Cistanoside of Cistanche Herba lindrer hypoxi-induceret mandlig reproduktionsskade via undertrykkelse af oxidativ stress-Ⅰ

Introduktion

I øjeblikket er cirka 48,5 millioner (15 %) par i den fødedygtige alder på verdensplan påvirket af infertilitet, blandt hvilke 40-50 % af tilfældene tilskrives mandlig infertilitet, en tilstand, der er stærkt forbundet med miljø- og livsstilsfaktorer. Beviser tyder på, at pattedyrstestiklens modtagelighed for lavt ilttryk er en årsagsfaktor i nogle former for mandlig infertilitet. Som vist i tidligere undersøgelser, er spermatogenese svækket og reduceret ved eksponering for hypobar hypoxi.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

For at udforske den underliggende mekanisme har undersøgelser vist, at eksponering for hypobar hypoxi øger produktionen af ​​reaktive oxygenarter (ROS). ROS spiller en vigtig rolle i det mandlige reproduktive system. Ved lave niveauer er de nødvendige for spermkapacitet, akrosomreaktionen og spermatozo-oocytfusion [10]. Imidlertid kan overdreven ROS inducere kerne-/mitokondriel DNA-skade på sædceller og peroxidativ skade på plasmamembranen, som igen er vigtige ætiologiske faktorer forøget risiko for mandlig infertilitet. Således kan akkumulering af hypoxi-induceret ROS være en årsag til mandlig infertilitet.

Cistanches Herba, en flerårig parasitisk lægeplante, er vidt udbredt i tørre områder og anvendes bredt på grund af dens farmakologiske aktiviteter. Blandt alle de effektive indhold afCistanches HerbaPhG'er er blevet betragtet som den vigtigste aktive komponent. Til dato er 34 PhG'er blevet isoleret fraCistanches planter. Cistanoside(Cis), en aktiv PhG isoleret fraCistanches Herba, har fået opmærksomhed for sine antioxidante virkninger.

I betragtning af de antioxidante virkninger af Cis og rollen af ​​ROS i hypoxi-induceret mandlig infertilitet, betragtes Cis som en potentiel lægemiddelkandidat til behandling afhypoxi-induceret mandlig infertilitet. Imidlertid har få rapporter behandlet antioxidantvirkningerne af Cis ekstraheret fra Cistanches Herba i behandlingen af ​​hypoxi-induceret mandlig infertilitet eller de involverede signalveje. I denne undersøgelse blev in vitro og in vivo hypoxi eksperimentelle modeller konstrueret, og effektkomponenterne af forskellige Cis blev vurderet.

Materialer og metoder

Cellekultur og reagens

Musespermatogonia-cellelinjen GC-1spg (GC-1) blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i DMEM (Invitrogen, USA) suppleret med 10 % føtalt bovint serum, 1 % L-glutamin (100 mM), penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 ug/ml) ved 37 grader i en fugtig inkubator med 5% CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) blev købt fra Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Kina).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cellelevedygtighedsanalyse

Cellelevedygtighed blev testet ved celletællingskit{{0}}-assay (CCK-8). Kort fortalt blev GC-1-celler podet i 96-brøndsplader ved 1,5×103 pr. brønd og dyrket ved 37 grader i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer (20%, 15%, 10%, 5%) ilt eller forskellige koncentrationer (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) af Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) i den nødvendige tid. Derefter blev supernatanten kasseret, og cellelevedygtighed blev påvist ved anvendelse af et CCK-8-kit (Dojindo Japan). Absorbansen af ​​hver brønd blev målt ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser (BioRad USA). Til sidst blev cellelevedygtighederne beregnet i henhold til følgende formel: Cellelevedygtighed=(ODeksperimentel gruppe - ODblank gruppe)/ (ODkontrolgruppe - ODblank gruppe) × 100%.

Western blot analyse

Høstede celler eller væv blev homogeniseret i RIPA-buffer for at ekstrahere proteiner (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). Supernatanter blev opsamlet, og koncentrationen af ​​proteiner blev testet ved BCA-metoden (Beyotime). Ca. 40 ug af de ekstraherede proteiner fra hver prøve blev separeret ved SDS-PAGE og elektrooverført til en nitrocellulose (NC) filtermembran (Beyotime China). NC-filtermembraner blev blokeret med 5 % fedtfri mælk i 1,5 time og inkuberet med specifikke antistoffer (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000 alle antistoffer blev købt fra Cell Signaling Technology, USA) natten over ved 4 grader. Derefter blev alle NC-membraner inkuberet med det tilsvarende peberrodsperoxidase-konjugerede sekundære antistof i 1,5 time ved stuetemperatur og afbildet med et billeddannelsessystem (Tannon, Kina).

