KLRG1 markerer tumorinfiltrerende CD4 T-celleundersæt associeret med tumorprogression og immunterapirespons

Abstrakt

Nuværende metoder til biomarkøropdagelse og målidentifikation i immunonkologi er afhængige af statiske snapshots af tumorimmunitet. For grundigt at karakterisere den tidsmæssige karakter af antitumorimmunresponser, udviklede vi et 34-parameterspektralt flowcytometripanel og udførte high-throughput-analyser i kritiske sammenhænge.

Vi udnyttede to distinkte prækliniske modeller, der rekapitulerer henholdsvis cancerimmunoeditering (NPKC1) og immun checkpoint blokade (ICB) respons (MC38), og profilerede flere relevante væv ved og omkring vigtige vendepunkter for immunovervågning og flugt og/eller ICB respons.

Mål refererer til vigtige biomolekyler i celler, såsom proteiner, enzymer og receptorer. Målgenkendelse er brugen af ​​kemiske og biologiske metoder til at identificere de specifikke egenskaber og funktioner af disse biomolekyler til anvendelse i sygdomsbehandling og lægemiddeludvikling.

Immunitet refererer til kroppens evne til at modstå invasionen af ​​fremmede patogener og væksten af ​​endogene unormale celler. Kernen i immunsystemet er immunceller og molekyler, som har tætte forbindelser og interaktioner med deres mål.

I sygdomsbehandling og lægemiddeludvikling er forholdet mellem målidentifikation og immunitet meget vigtigt. For eksempel er virkningsmekanismen for mange lægemidler gennem målgenkendelse, målretning af specifikke proteiner, enzymer, receptorer og andre molekyler, påvirkning af deres funktioner og regulering af signaltransduktion for at opnå terapeutiske effekter. Celler og molekyler i immunsystemet kan også være mål for lægemidler. For eksempel opnår anticancerlægemidler terapeutiske virkninger ved at påvirke kræftcellernes immunrespons og regulere celleapoptose og proliferation.

Derfor kan en omfattende overvejelse af målidentifikation og immunitetsfaktorer i lægemiddeludvikling og klinisk behandling føre til mere effektiv lægemiddeludvikling og forbedret terapeutisk effekt. Fra dette synspunkt er vi nødt til at forbedre immuniteten. Cistanche kan øge immuniteten. Cistanche er rig på en række antioxidantstoffer, såsom C-vitamin, C-vitamin, carotenoider osv. Disse ingredienser kan fjerne frie radikaler, reducere oxidativt stress og forbedre immuniteten. system modstand.

Klik cistanche tubulosa ekstrakt pulver

Maskinlæringsdrevet dataanalyse afslørede et mønster af KLRG1-ekspression, der unikt identificerede intratumorale effektor CD4 T-cellepopulationer, der konstitutivt associeres med tumorbyrde på tværs af tumormodeller og går tabt i tumorer, der gennemgår regression som reaktion på ICB. Tilsvarende var en Helios-KLRG1 plus undergruppe af tumorinfiltrerende regulatoriske T-celler (Tregs) forbundet med tumorprogression fra immunligevægt til at undslippe og gik også tabt i tumorer, der reagerede på ICB.

Valideringsundersøgelser bekræftede KLRG1-signaturer i humane tumorinfiltrerende CD4 T-celler forbundet med sygdomsprogression i nyrekræft. Disse resultater udpeger KLRG1 plus CD4 T-cellepopulationer som undergrupper til yderligere undersøgelse af cancerimmunitet og demonstrerer anvendeligheden af ​​langsgående spektral flowprofilering som en motor for dynamisk biomarkør og/eller målopdagelse.

Introduktion

Immunterapi er nu en søjle i kræftbehandling. Imidlertid forbliver reaktioner på de fleste immunterapeutiske midler sjældne, begrænset til et begrænset antal tumortyper og vanskelige at forudsige(1). Forbedring af responsrater og udvikling af biomarkører, der forudsiger respons, er centrale mål for tumorimmunologiområdet, men dette er fortsat udfordrende.

Et væld af komplekse multicellulære interaktioner kan styre resultatet af et antitumorimmunrespons hos enhver given patient. Derfor er det almindeligt, at enkelte biomarkører – eller terapeutisk modulering af enkeltveje – har en tendens til at have nytte i nogle, men ikke de fleste cancerpatienter.

