med PLpro og mallotophilippen D med spikeprotein er godt ækvilibreret og stabiliseret under simuleringen. Derudover udviste det større konformationelle rum optaget af komplekserne (standardmolekyler) højere konformationsfleksibilitet med det maksimale antal forskellige konformationer. Interessant nok er forbindelserne 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4′-O- -D-glucopyranosyl-4,2'-dihydroxychalcon, {{ 51}}hydroxycordoin og mallotophilippen D med 3CLpro, PLpro og spikeprotein optog relativt meget mindre konformationel plads sammenlignet med deres respektive kontroller/standard. Således foreslår vi, at screenede molekyler kunne være mere effektive end standardlægemidler (fig. 15D-F).

Den dynamiske krydskorrelation af C-atomer observeret i komplekser får mere strukturel indsigt i den kollektive bevægelse af de ligandbindende domæner. Fig. 16 repræsenterer den samordnede resterende bevægelse af C-atomerne i alle de simulerede komplekser. Den diagonale ravfarvede linje viser en stærk selvkorrelation af hver rest med sig selv. Amplituden af ​​korrelation til anti-korrelation skaleres fra henholdsvis rav til blå farve. I kompleks 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4′ -O- -D glucopyranosyl-4,2'-dihydroxychalcon-3 CLpro, bindingsstedresterne viser anti-korrelation med det N-terminale domæne af 3CLpro. Imidlertid er amplituden af ​​anticorrelation moderat, mens kompleks 3CLpro-carmofur (standard) viste lignende antiorrelation med meget mindre amplitude. Vi foreslår således binding af 3'-(3-methyl-2-butenyl)- 4′-O- -D-glucopyranosyl-4,2'-dihydroxychalcon, der ville favorisere den konformationelle overgang og fremme den stabile kompleksdannelse med forbedrede ikke-bundne interaktioner sammenlignet med dets standardmolekyle, dvs. carmofur. Ligeledes viste et andet kompleks 4-hydroxycordoin PLpro en stærk korrelation mellem resterne 50-175, men de samme rester i kompleks med standardlægemiddel GRL-0617 bundet til PLpro viste relativt svagere samarbejdsbevægelser. Den kooperative bevægelse udtrykt af bindingslommeresterne i området fra 175 til 240 med den N-terminale region afslørede betydningen af ​​resterne af det aktive sted i stabilisering af GRL-0617-PLpro-komplekset. Bindingslommekorrelationen gik tabt i det komplekse GRL-0617-PLpro. Standardmolekylet DRI-C23041-spike-proteinkompleks viste stærk samarbejdsbevægelse for resterne 390 til 470 med sig selv, mens disse rester i komplekse spike-mallotophilippen D viste anti-kooperativbevægelse. Desuden viste spike-mallotophilippen D-komplekset antikooperativ bevægelse bortset fra stærk selvkorrelation udtrykt af alle resterne.

Således viste den dynamiske krydskorrelationsmatrix den kooperative og anti-kooperative bevægelse i proteinet, hvilket fremhævede den konformationelle fleksibilitet af de undersøgte komplekser, og stabile ikke-bundne interaktioner medicineret af ikke-kooperativ bevægelse på den modsatte side udløste åbning og lukning af bindingslommen rester, der letter den stabile kompleksdannelse under MD-simuleringen.

Fig. 9. Parametre, der beskriver 3CLpro-3'-(3-methyl-2-butenyl)-4′-O- -D-glucopyranosyl-4, 2'-dihydroxychalconkompleks strukturelle stabiliteter. (a) RMSD af rygrad og kompleks, (b) RMSF, (c) Rg, (d) SASA, (e) antal H-bindingsinteraktioner og (f) bidragsenergiplot, der fremhæver vigtigheden af ​​de bindende lommerester i stabil kompleks dannelse.

Tabel 6

MM-PBSA-beregninger af bindingsfri energi og interaktionsenergier af tophitkomplekser.

