Clr-f-ekspression regulerer nyreimmun og metabolisk homeostase Ⅱ

Nyre tubulære og glomerulære læsioner hos Clr-f-defekte mus.

Den indledende undersøgelse afClr-f−/− nyresnit afslørede adskillige ændringer i nyrebarken. At vurderehistopatologiske læsioner, PAS-farvede nyresnitfra fire 12-ugers WT ogClr-f-/- mus blev vurderet på en blindet måde (fig.2EN). En variabel tilstedeværelse af proksimale og distale tubulære læsioner blev observeret iClr-f−/− nyrer, som inkluderede tubulær epitelcelleopfedning, nuklear forskydning og tab af børstekanter (fig.2EN; toppaneler). I sjældne tilfælde blev tubulær nekrose fundet i form af ophobning af luminal nekrotisk affald og fuldstændigt epiteltab i nogle af de undersøgte områder. DetClr-f−/− nyrer udstillede ogsåglomerulære patologier(Fig.2EN; bundpaneler), med områder med fokal fortykkelse af glomerulære tufs, minimal periglomerulær fibroblastproliferation forbundet med mild interstitiel fibrose og mere alvorlige læsioner med mesangiolyse, kapillære aneurismer, der udviklede sig til udtalt afbrydelse af glomeruli og en konstant tilstedeværelse af nekrotiserende celleaffald i kroppens rum. . Scoring af glomerulær patologi afslørede et betydeligt antalglomerulære læsioneri Clr-f-mangelfulde mus sammenlignet med WT-kuldkammerater (fig.2B). Elektronmikroskopi afslørede alvorlig podocytbeskadigelse, udslettelse af podocytfodprocessen og betydelig fortykkelse afglomerulær kældermembran (GBM) (fig.2C,D).

Klik for at cistanche herba for nyresygdom

For at vurdere, om nyreimmunoglobulinaflejringer var til stede, som er karakteristisk forbundet med de observerede patologier, farvede vi renale cortex-sektioner af WT- og Clr-f-/- nyrer for tilstedeværelsen af ​​IgA-, IgM- og IgG-antistoffer ved IF (fig. 2E ). Clr-f-/− nyrer viser tydelig dominerende IF-farvning af glomerulære IgA-aflejringer ledsaget af udtalte IgM-aflejringer og en mindre, men konsekvent tilstedeværelse af IgG-aflejringer. Ligeledes opdagede vi lignende mønstre af IgA, IgM og IgG tubulointerstitielle aflejringer i Clr-f-/- nyrer. Komplementprotein C3 blev også bredt påvist i Clr-f-/- nyrer, men ikke i WT-nyrer (fig. 2F).

Clr-f er påkrævet for korrekt nyrefunktion.

For at evaluere indvirkningen af ​​Clr-f−/− patologier på nyrefunktionen analyserede vi blod- og urinsammensætning fra 12-ugegamle Clr-f−/− han- og WT-kuldkammerater. Vi fandt en beskeden, men statistisk signifikant, stigning i urin-protein-til-kreatinin (UP/CR)-forholdet i Clr f -/− mus sammenlignet med WT-mus, med øget serumkreatinin, men lignende urinproteinniveauer sammenlignet med WT mus, såvel som lignende fraktioneret udskillelse af natrium (FENa) (fig. 2G). I betragtning af det rørformede udtryk af Clr-f vurderede vi, om Clr-f−/− museblodtryk i 12-ugegamle og 24-ugegamle Clr-f−/− mus var påvirket. Clr-f-/-mus udviste et marginalt, men ikke-statistisk signifikant fald i blodtrykket sammenlignet med WT-kuldkammerater (fig. 2H). Disse resultater viser, at normal nyrefiltrering ændres i fravær af Clr-f, men Clr-f viser ingen signifikante roller i renal elektrolythomeostase eller blodtryksregulering.

Clr‑f−/− nyretranskriptom viser en dysregulering i stofskiftet.