Cellecyklusdetektion

Et flowcytometrisk assay (FCM) blev udført for at analysere cellecyklussen. Celler blev behandlet under forskellige betingelser i 72 timer og høstet. Cellerne blev derefter vasket med PBS, fikseret i 75% ethanol og farvet med propidiumiodid (PI). For hver prøve blev 1 × 104 celler opsamlet og analyseret ved flowcytometri (FACS Calibur, BD Biosciences). Derefter blev andelen af ​​G1/S/G2-faseceller og proliferationsindekset [Fase(S+G2)/Fase(G1+S+G2) × 100%] beregnet.

Ki-67-farvning

Celler blev dyrket i en konfokal skål og behandlet med hypoxi eller forskellige undertyper af Cis i 72 timer. Efter fiksering af alle celler med 4 % paraformaldehyd, blev de inkuberet med et anti-Ki-67 antistof (1:200, Cell Signaling Technology). Derefter blev alle cellerne inkuberet med et tilsvarende CY-3--konjugeret anti-kanin IgG-antistof (1:200, Boster, Kina) og DAPI-opløsning (1,0 ug/ml, Beyotime). Fluorescens blev observeret med et Fluoview FV1000 konfokalmikroskop (Olympus, Japan).

TOP-TIER CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT TIL FORØDELSE AF TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Påvisning af ROS

FCM blev introduceret til at måle intracellulære ROS-niveauer ved hjælp af DCFH-DA. Suspenderede celler blev podet i 6-brøndplader og udsat for forskellige behandlinger. Efter 72 timers behandling blev celler suspenderet i serumfrit DMEM med 10 μM DCFH-DA (Beyotime). ROS-indhold blev derefter bestemt ved fluorescensaktiveret cellesortering på et Beckman Coulter Flow Cytometri System med en excitationsbølgelængde på 488 nm og emissionsbølgelængde på 525 nm [18].

Bestemmelse af lipidperoxidation (LPO)

Thiobarbitursyre-reaktive stoffer (TBARS) assayet blev udført for at påvise LPO. Alle operationstrin blev udført i henhold til instruktionerne (Sigma USA). Koncentrationerne blev beregnet under anvendelse af en molær ekstinktionskoefficient på 1,56×105/(M·cm), som blev opnået ved at anvende malondialdehyd som standard. Resultaterne er udtrykt som nmol MDA-ækvivalenter/mg protein.

Bestemmelse af enzymaktiviteter

Enzymaktiviteterne blev testet under anvendelse af assaysæt, herunder glutathionreduktase (GR), glutathionperoxidase (GPx) og superoxiddismutase (SOD). Alle operationstrin blev udført i henhold til de medfølgende instruktioner (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute Kina).

Dyr og forsøgsprotokol

Modne Wistar-hanrotter (180-220 g, 8 w gamle) blev hentet fra dyrecentret på det fjerde militærmedicinske universitet, Xi'an, Kina. Tilladelse til brug af dyrene er indhentet fra Universitetets Etiske Komité (Referencenummer: 20190506). Dyreforsøget er udført efter universitetets retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr.

Alle rotter fik lov til at tilpasse sig i ca. 1 uge før påbegyndelsen af ​​eksperimentet. Efter akklimatisering blev rotterne tilfældigt fordelt i 6 grupper med 5 dyr i hver gruppe. Rotterne i kontrolgruppen blev opdrættet under normalt tryk (PO2: 20%; lufttryk: 101,3 kPa), mens rotterne i modellen og Cis-behandlede grupper blev opdrættet i et lavtryks iltkammer (indre tryk på 61,6 kPa , svarende til en højde på 4000 meter over havets overflade: 14,55 %) for at simulere et hypoxisk miljø i stor højde. Alle rotter havde fri adgang til mad og vand i plastikbure ved 22 ± 2 grader og fugtighedsforhold med en automatisk 12-t lys/mørke-cyklus. Rotterne i modellen og de Cis-behandlede grupper forblev under hypobariske forhold, men blev overført til normobariske forhold hver 96. time, på hvilket tidspunkt mad og vand blev givet dem og burene renset. Varigheden af ​​overgangen fra hypobar til hypobar var cirka 2 timer. Alle behandlingsgrupper blev behandlet med det tilsvarende Cis (8 mg/kg/d) via oral sondeernæring i 8 uger, hvorimod kontrol- og modelrotterne blev behandlet med et lige så stort volumen vand.