4. Diskussion

Det er blevet indikeret, at immunforstærkere kan spille en hovedrolle i profylakse mod flere infektiøse pandemier, herunder COVID-19, da de er mere udbredte i kompromitteret immunitet. Tidligere er immunboosternes rolle i håndteringen af ​​COVID-19 blevet forklaret ved hjælp af kemiformatik og bioinformatiktilgange [34]. Tilsvarende forsøgte det nuværende arbejde at undersøge benzalacetophenoner (forstadier til flavonoider) [35] som immunforstærkere og antivirale midler mod ny coronavirus.

Indledningsvis blev forbindelserne hentet og udsat for lægemiddellignende forudsigelse baseret på molekylvægten, H-bindingsdonorer, acceptorer og lipofilicitet som forklaret af Lipinskis femteregel. Her blev størstedelen af ​​benzalacetophenonerne identificeret med positive lægemiddel-lignende score, hvilket tyder på deres orale biotilgængelighed [16]. Derudover kan nogle få modifikationer foretages i strukturen af ​​benzalaceto phenoner med negative lægemiddel-lignende score for at forbedre deres orale biotilgængelighed. Det skal dog bemærkes, at deres biologiske funktion ikke bør påvirkes. Yderligere blev de 5 bedste ligander med positive lægemiddellignende score, dvs. abyssinon VI (c1), isobavachalcon (c11), 4-hydroxycordoin (c30), mallotophilippen E (c31) og oxygeneret xanthohumol (c39) forudsagt for deres lipofilicitet, vandopløselighed, farmakokinetik og lægemiddellighed, da disse er centrale begrænsninger, der skal tages i betragtning for lægemidlets virkning. Interessant nok krænkede ingen af ​​disse 5 hits Lipkinski (molekylvægt<500, number of H-bond acceptors <10, number of H-bond donors <5, and XLogP<5) [36] and Veber (number of rotatable bonds ≤10, and the total polar surface area ≤140, also questions 500 molecular weight cutoff in Lipinski rule of 5) [37] rules. 

Derudover blev i alt 55 forskellige veje reguleret af benzalacetophenonerne under undersøgelser, hvor hypoxi-inducerbar faktor (HIF)-1, p53, nuklear faktor kappa B (NF-kB), toll-lignende receptor, tumornekrose faktor (TNF), gaffelboks, undergruppe O (FoxO), østrogen, Wnt, NOD-lignende receptor og interleukin-17 (IL-17) signalvej og cytokin-cytokinreceptorinteraktion blev identificeret at være optaget afregulerer immunforsvaret. Det er blevet rapporteret, at HIF-ekspression og stabilisering udløses af hypoxi og mikrober-associeret patogenese. Endvidere regulerer HIFværtens immunfunktion, booster phagocyt mikrobicid kapacitet og differentiering af T-celler efterfulgt af en cytotoksisk aktivitet. Derudover spiller HIF-signalvejen en hovedrolle i inflammation, makrofagmetabolisme og polarisering, mikrobiel infektion (både viral og bakteriel), antigenpræsentation ogmedfødt immunitet[38]. På samme måde blev HIF-1-signalvejen (hsa04066) identificeret til at blive reguleret via moduleringen af ​​FLT1-, GAPDH-, HMOX1-, NOS2-, TFRC- og TIMP1-gener, som ville spille en vigtig rolle i at manipulereimmunsystemved coronavirus-infektioner og håndtere betændelsen i det angrebne væv. P53-signalvejen manipulerer ogsåimmunresponsvia transaktivering af nøgleregulatorer afimmune signalveje.  

Fig. 10. Parametre, der beskriver 3CLpro-Carmofur komplekse strukturelle stabiliteter. (a) RMSD af rygrad og kompleks, (b) RMSF, (c) Rg, (d) SASA, (e) antal Hbond-interaktioner og (f) bidragsenergiplot, der fremhæver vigtigheden af ​​de bindende lommerester i stabilt kompleks dannelse.