At undersøge de underliggende transkriptionsprocesser, der er ansvarlige for Clr-f−/−nyrepatofænotyper, udførte vi RNA-sekventering på nyrer fra 7-, 13- og 24-ugegamle WT- og Clr-f−/− mus. Differentielt udtrykte gener (DEG'er) i Clr-f-/-mus sammenlignet med WT-mus blev undersøgt ved funktionel berigelsesanalyse og transkriptionel patotypeanalyse (fig. 3A). Vi kortlagde interaktionsnetværk af berigede biologiske processer fra gensætberigelsesanalyse (GSEA) af DEG'er identificeret i hver alder (fig. 3B). Vores analyse viste en berigelse af cellecyklus-relaterede gener opreguleret i nyrerne fra 7-ugegamle Clr-f-/− mus. Efter 13 uger blev metaboliske processer, transport, celledød og reaktioner på toksiske stoffer beriget fra DEG'er med øget ekspression i Clr-f-/- nyrer, mens ikke-bevægelige ciliumsamling, DNA-transskription og processering blev beriget fra DEG'er med nedsat udtryk. Nyrerne fra 24-ugegamle Clr-f−/− mus udviste også en berigelse af metaboliske processer og transport mellem DEG'er med øget ekspression, såvel som processer, der regulererblodcirkulationmens celledød, immunitet og Transforming growth factor-beta (TGF) signalreguleringsprocesser blev beriget fra DEG'er med nedsat ekspression.

For at fange aldersassocierede processer, der ligger til grund for Clr-f-/- nyredfekter, analyserede vi gener, der tilhører fire dynamiske mønstre for differentiel ekspression: DEG'er, der stiger med alderen, falder med alderen eller forbigående stiger eller falder ved 13 ugers alderen. Funktionel berigelsesanalyse af biologiske processer, molekylære funktioner og definerede veje blandt disse grupper afslørede, at DEG'er med stigende ekspression fra 7 til 24 uger gamle i Clr-f-/- nyrer var overrepræsenteret i lipidmetaboliske veje, mens DEG'er relateret til celle- substratadhæsion faldt i ekspression fra 7 til 24 ugers alderen (fig. 3C). DEG'er med en forbigående stigning i ekspression ved 13 ugers alder var for det meste forbundet med mitokondriel respiration, mens DEG'er med et forbigående fald i ekspression blev kortlagt til cellecyklusveje. Inden for disse fire kategorier af dynamisk udtryk var tre sub-klynger, der repræsenterer differentielle udtryksmønstre, hvor størrelsen af ​​ændringen i udtryk mellem 7 og 13 uger enten var ens, højere eller lavere end graden af ​​ændring mellem 13 og 24 ugers alderen hhv. (fig. 3C). De berigede biologiske processer og molekylære funktioner fra hver sub-klynge af gener var stort set forskellige på tværs af de fire vigtigste dynamiske ekspressionsmønstre identificeret, men afspejlede overlappende eller relaterede cellulære processer inden for hver gruppe. Samlet set afslører transkriptionsprofilen af ​​Clr-f-/- nyrer en dynamisk og udviklende dysregulering af cellulær metabolisme, funktion og homeostase.

Clr‑f−/− mus ophober fedt.

Den identificerede aldersassocierede stigning i DEG'er relateret til lipidmetabolisme førte os til at undersøge ekspressionsdata for WT- og Clr-f-/- mus for kendte lipidassocierede gener. De fleste af disse gentranskripter var forhøjet i Clr-f-/- mus (fig. 4A) og afstemt med stigninger i abdominale og perirenale fedtaflejringer i Clr-f-/- mus ved 24 ugers alderen (fig. 4B). Selvom Clr-f−/− og WT mus udviste lignende kropsvægte (fig. 4C), var vægten af ​​abdominal fedt i Clr-f−/− mus signifikant højere, hvilket indikerer, at fedtvæv tegnede sig for en øget andel af Clr-f −/− musens kropsvægt (fig. 4D). Vi påviste også ektopisk lipidakkumulering i nyrerne af Clr-f-/- mus, som det fremgår af øget ORO-farvning af Clr f-/- musenyrer (fig. 4E). Da perirenalt fedt og tilstedeværelsen af ​​interstitielt fedt i nyrerne er forbundet med metaboliske risikofaktorer for CKD21, antog vi, om Clr-f er beskyttende modætiologier ved diabetesellerrelaterede stofskiftesygdommeforbundet medCKD.