Efter 8 uger blev rotter aflivet under anæstesi. Testikler, epididymis og sædblærer blev separeret og vejet, og organindekset blev beregnet efter følgende formel: (vægt af organ/dyrevægt) × 100%. Efterfølgende blev sædceller i epididymis opsamlet, og deres motilitet og akrosomenzymaktivitet blev testet. Tilsvarende blev testikelvæv indsamlet til histopatologiske undersøgelser og påvisning af ROS, LPO og antioxidant enzymaktivitet.

CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT CISTANCHE URT ØG KØNSKRAFT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Evaluering af antallet af levende sædceller

Epididymis blev skåret ind med kirurgisk saks, og sædsuspensionen blev fremstillet i normalt saltvand. For at evaluere den levende sædhastighed blev 5 μL af sædsuspensionen omhyggeligt blandet med et lige så stort volumen eosin-Y-farve. Sædcellerne blev derefter talt under et lysmikroskop. Antallet af levende sædceller blev vurderet ved at beregne både farvet (død sæd) og ufarvet sæd (levende sæd).

Bestemmelse af spermakrosomenzymaktivitet

Spermakrosomenzymaktivitetsanalysen blev brugt til at evaluere spermakrosomenzymer [19]. Resultaterne i hver gruppe blev beregnet ved hjælp af følgende formel: Akrosomenzymaktivitet (μIU)=(ODEeksperimentgruppe - ODBlank gruppe)/(247,5×10) × 106.

Resultater

Effekter af hypoxi på GC-1 celler

For at bestemme virkningerne af hypoxi på kønsceller undersøgte vi først ændringerne i cellelevedygtighed efter hypoxibehandling med forskellige oxygenkoncentrationer (20%, 15%, 10% og 5%) for 1, 3, 5 henholdsvis 7 dage. CCK-8-assayresultaterne viste, at sammenlignet med kontrolgruppen (20 % oxygenkoncentration) udviste celler udsat for hypoxi et signifikant fald i levedygtighed (P < 0,01; figur 1A). Desuden var deres overlevelsesrate omvendt proportional med oxygenkoncentrationen og faldt yderligere med induktionstiden. For at undgå en overdreven cytotoksisk effekt blev en 10 % oxygenkoncentration og 3-dag induktionstid valgt som hypoksisk modelkriterier for efterfølgende in vitro-eksperimenter.

Efterfølgende blev FCM- og immunfluorescensfarvning udført for yderligere at evaluere proliferationsændringen af ​​GC{{0}}-celler under hypoxibehandling. Resultaterne viste, at hypoxi kunne inducere GC-1-cellestop i G1-fasen og derved reducere celleindtrængen i S-fasen og inhibere DNA-replikation. Således reducerede hypoxi signifikant proliferationsindekset for GC-1-celler (P < 0,01; figur 1B). Positiv Ki-67-farvning er en anden specifik biomarkør for prolifererende celler. Derfor undersøgte vi også forholdet mellem Ki-67-positive celler med eller uden hypoxibehandling. Sammenlignet med kontrolgruppen reducerede hypoxibehandling bemærkelsesværdigt Ki-67--positive celler, som vist i figur 1C.

Dernæst havde vi til formål at undersøge tilstanden for GC{{0}}-cellelevedygtighedshæmning induceret af hypoxi. Som rapporteret i litteraturen steg niveauet af ROS, da rotter blev udsat for et hypobarisk hypoxisk miljø [8, 20]. Derfor blev endogene ROS-niveauer i GC-1-celler målt ved hjælp af FCM-assayet. Resultaterne viste højere ROS-niveauer under hypoxi sammenlignet med den normale oxygengruppe (P < 0,01; figur 1D). Akkumuleret ROS forårsager markant DNA svækkelse, som igen forårsager celle apoptose pathway aktivering og kan være den vigtigste ætiologiske faktor for den stigende risiko for mandlig infertilitet [21, 22]. Dernæst opdagede vi den apoptotiske aktiveringseffekt af hypoxi på GC-1-celler ved TUNEL-farvning. Som vist i figur 1E resulterede behandling med hypoxi i en stigning i TUNEL-fluorescens sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket indikerer en stigning i apoptose i modelgruppen.

Da ROS-induceret celleskade normalt er forårsaget af OS, testede vi yderligere OS for GC-1 celler. Som vist i figur 1F var LPO-niveauerne af GC-1-celler i modelgruppen markant øget sammenlignet med LPO-niveauerne af GC-1-celler i kontrolgruppen. Disse resultater tydede på, at hypoxi-induceret GC-1-celleskade kan være relateret til OS, som er induceret af ROS-akkumulering.