Fig. 11. Parametre, der beskriver PLpro-4-hydroxycordoin-kompleksets strukturelle stabiliteter. (a) RMSD af rygrad og kompleks, (b) RMSF, (c) Rg, (d) SASA, (e) antal H-bindingsinteraktioner og (f) bidragsenergiplot, der fremhæver vigtigheden af ​​de bindende lommerester i stabil kompleks dannelse.

Yderligere rapporteres flere gener fra p53-signalvejene også i cytokinproduktion, patogensansning, inflammation og clearance af døde celler [39]. Derfor kunne benzalacetophenonerne være involveret i regulering af CASP8-, CCND2-, CHEK1- og MDM2-gener fra p53-signalvejen (hsa04115) og kan udløse cytokinerne til at øge immuniteten efterfulgt af clearance af dødt væv fra kroppen. Inflammatoriske cytokiner som TNF eller IL'er påvirker medfødte og adaptive immunresponser. Derudover er deres betydning blevet illustreret ved at acceptere patogenesen genereret via blokering af enkelte cytokiner som IL-6 eller TNF [40]. Heri blev benzalacetophenoner også forudsagt til at modulere flere veje som NF-kB (hsa04064), TNF (hsa04668) og IL-17 (hsa04657) signalvej og cytokin-cytokinreceptorinteraktion (hsa04060) som er direkte berørt af inflammatorisk cytokiner. Toll-lignende receptorer udtrykkes normalt i sentinelceller (dendritiske celler og makrofager) for at genkende mikrobe-afledte strukturelt konserverede molekyler og spiller en nøglerolle imedfødt immunsystem. Derudover rekrutterer de specifikke adaptermolekyler, aktiverer transkriptionsfaktorer som NF-kB, angiver resultatet af medfødte immunresponser og spiller en vigtig rolle i flere aspekter af det medfødte immunrespons på patogener [41]. Heri blev benzalacetophenonerne identificeret til at regulere de tre proteiner, dvs. CASP8, CD14 og CD86 i den toll-lignende receptorsignalvej. Ydermere spiller FoxO-underfamilien af ​​panden (Fox) transkriptionsfaktorer en afgørende rolle i cellen og den homøostatiske funktion afimmunrelevante cellerherunder T-celler, B-celler, neutrofiler og andre ikke-lymfoide afstamninger [42]. Yderligere regulerede benzalacetophenoner FoxO-signalvejen (hsa04068) ved at modulere tre proteiner (CAT, CCND2 og MDM2) mod 130 baggrundsproteiner med en falsk opdagelsesrate på 0,0137. På samme måde er østrogenreceptorer blevet anerkendt for at udvikle immuncellerne efterfulgt af deres deltagelse i membran-initieret steroidsignalering. Derudover producerer de type I interferon og også medfødt cytokinproduktion og udvikler eller fungerer responsen fra medfødte immunceller [43]. Ligeledes viste det foreliggende arbejde, at benzalacetophenoner regulerer østrogensignaleringsvejen (hsa04915) via moduleringen af ​​tre proteiner, dvs. MMP2, PGR og RARA, som kan udløse interferon- og cytokinproduktionen og hjælpe med immuncellernes hurtige respons. På samme måde spiller Wnt-signal en vigtig rolle i flere biologiske processer, herunder immuncelleregulering, som er meget forskelligartet i udviklingen af ​​naturlige dræberceller, T-celleinitiering, makrofagvirkning på vævsreparation og T-cellers thymopoiese [44]. Heri regulerede benzalaceto-phenoner Wnt-signalvejen (hsa04310) via moduleringen af ​​tre proteiner, dvs. CCND2, CTNNB1 og MMP7, og kan bidrage til at udvikle og regulere de naturlige dræberceller, T-celler og makrofager. På samme måde fungerer NOD-lignende receptorer i mikrobiel genkendelse, og værtsforsvarsmekanismer rapporteres og udløser også værtens medfødte immunrespons. Derudover er den NOD-lignende receptorfamilie bekymret for vært-patogen-interaktioner og inflammatoriske responser [45], som er blevet reguleret via modulering af 3 proteiner, dvs. CASP8, CCL2 og CYBA.