Clr‑f−/− musenyrer har transkriptionelle profilligheder og forskelle med human nyresygdom.

Ektopisk lipidakkumulering i nyrerne er forbundet med betændelse, fibrose, mitokondriel dysfunktion og celledød22,23. For at vurdere, om Clr-f−/− nyrer ligner definerede nyresygdomme, sammenlignede vi transkriptionsprofilen af ​​Clr-f−/− nyrer med offentliggjorte ekspressionsprofiler af nyrevæv og/eller blod framenneskelige donorer med CKD, diabetisk nefropati(DN), lupus nefritis (LN), ellerIgA nefropati(IgAN) (fig. 5A). Clr-f-/- nyre transkriptionelle profiler klynget med blod fra IgAN-patienter og glomerulært væv fra DN-patienter (fig. 5B). Sammenligning af Clr-f−/− og IgAN patientekspressionsprofiler ved funktionel berigelsesanalyse viste parallelle stigninger i genekspression relateret til cellulære reaktive oxidresponser, celledød, proteolyse og amidmetabolisme, såvel som fælles fald i genekspression forbundet med membran menneskehandelsprocesser, organisering af cytoskelet, PI3K-AKT-signalering, cellecykling og DNA/RNA-metabolisme (fig. 5C). Omvendt adskilte Clr-f-/− nyreekspressionssæt sig fra IgAN med øget ekspression af gener tilhørende AGE-RAGE, ErbB, TNF/MAPK og Rap1 signalveje og processer med vasopressinreguleret vandreabsorption og lysosomaktivitet, og nedsat ekspression af gener tilhørte adherens junction, ikke-motil cilium-samling, cellecykling, DNA-metabolisme og TGF-signalering. Disse resultater tyder på, at i lighed med IgAN er cellulære processer med vækstkontrol, homeostase og reparation også dysregulerede i Clr-f-/- nyrer, mens metabolisme, stress-signalering ogepitelstrukturog funktion er unikke for Clr-f−/− nyrer.

Clr-f-defekte nyrer udviser inflammation og immuncelleinfiltration.

I betragtning af de kendte immunmodulerende roller for Clr-proteiner undersøgte vi immuncellens bidrag tilClr-f−/− nyrepatologi. Vi analyserede immuncellesammensætningen af ​​12-ugegamle WT- og Clr-f−/− musehele nyrer ved flowcytometri. Vores analyse afslørede en signifikant stigning i antallet af neutrofiler, T-celler og B-celler, men ingen forskel i nyre-NK-celle-, ILC- eller makrofagtal (fig. 6A). Analyse af den periglomerulære fordeling af immunceller i nyrebarken af ​​WT- og Clr-f-/- nyrer ved IF, vi observerede glomerulære akkumuleringer af CD45+-celler (fig. 6B). Mærkning af CD11c, F4/80, NKp46 og CD3, markører, der indikerer henholdsvis DC'er, makrofager, NK/ILC'er og T-celler, afslørede en intraglomerulær akkumulering af CD11c+-celler (fig. 6C) og periglomerulære akkumuleringer af F4/{{ 16}}, NKp46+ og CD3+ celler i Clr-f−/− nyrer (fig. 6D). Visuel kvantificering af immuncellepopulationer påvist ved glomeruli bekræftede en signifikant stigning i tilstedeværelsen af ​​hver af disse immuncellepopulationer i nyrer af Clr-f-/- mus sammenlignet med WT-mus (fig. 6E). Immuninfiltrat i autoimmun nyresygdom forstærkes af den tubulære sekretion af IL-12, der forårsager skade af IFN-udskillende celler24-26. Vi undersøgte derfor WT og Clr-f−/− nyrer for tilstedeværelsen af ​​disse cytokiner og observerede farvning af både IL-12 og IFN i celler i Clr-f−/− nyretubulointerstitium (fig. 6F, G).

