Cistanoside of Cistanche Herba lindrer hypoxi-induceret mandlig reproduktionsskade via undertrykkelse af oxidativ stress-Ⅱ

Virkninger af Cis på hypoxi-induceret GC-1 cellelevedygtighed in vitro.

For at undersøge, om Cis kan forhindre de hæmmende virkninger af hypoxi på GC{0}} cellelevedygtighed, blev der udført et CCK-8 assay. GC-1-celler blev behandlet med forskellige undertyper (Cis-A, B, C, H) og koncentrationsområder (0.02 μM, 0.2 μM, 2 μM) Cis i 72 timer. En sammenligning af modelgruppen med DMSO-gruppen viste, at DMSO ikke direkte fremmede GC{{10}}-cellelevedygtighed (figur 2A). Cellelevedygtighed blev dog markant genoprettet (P < 0.05) med Cis-behandlinger. Sammenlignet med modelgruppen viste Cis-A, Cis-B, Cis-C og Cis-H alle visse beskyttende virkninger på hypoxi-induceret skade på GC-1 cellelevedygtighed, og Cis-B viste den mest signifikante effekt (figur 2A). De beskyttende virkninger af Cis ved 0.2 μM var signifikant højere end de beskyttende virkninger af Cis ved 0.02 μM, mens forskellen mellem 2 μM og 0,2 μM ikke var tydelig, hvilket indikerer, at den restaurerede GC-1-cellelevedygtighed induceret af Cis viste en dosisafhængig stigning i koncentrationsområdet fra 0.02-0.2 μM (figur 2A). Derfor, i henhold til de eksperimentelle behov, blev 0,2 μM Cis valgt som den optimale koncentration i de følgende in vitro eksperimenter. For yderligere at bekræfte, om kønsceller faktisk var beskyttet af Cis, blev FCM- og Ki-67-farvning udført for at vurdere ændringen af ​​proliferationen af ​​GC-1-celler efter behandling med Cis. Ved Cis-behandling blev andelen af ​​GC-1-celler i G1-fasen reduceret. I modsætning hertil gik flere celler ind i S-fasen, hvilket tyder på, at Cis-behandling kunne øge kønscelleproliferationsindekset (P < 0,01; figur 2B). Statistikken for GC-1-cellecyklussen er vist i figur 2Bb. Ki-67-farvningsresultaterne viste også, at behandling med Cis-A, Cis-B, Cis-C og Cis-H forbedrede det Ki-67-positive celleforhold af hypoxi-induceret GC signifikant{{54} } celler in vitro (figur 2C).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cis-mekanismen beskytter kønsceller mod hypoxi in vitro.

For at undersøge, om de beskyttende virkninger af Cis på GC-1-celler var relateret til fjernelse af overdreven ROS, blev det fluorescerende farvestof DCFH-DA brugt til at påvise ROS-niveauer i hver gruppe. Som vist i figur 3A og 3B ændrede behandling med DMSO ikke det intracellulære ROS-indhold eller LPO-niveau sammenlignet med modelgruppen. Imidlertid blev ROS-niveauer i GC-1-celler markant reduceret i de Cis-behandlede grupper (figur 3A). Ydermere blev et fald i LPO også observeret i GC-1-celler udsat for Cis (figur 3B).

For yderligere at udforske mekanismen, hvormed Cis beskytter kønsceller mod hypoxisk skade, blev TUNEL-farvning og Western blot-analyser udført for at evaluere apoptose. TUNEL-farvning (figur 3C) viste signifikant apoptose i model- og DMSO-grupperne. Der blev dog observeret færre apoptotiske celler med Cis-behandling, hvilket indikerede, at Cis-behandling reducerede GC-1-celleapoptose. Derudover blev ekspressionen af ​​PARP, Caspase-3, Bax og Bcl-2 målt for at bekræfte den molekylære mekanisme. Som vist i figur 3D blev Caspase-3 og PARP aktiveret i GC-1-celler under hypoxi, og denne aktivering blev hæmmet af Cis-behandling. Derudover var forholdet mellem Bax/Bcl-2 højere i modelgruppen end i kontrolgruppen, og Cis-behandling reducerede forholdet mellem Bax/Bcl-2 (figur 3D). Disse data indikerede, at Cis havde en potentiel kapacitet til at dæmpe hypoxi-induceret oxidantbeskadigelse, og denne beskyttende effekt kan opnås ved at reducere ROS-akkumulering og hæmme aktivering af Caspaser-relateret apoptosevej.

Den enzymatiske mekanisme, der hæmmer OS, involverer frie radikaler, såsom glutathionreduktase (GR), glutathionperoxidase (GPx) og superoxiddismutase (SOD) [23]. Den enzymatiske mekanisme, der hæmmer OS, spiller en væsentlig rolle i at forhindre oxidativ skade i celler og væv [23]. For yderligere at validere den potentielle mekanisme for Cis-hæmning af hypoxi-induceret OS i GC-1-celler, blev aktiviteterne af GR, GPx og SOD målt. Resultaterne afslørede, at GR-, GPx- og SOD-aktiviteter alle signifikant (P < 0.01, figur 3E) faldt under hypoxi sammenlignet med kontrolgrupperne, og Cis-behandling genoprettede markant deres aktiviteter i GC-1-celler udsat for hypoxi (P < 0,05, figur 3E), hvilket tyder på, at disse forbindelser kunne aktivere det kraftige endogene antioxidantsystem.

CISTANCHE TUBULOSA TIL STIMULERING AF SÆDPRODUKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Virkninger af Cis på reproduktion hos hypobariske hypoxi-inducerede rotter.