I interaktionen mellem benzalacetophenoner-mål-veje blev flere parametre for hele netværket evalueret. Den gennemsnitlige forbindelse mellem alle noderne med deres naboer er defineret af "naboforbindelsen" [46]. Denne variabel blev defineret i det ovennævnte netværk af naboer til 63,8 procent. Derudover måler "mellemliggende centralitet" den nodefrekvens, der skal være til stede på den korteste vej mellem andre noder. Dette peger på, at noden fungerer som en bro mellem noderne i netværket. Dette hjælper med at identificere den korteste vej og frekvensen af ​​uafhængige noder til at falde på en [47], som blev observeret at være korreleret med naboantal med 1. På samme måde stemmer "nærhedscentralitet" hver node baseret på deres 'nærhed' til andre noder og beregner den korteste vej mellem knudepunkterne. Dette hjælper med at forstå den enkelte nodes indflydelse på det givne netværk hurtigst [47]. I nærværende arbejde blev nærhedscentraliteten observeret at være afhængig af naboerne med 2 procent.

Under identifikationen af ​​nye antivirale midler til den nye virus kunne sporing af den antivirale egenskab mod en velkendt virus spille en let leg. Forudsat dette undersøgte vi benzalaceto-phenonerne af interesse i det anti-virale biologiske spektrum. I denne blev det observeret, at udvalgte benzalacetophenoner havde antivirale egenskaber mod adeno, cytomegalo, hepatitis, herpes, trachoma, influenza, parainfluenza, picorna, kopper, næsehorn og human immundefektvirus. Ydermere identificerede GO-analyse også reguleringen af ​​infektionssygdomsvejene, dvs. human papillomavirusinfektion (hsa05165), Kaposis sarkom-associeret herpesvirusinfektion (hsa05167), viral carcinogenese (hsa05203), HTLV-I-infektion (hsa05166), herpes simplex-infektion (8) ), og viral myocarditis (hsa05416), der er bekymret for viral infektion vedrørende KEGG-databasen. Disse resultater fik os yderligere til at undersøge den sandsynlige antivirale egenskab af benzalacetophenoner mod den nye coronavirus.