Da Clr-f antages at være et signal om cellesundhed til NKR-P1G-udtrykkende celler, antog vi, at den renale immuninfiltration i Clr-f-/− mus delvist skyldes en øget tilstedeværelse af NKR-P1G-udtrykkende lymfocytter i nyren. Analyse af NKR-P1G-ekspression på nyre-TCR+T-celler og NK1.1+ NK-celler i WT- og Clrf-/−-mus ved flowcytometri viste ingen forskel i den gennemsnitlige fluorescensintensitet af NKR-P1G-farvning på nyre-NK celler, men en stigning i NKR-P1G-farvning af renale T-celler i Clr-f−/− mus (fig. 6H)

Figur 5. Sammenligning mellem transkriptionelle profiler af Clr-f−/− mus og humane CKD'er. (A) Tabel over genekspressionsprofildatasæt af 15 humane nyresygdomme vs. 13-ugegamle Clr-f-/- mus. Referencekilden for datasætkilderne til den humane ekspressionsprofil er angivet med kolonnen Undersøgelse. (B) Lighedsmatrix, der viser hierarkisk klyngning af differentielle genekspressionsprofiler i panel (A). Den røde stiplede linje i dendrogrammet angiver niveauet af matrixklyngeseparation. (C) Sammenligning af 4531 DEG (Log2 FC; Padj.<0.05) of 13-week-old Clr-f−/− mice (group 0) and IgAN patients. Gene set enrichment from 4 DEG clusters: (I) upregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients, (II) upregulated in Clr-f−/− mice and downregulated IgAN patients, (III) downregulated in Clr-f−/− mice, and upregulated IgAN patients, and (IV) downregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients. Heat maps were constructed using Morpheus (https://sofware.broadinstitute. org/morpheus).

Clr-f-mangel resulterer i T- og B-uafhængig autoimmunitet og patogenese. For at afklare immunbidraget til nyrepatologien hos Clr-f−/− mus, undersøgte vi Clr-f−/− mus, der også var mangelfulde i T- og B-celler ved at bruge den Rag1-deficiente musestamme (Rag1−/−Clr-f−/−). Da Rag1-/-Clr-f-/- mus mangler antistoffer, kunne vi evaluere Clr-f-associeret patogenese i fravær af immunoglobulinaflejring. Analyse af Rag1-/-Clr-f-/- nyrerne afslørede glomerulære læsioner, der indikerer mild proliferativ glomerulopati og områder med glomerulær fibrose (fig. 7A). Glomerulær patologiscoring viste et signifikant højere antal glomeruli med læsioner i Rag1-/-Clr-f-/- sammenlignet med Rag1-/- mus (fig. 7B). Scoring af Rag1-/-Clr-f-/- nyresektioner identificerede stigninger i endocapillær proliferation, halvmåner, glomerulosklerose eller fokal segmental sklerose og interstitiel fibrose og tubulær atrofi, med en signifikant stigning i tilstedeværelsen af ​​mesangial cellularitet (fig. 7C) .

For at vurdere T- og B-cellers bidrag til lipidakkumuleringen observeret i Clr-f-/-mus målte vi total kropsvægt og abdominal fedtvægt i Rag1-/-Clr-f-/- i forhold til Rag1-/- mus. Te Rag1−/−Clr-f−/− kropsvægt var signifikant lavere end Rag1−/− kontroller (fig. 7D), mens abdominal lipidvægt var signifikant øget (fig. 7E), dog i mindre grad end det, der blev observeret i Clr-f-/− mus sammenlignet med WT-mus (174 mg fedt stegt mod 274 mg i gennemsnit).

Til sidst, for at undersøge de immune, der bidrager til disse nyredefekter, undersøgte vi Rag1−/−Clr-f−/− nyrer for tilstedeværelsen af ​​IL-12 og IFN og nyreinfiltrerende immunceller. IF-analyse af Rag1-/-Clr-f-/- nyrer afslørede en øget tilstedeværelse af IL-12 og IFN (fig. 7F,G). Vi observerede også en omfattende periglomerulær ophobning af CD45+-celler i Rag1−/−Clr-f−/− nyrer (fig. 7H), som viste sig at bestå af CD11c+, F4/80+ og Nkp46+ celler. Disse resultater tyder på, at T- og B-celle-uafhængige mekanismer er de primære mediatorer af nyrepatologi hos mus, der mangler Clr-f.

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportør i Kina:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Shop for flere specifikationer detaljer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIG ORGANISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 25% ECHINACOSID OG 9% ACTEOSIDE TIL NYREINFEKTION