For eksempel er der tre immun-relaterede biomarkører i øjeblikket i udbredt klinisk brug; (i) tumormutationsbyrde (TMB), som målt direkte eller udledt via tilstedeværelsen af ​​invaliderende mutationer i DNA-reparationsmaskineri (2-4), (ii) PD-L1-ekspression ved immunhistokemi (IHC)(5), og (iii) allerede eksisterende immunitet målt ved tilstedeværelsen af ​​CD8 T-celler i og omkringliggende tumorer, betegnet Immunoscore(6).

Mens hver især er signifikant forbundet med respons på immunterapi i visse sammenhænge, ​​forbliver sensitiviteten og specificiteten af ​​disse prædiktorer suboptimale(7). Disse unimodale tilgange er sandsynligvis ikke i stand til fuldt ud at fange de komplekse mekanismer, der ligger til grund for antitumorimmunitet, herunder den dynamiske natur af sådanne responser, der forekommer på tværs af væv og over tid.

Som sådan kan anvendelsen af ​​stærkt multipleksede enkeltcelle-immunprofileringstilgange til biomarkørdetektion og målopdagelse på en tværvævs-, langsgående måde give nuancerede immunfænotyper med større forudsigelig og translationel anvendelighed.

Til dette formål udviklede vi et 34-parameterspektralt flowcytometripanel og en højdimensionel dataanalysepipeline til at undersøge immunfænotyper på proteinniveau, der er forbundet med forskellige faser af cancerimmunredigeringscyklussen, inklusive immunudslip og tumorudvækst og immunkontrolpunkt blokade (ICB) respons på tværs af prækliniske modeller.

Vi profilerede de NPK-C1- og ICB-behandlede MC38-modeller og analyserede flere væv (tumor, drænende versus ikke-drænende lymfeknuder og blod) over og omkring vigtige bøjningspunkter i tumorprogression. Dette lettede den dybe karakterisering af dynamikken bag naturlig og ICB-induceret tumorregression, overgang til immunligevægt og efterfølgende overgang fra ligevægt til ukontrolleret tumorflugt. Valideringsundersøgelser i humane enkeltcellede datasæt af nyrekræft bekræftede den translationelle relevans af disse fund.

Materialer og metoder

Mus. Han- og hunmus C57BL/6J (5-6 uger gamle) blev købt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Musene var 6-8 uger gamle på brugstidspunktet. Alle dyr blev opstaldet i nøje overensstemmelse med reglerne fra NIH og American Association of Laboratory Animal Care. Alle eksperimenter og procedurer for denne undersøgelse blev godkendt af Columbia University Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Cellelinjer. NPK-C1-cellelinjen (oprindeligt LM7304) blev leveret af Dr. Cory AbateShen ved Columbia University. Se tidligere referencer for yderligere detaljer(8,9). NPK-C1-celler blev opretholdt i R10, bestående af RPMI-medium (Corning; Corning, NY) suppleret med 10 procent FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD). MC38 coloncarcinomceller blev købt fra Kerafast og dyrket i D10 bestående af DMEM (Corning; Corning, NY) suppleret med 10 procent FBS, 100 U/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD).

Tumorudfordring og terapiinjektioner. NPK-C1-celler ved 70-90 procent konfluens eller MC38-celler ved 50-75 procent konfluens blev høstet med 0.05 procent trypsin (Gibco, Gaithersburg, MD), vasket med PBS, talt og resuspenderet ved 10x106 celler/ml i iskold PBS. På dag 0 blev 6-8 uge gamle mus implanteret på højre flanke med 1x106 NPK-C1- eller MC38-celler. Tumormålinger blev registreret i X-, Y- og Z-dimensioner (henholdsvis største diameter, mindste diameter og største højde) hver 2-3 dag med digital skydelære, og tumorvolumen blev beregnet ved at gange X*Y*Z. Anti-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) eller rotte IgG2a isotype antistof (Bio X Cell; Libanon, NH) blev fortyndet i steril PBS og administreret ved intraperitoneal (IP) injektion ved 200 ug/ mL pr. mus på dag 3, 6, 9 og 12 post-MC38 implantationer.

Vævshøstning. Efter aflivning af mus blev ~200 ul blod isoleret via hjertepunktur ved hjælp af en 0,2 procent heparin (StemCell Technologies; Vancouver, BC) coated sprøjtekanyle og anbragt på is i rør indeholdende 10 ul 0,5M EDTA (Corning; Corning, NY). Tumor-drænende og ikke-drænende lyskelymfeknuder blev dissekeret og placeret i 48-brøndsplader indeholdende 150 ul R10-medier på is.