For at evaluere den sandsynlige antivirale virkning af benzalacetophenoner mod SARS-CoV-2 brugte vi in ​​silico molekylær docking og all-atom eksplicitte MD-simuleringer til at undersøge bindingsaffiniteten af ​​ligander mod 3 mål af ny coronavirus, dvs. 3CLpro, PLpro og spike protein receptor-bindende domæne. Her opnåede alle benzalacetophenonerne en bindingsenergi på mindre end − 5,0 kcal/mol. Yderligere forbindelser interagerede med alle de tre mål med minimum én H-bindingsinteraktion undtagen nogle få, dvs. 4-chlorochalcon (c4), obochalcolacton (c17), 4'-O-methylbavachalcone (c22) og mallotophilippen E ( c31) med 3CLpro,2'-hydroxychalconen (c2), 4-chlorchalconen (c4), 4- hydroxychalconen (c5), okanin (c7), 2' ,3,4,4' ,6 ′-pentahydroxychalcon (c8), chalcon (c10), (plus )-tephroson (c12), pinocembrinchalcon (c13), 4'-O-methylbavachalcon (c22) og 2',4'-dihydroxy-6' - methoxy-3',5'-dimethylchalcon (c43) med PLpro og 2'-hydrox ychalcone (c2), 4-chlorchalcone (c4), chalcone (c10), desmethylxanthohumol (c21), 4 ′ -O-methylbavachalcon (c22), 7- methoxypraecanson B (c29), mallotophilippen C (c41) og 2' ,4' - dihydroxy-6'-methoxy-3' ,5 ′ -dimethylchalcon (c43) med spike protein. Derudover er 3CLpro til stede i nsp5, der gennemgår automatisk spaltning og frigiver alle nedstrøms replikaseunderenheder for at ændre ubiquitinsystemet, der påvirker de funktionelle proteiner [48], som hovedsageligt var målrettet af obochalcolacton (c17) med en - 8,5 kcal/mol bindingsenergi, men det havde ingen H-bindingsinteraktioner. Den virale cyklus af coronavirus reguleres af replikaseproteiner udløst via pp1a og pp1ab og behandles af PLpro [49], som hovedsageligt blev moduleret af 4-hydroxycordoin (c30) og xanthohumol (c38) med en bindingsaffinitet på - 8,2 kcal/mol af begge ligander. Ligeledes bruger coronavirussen ACE2 som en gateway til at komme ind i værtscellen [50,51] og var hovedsageligt målrettet af abyssinon VI (c1). Disse resultater afspejler multiple molekyler (af en lignende kategori), som kan bruges til at målrette de forskellige steder af virusanatomi på grund af deres affinitet til flere proteiner via "multi-forbindelse(r)-multiprotein(er)"-interaktionsteorien. Et af de vigtige aspekter af den præsenterede undersøgelse er identifikation af virale indgangshæmmere, som dækkede 7,71 procent af de samlede benzalacetophenoner under undersøgelse (fig. 7). Derfor blev bindingen af ​​benzalacetophenoner med spike protein receptor-bindende domæne tilføjet som spike protein og er en direkte nøgle til at gnide den normale celle homeostase. Derudover er et af de vigtige aspekter, der skal tages i betragtning, at "rigtigt molekyle-højre mål-højre varighed" som en irrationel vurdering kan forårsage takyfylakse mod patogenesen af ​​interesse, herunder COVID{101}}, som kunne løses via "multi-komponent -multi protein" interaktion over "enkeltforbindelse-enkelt mål" interaktionsteori. Derudover pegede denne undersøgelse på reguleringen af ​​nogle specifikke veje, f.eks. TNF, NF-kB og IL-17 signalveje og cytokin-cytokinreceptorinteraktion (fig. 17), der er direkte berørt afimmunreguleringog også manipulere cytokinstormen.

Fig. 16. Dynamisk krydskorrelationsmatrix af C-atomer observeret i komplekser for benzalacetophenoner (A, C, E) og standardlægemidler (B, D, F) med 3CLpro, PLpro oghhv spidsprotein. De positive områder, som er farvet rav, repræsenterer stærkt korrelerede bevægelser af C-atomer (Cij=1), hvorimod den negativeområder, som er farvet blå, repræsenterer anti-relaterede bevægelser (Cij=-1).

Tidligere er der foretaget flere undersøgelser for at implementere homologimodellering, molekylær docking, MD-simuleringer og MM-PBSA-evaluering for at registrere lægemiddeltransportvariabiliteten, identifikation af proteinallosterisk hæmning, chiralitets indflydelse i selektiv enzymhæmning, udforskning af den uigenkaldelige tilstand af receptorerne og ligand-protein-interaktionsvurdering [52-56]. Tilsvarende i dette arbejde blev intermolekylære interaktionsstabilitet af identificerede potentielle ledende forbindelser og standardmolekyler med deres respektive mål analyseret gennem klassisk MD-simulering i 150 ns (spike protein - mallotophilippen D (c42) kompleks i 200 ns). Resultater viste, at 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4′-O- -D-glucopyranosyl-4, 2'-dihydroxychalcon (c35) udviste stabil dynamik med 3CLpro sammenlignet med et standard molekyle carmofur. Tidligere blev carmofur rapporteret at hæmme coronavirus-replikation i Vero E6-celler (EC50=24.30 μM) ved at interagere med Cys145-resten af ​​3CLpro [57]. Tilsvarende blev carmofur i denne undersøgelse forudsagt at interagere med Cys145-rest ved at score bidragsenergi på -1,42 kJ/mol, hvorimod 3'-(3-methyl-2-butenyl)-4 ′ -O- -D-glucopyranosyl-4,2'-dihydroxychalconforbindelser scorede -4,24 kJ/mol for Cys145. Derudover er Cys145-His41 de to katalytiske dyadrester af 3CLpro, der spiller en vigtig rolle i spaltningen af ​​SARS-CoV -2 polyproteiner [58]. Derudover rapporterede andre forskningsgrupper også den potentielle rolle at målrette Cys145 for at designe nye antivirale midler mod 3CLpro [59,60]. Interessant nok observerede vi konserverede bindingsstedinteraktioner (Thr25, Met49 og Met165) i begge disse forbindelser under 150 ns MD-simuleringen. Tilsvarende blev 4-hydroxycordoin (c30) screenet som en inhibitor af PLpro og dannede et stabilt kompleks sammenlignet med et standardmolekyle GRL-0617. Tidligere er GRL-0617 blevet rapporteret som en potent PLpro-hæmmer i SARS-CoV-2-inficerede Vero E6-celler med IC50 på 2,1 μM [61, 62]. I denne undersøgelse dannede både GRL-0617 og 4-hydroxycordoin (c30) stabil RMSD og delte fælles interaktioner med Ile223 og Pro248 gennem henholdsvis 150 ns og 200 ns MD-produktion, og afslørede begge som passende rammer som PLpro-hæmmere.

Derudover har Bojadzic et al. rapporterede, at DRI-C23041 hæmmer spike protein RBD domæne med IC50 på 0,52 μM [63]. I denne undersøgelse blev mallotophilippen D (c42) identificeret som en spidsproteinregulator og viste en bedre bindingsaffinitet til RBD-domænet af spidsprotein sammenlignet med et standardmolekyle DRI-C23041. MM-PBSA-resultatet afslørede, at mallotophilippen D (c42) besidder den frie bindingsenergi på - 34,10 kcal/mol, hvorimod - 3,10 kcal/mol af DRI-C23041, hvilket indikerede en højere affinitet af mallotophilippen D (c42) til spike protein . Ydermere blev både DRI-C23041 og mallotophilippenD (c42) fundet at interagere med en fælles rest Leu368 af spike protein RBD domæne under 150 ns MD simulering. Undersøgelsen af ​​komplekser for PCA og DCCM viste også, at chalconer med 3CLpro, PLpro og spikeprotein er godt ækvilibrerede og stabiliserede under simuleringen ved at optage relativt meget mindre konformationel plads og konformationel fleksibilitet med et minimum antal forskellige konformationer sammenlignet med standardmolekyler. Moderne, 4-hydroxycordoin (c30), en forbindelse med den højeste lægemiddellignende score regulerede 9 proteiner, dvs. FLT1, CD86, CASP8, RARA, KLK3, PLAT, CTNNB1, HMOX1 og TOP2A, hvori 6 proteiner, dvs. CASP8, CTNNB1, TOP2A, CD86, PLAT og HMOX1 blev sporet til at være bekymrede med den virale infektion. CASP8 koder for caspase 8; et viralt patogen, der retter sig mod den CASP8-afhængige apoptotiske celle og den nekrotiske celledødsvej, der er afhængig af det receptorinteragerende protein (RIP) 1 og 3. Derfor undertrykker erhvervelse af CASP8-aktiviteten RIP1 og 3 for at styrke rolle i værtsforsvar mod intracellulære virale patogener [64]. Tilsvarende koder CTNNB1 catenin -1 og er ansvarlig for interferonproteinsyntese [65], og er den primære modulator af immunresponset. Derudover kan det interferere med virusinfektioner [66]. Ligeledes koder TOP2A for topoisomerase 2, og dets hæmning inducerer telomerisk deoxyribonukleinsyreskade og T-celledysfunktion under kronisk viral infektion [67]. Endvidere koder CD86 T-lymfocytaktiveringsantigen CD86 og kontrollerer antiviral CD8 plus T-cellefunktion og immunovervågning [68]. PLAT koder for plasminogenaktivator og bidrager til den skadelige betændelse i lungerne og lokal fibrinkoageldannelse; kan være impliceret i værtens forsvar mod influenzavirusinfektioner [69]. Ligeledes koder HMOX1 for hæmoxygenase 1. Tidligere blev SARS-CoV-2 åben læseramme 3a-protein rapporteret at binde til det humane HMOX1-protein med høj konfidens. HMOX1-vejen kan hæmme trombocytaggregation og kan blandt andet have anti-trombotiske og anti-inflammatoriske egenskaber, som alle er kritiske medicinske tilstande observeret hos COVID-19-patienter [70].