Tumorer blev høstet, samlet, og op til 50 mg tumor blev skåret i tern og anbragt i X-Vivo 15-medier (Lonza; Basel, Schweiz) i 5 ml Eppendorf-rør på is. DNase (40 µl 20 mg/ml opløsning; Roche; Basel, Schweiz) og Collagenase D (125 µl 40 mg/ml opløsning; Roche; Basel, Schweiz) blev tilsat til tumorprøver før inkubation på en rystemaskine ved 37°C for 30 minutter. Fordøjelsesreaktioner blev standset ved vortexing (30 sekunder) og tilsætning af 5 ml R10-medium. Tumorfordøjelser blev filtreret gennem 70 μm filtre (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) og pelleteret. Blodprøver blev RBC-lyseret med to på hinanden følgende 2-minutters inkubationer i 2 ml ACK-buffer (Quality Biological; Gaithersburg, MD) og quenching i R10 før pelletering. Lymfeknuder blev fysisk adskilt med et 1 ml sprøjtestempel i 48-brøndpladen, derefter blev suspensioner filtreret gennem 40-um-filtre. Alle prøver blev placeret i U-bunde 96-brøndsplader til farvning.

Flowcytometri. Prøver blev vasket med PBS. Døde celler blev farvet ved resuspension i 100 ul PBS plus Live/Dead Fixable Blue farvestof (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Dette og alle yderligere farvnings- eller fikseringstrin blev udført i 30 minutter ved stuetemperatur på en pladeryster, beskyttet mod lys. Prøver blev vasket 2x med PBS og blev derefter resuspenderet i FACS (PBS plus 3 procent FBS plus 1 mM EDTA plus 10 mM HEPES) suppleret med TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) og TruStain Monocyte Blocker (1:20; BioLegend; San Diego, CA) og anbragt på is.

Overfladeantistoffer blev fremstillet ved optimale fortyndinger (se supplerende tabel S1) i FACS suppleret med Brilliant Stain Plus-buffer (BD; Franklin Lakes, NJ), og blev derefter tilsat til prøver i en blokerende opløsning. Efter farvning blev prøver vasket 2x med FACS-buffer og fikseret i 100 ul FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit-buffer (eBioscience; San Diego, CA). Prøver blev vasket to gange med 1X permeabiliseringsbuffer (1X PW) og derefter farvet i 1X PW plus intracellulære antistoffer. Prøver blev derefter vasket to gange i 1X PW og derefter fikseret i 100 µl FluoroFix-buffer (BioLegend: San Diego, CA), vasket to gange med FACS, derefter resuspenderet i 200 µl FACS og forseglet i 96-brønds pladerne til erhvervelse den følgende dag på en Cytek Aurora 5-lasercytometer.

Samtidigt farvede splenocytprøver blev anvendt til enkeltfarvningskontroller. Analyse og statistik. Longitudinelle profileringseksperimenter blev udført én gang hver for MC38- og NPK-C1-modeller. I alt n=10-25 mus pr. tidspunkt blev evalueret. Flowcytometridata blev analyseret i FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ), og højdimensionelle plugin-algoritmer UMAP og FlowSOM blev downloadet fra FlowJo Exchange. Op til 30k levende CD45 plus tumorinfiltrerende celler og op til 15k levende CD45 plus blod eller LN-afledte celler pr. prøve blev sammenkædet til højdimensionel analyse.

Al dimensionsreduktion og clustering blev udført i FlowJo. Statistiske analyser blev udført i GraphPad Prism v9.3.1. Pearson Correlation blev brugt til at generere korrelationskoefficienter, og uparrede Students T-test med Welchs korrektion blev brugt til at sammenligne klyngefrekvenser mellem grupper. Enkeltcelleanalysemetoder er tidligere beskrevet(10,11).

KLRG1-regulonet blev ekstraheret fra konsensus-metaVIPER KLRG1-regulonet fra Obradovic et al (11). For at beregne KLRG1 regulon-signaturen tilpassede vi en tilfældig skovregressionsmodel med regulon-gener som funktioner og KLRG1 som et mål, og beregnede derefter Gini-vigtighedsscorer af regulon-gener for at bestemme deres indvirkning på KLRG1-ekspression. KLRG1 regulon-scoren for hver celle blev givet ved den vægtede sum af ekspressionsmålinger af alle regulon-gener i cellen med vigtighedsscore som vægte.

For more information:1950477648nn@gmail.com