Tidligere er det blevet indikeret, at det genomiske RNA af SARS-CoV-2 kan manipulere immungener og fratage deres funktion. Derudover er det blevet påpeget, at genomisk RNA kunne udløse interleukininteraktioner og også kan udløse cytokinstormen [71]. En undersøgelse udforsker også bitdelen af ​​mikroRNA (miRNA) i COVID-infektion for at undgå genkendelse og angreb fra immunresponset. På et øjeblik kan SARS-CoV-2 fungere som bomuld eller svamp for at absorbere miRNA'et og fremtvinge immunsystemets dysfunktion. Derudover koder den for sit miRNA, går ind i værtscellen og genkendes af værtens immunsystem [72].

Da benzalacetophenoner (chalconer) rapporteres til at manipulere immunresponset [11], og RNA er bekymret for immungensyntesen, skal deres sandsynlige rolle i manipulation af den genomiske RNA-interaktionsvært undersøges yderligere.

5. Konklusion

Denne undersøgelse undersøgte de multiple benzalacetophenoner som en immunforstærker og deres antivirale spektre mod SARS-CoV-2. Denne undersøgelse rapporterede sandsynlige ledende antivirale midler, nemlig abyssinon VI (c1), isobutrin (c16), obochalcolacton (c17), 4-hydroxycordoin (c30),3'-(3-methyl-2-butenyl )-4′-O- -D-glucopyranosyl-4,2'-dihydrox ychalcone (c35), xanthohumol (c38) og 4-mallotophilippen D (c42) mod COVID -19 ved at målrette mod 3CLpro, PLpro og spikeprotein. Derudover identificerede berigelsesanalyse reguleringen af ​​forskellige

veje som HIF-1, p53, NF-kB, Toll-lignende receptor, TNF, FoxO, østrogen, Wnt og IL-17. Også NOD-lignende receptorer og cytokin-cytokin-receptorer blev udløst, som er direkte beskæftiget med at regulere immunsystemet og manipulere cytokin-stormen. På samme måde var der en udløsning af flere veje mod viral og bakteriel infektion og endokrin deregulering, hvor immunsystemet hovedsageligt er kompromitteret. Disse resultater tyder på den terapeutiske mulighed for benzalacetophenon-derivater mod COVID-19. Begrænset til de nuværende resultater påpeger vi, at resultaterne præsenteret i dette arbejde er baseret på processorsimuleringer, som skal valideres yderligere med eksperimentelle protokoller for våde laboratorier.

Referencer

[1] AR Fehr, S. Perlman, Coronaviruses: en oversigt over deres replikation og patogenese, Metoder Mol. Biol. 1282 (2015) 1-23, https://doi.org/10.1007/978- 1-4939-2438-7_1.

[2] Y. Dong, X. Mo, Y. Hu, X. Qi, F. Jiang, Z. Jiang, S. Tong, Epidemiology of COVID-19 among children in China, Pediatrics 145 (2020), e20200702, https://doi.org/ 10.1542/peds.2020-0702.

[3] CJ Andersen, KE Murphy, ML Fernandez, Impact of obesity and metabolic syndrome on immunity, Adv. Nutr. 7 (2016) 66-75, https://doi.org/10.3945/ an.115.010207.

[4] SG Deeks, BD Walker, Immunresponsen på AIDS-virusinfektion: god, dårlig eller begge dele, J. Clin. Investere. 113 (2004) 808-810, https://doi.org/10.1172/JCI21318.

[5] M. Gendrot, E. Javelle, A. Clerc, H. Savini, B. Pradines, Chloroquine som et profylaktisk middel mod COVID-19, Int. J. Antimikrob. Agents 55 (2020), 105980, https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2020.105980.

[6] V. Mody, J. Ho, S. Wills, A. Mawri, L. Lawson, MCCJC Ebert, GM Fortin, S. Rayalam, S. Taval, Identifikation af 3-chymotrypsin-lignende protease (3CLPro) hæmmere som potentielle anti-SARS-CoV-2-midler, Commun Biol 4 (2021) 93, https:// doi.org/10.1038/s42003-020-01577-x.

[7] D. Shin, R. Mukherjee, D. Grewe, D. Bojkova, K. Baek, A. Bhattacharya, L. Schulz, M. Widera, AR Mehdipour, G. Tascher, PP Geurink, A. Wilhelm, GJ van der Heden van Noort, H. Ovaa, S. Müller, KP Knobeloch, K. Rajalingam, BA Schulman, J. Cinatl, G. Hummer, S. Ciesek, I. Dikic, Papain-lignende protease regulerer SARS-CoV{{ 3}} viral spredning og medfødt immunitet, Nature 587 (2020) 657-662, https://doi.org/10.1038/s41586-020-2601-5.

[8] Y. Huang, C. Yang, XF Xu, W. Xu, SW Liu, strukturelle og funktionelle egenskaber af SARS-CoV-2 spike protein: potentiel udvikling af antiviruslægemidler til COVID-19, Acta Pharmacol. Synd. 41 (2020) 1141-1149, https://doi.org/10.1038/s41401-020- 0485-4.

[9] F. Yazdanpanah, MR Hamblin, N. Rezaei, Theimmunsystemog COVID-19: ven eller fjende, Life Sci. 256 (2020), 117900, https://doi.org/10.1016/j. lfs.2020.117900.

[10] Z. Rozmer, P. Perj´esi, Naturligt forekommende chalconer og deres biologiske aktiviteter, Phytochemistry Rev. 15 (2016) 87-120, https://doi.org/10.1007/s11101-014- 9387-8.

[11] JS Lee, SN Bukhari, NM Fauzi, Effekter af chalcone-derivater på spillere af immunsystemet, Drug Des DevelTher 9 (2015) 4761–4778, https://doi.org/ 10.2147/DDDT.S{{7 }}.

[12] D. Zhou, D. Xie, F. He, B. Song, D. Hu, Antivirale egenskaber og interaktion mellem nye chalconderivater, der indeholder en purin- og benzensulfonamiddel, Bioorg. Med. Chem. Lett 28 (2018) 2091-2097, https://doi.org/10.1016/j. bmcl.2018.04.042.

[13] X. Tang, S. Su, M. Chen, J. He, R. Xia, T. Guo, Y. Chen, C. Zhang, J. Wang, W. Xue, Nye chalcone-derivater indeholdende en 1, 2,4-triazindel: design, syntese, antibakterielle og antivirale aktiviteter, RSC Adv. 9 (2019) 6011-6020, https://doi. org/10.1039/C9RA00618D.

[14] Y. Fu, D. Liu, H. Zeng, X. Ren, B. Song, D. Hu, X. Gan, Nye chalcone-derivater: syntese, antiviral aktivitet og virkningsmekanisme, RSC Adv. 10 (2020) 24483-24490, https://doi.org/10.1039/D0RA03684F.

[15] A. Lagunin, S. Ivanov, A. Rudik, D. Filimonov, V. Poroikov, DIGEP-Pred: webservice til in silico forudsigelse af lægemiddel-inducerede genekspressionsprofiler baseret på strukturel formel, Bioinformatics 29 (2013) 2062–2063, https://doi.org/ 10.1093/bioinformatics/btt322.

[16] CA Lipinski, Bly- og lægemiddellignende forbindelser: regel-af-fem revolution, Drug Discov. I dag Teknol. 1 (2004) 337-341, https://doi.org/10.1016/j. ddtec.2004.11.007.