For at bestemme virkningerne af hypobarisk hypoxi på hanrotter testede vi først morfologiske ændringer af testikler hos hypobarisk hypoxi-inducerede rotter. Resultaterne af HE-farvning viste, at i kontrolgruppen var normale spermatogene celler på forskellige stadier arrangeret på en velordnet måde fra basalmembranen til lumen, og moden sperm var synlig i tubuli lumen (figur 4A). Sammenlignet med kontrollerne blev patologiske ændringer af testikelvæv observeret i modelgruppen, basalmembranen af ​​testikelepitelceller var arrangeret løst, det spermatogene epitel var ekstremt tyndt, og niveauet og antallet af kønsceller var markant reduceret (Figur 4A) . Imidlertid forbedrede behandling med Cis markant histologien af ​​hypobarisk hypoxi-induceret testikelskade in vivo (figur 4A). Vi målte også kropsvægt, testikelvægt, epididymisvægt og sædblærerkirtelvægt, hvilket førte til, at reproduktionsorganindekset (forholdet mellem reproduktionsorgan og kropsvægt) blev beregnet. Som vist i figur 4B-D var reproduktionsorganindekset (testikler, epididymis og sædvesikelkirtel) markant lavere i modelgruppen (P < 0.01) end i kontrolgruppen. Imidlertid blev virkningen af ​​hypobar hypoxi på det reproduktive organindeks hos rotter vendt med Cis-behandling (figur 4B-D).

Dernæst blev akrosomenzymaktiviteten og frekvensen af ​​levende sæd af hanrottesæd også målt for at belyse testikelfunktionsskader. Som vist i figur 4E, 4F var akrosomenzymaktivitet og sædmotilitet lavere i modelgrupperotterne end i kontrolgruppen (P < 0.01). Sammenlignet med rotter i modelgruppen blev akrosomenzymaktivitet imidlertid genoprettet i rotter behandlet med 8 mg/kg/d Cis (P < 0,05) (figur 4D). Desuden, som vist i figur 4F, behandling med Cis ogsåøget antallet af levende sædceller; rotterne behandlet med 8 mg/kg/d Cis viste alle en signifikant øget frekvens af levende sæd (55,83 ± 6.03 %, P < 0.05; 69.{ {8}} ± 2,29 %, P < 0,01; 52,33 ± 3,40 %, P < 0,05 henholdsvis 53,67 ± 2,25 %, P < 0,05) sammenlignet med modelrotterne (43,83 %) .

Tilsammen antydede disse resultater, at det hypobariske hypoxiske miljø førte til testikelmorfologiske ændringer, reproduktionsorgans vægttab og testikelfunktionsskader hos hanrotter, og Cis effektivt kunne beskytte de reproduktive organer mod hypoxi-induceret skade.

Virkninger af Cis på OS i testiklerne hos hypobariske hypoxi-inducerede rotter.

ROS- og LPO-niveauerne i testiklerne hos rotter blev målt for at analysere virkningerne af Cis på hypobarisk hypoxi-induceret OS. ROS-analyse afslørede, at sammenlignet med kontrolgruppen var ROS-niveauer i testiklerne i modelgruppen signifikant øget (P < 0.01 Figur 5A). Omvendt var LPO dramatisk forhøjet i testiklerne (P < 0.01) under hypobarisk hypoxi sammenlignet med normoksiske tilstande (figur 5B). Cis-behandling ændrede imidlertid ovenstående ændringer (P < 0,05), hvor Cis-B udøvede bedre virkninger end andre Cis (figur 5A, 5B). Cis så ud til at beskytte testiklerne ved at reducere OS under hypobariske hypoxiske forhold in vivo.

Derudover blev apoptoseanalyser udført for yderligere at evaluere den mekanisme, hvormed Cis beskyttede mod hypobar hypoxi-induceret testikelfunktionsskade. Resultaterne af TUNEL-farvning (figur 5C) viste, at der fandtes signifikant apoptose i modelgruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Efter Cis-behandling (8 mg/kg/d) forekom der imidlertid færre apoptotiske celler (P < 0.05) (figur 5C). Western blot-dataene viste også, at hypoxi og hypobarisk behandling resulterede i aktivering af Caspase-3 og PARP og et øget Bax/Bcl-2-forhold i testikelvæv, hvilket indikerer en stigning i apoptose (figur 5D). Derudover forskellige typer afCis behandlingsignifikant reduceret apoptose i testikelvæv (figur 5D). Tilsvarende viste IHC-analysen af ​​testikelvæv lignende resultater (Supplerende figur 1).

For at verificere mekanismen for Cis-reduceret OS udløst af hypobar hypoxi testede vi yderligere aktiviteterne af GR, GPx og SOD i testikelvæv. Som vist i figur 5E, sammenlignet med kontrolgruppen, reducerede hypobarisk hypoxibehandling signifikant GR-, GPx- og SOD-aktiviteter (P < 0.01). Cis-behandling genoprettede imidlertid enzymaktiviteterne (GR, GPx og SOD) af testikelvæv hos rotter behandlet med hypobar hypoxi (P < 0,05). Som konklusion syntes Cis at beskytte testiklerne ved at aktivere en kraftfuld endogen antioxidant enzymforsvarsmekanisme under hypobariske hypoxiforhold.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskussion

I højtliggende områder er hypobarisk hypoxi kendt for at påvirke flere systemer hos mennesker, herunder det mandlige reproduktive system [4, 20]. Nylige eksperimentelle undersøgelser er rettet mod at forstå mekanismerne for, hvordan hypobarisk hypoxi forringer det mandlige reproduktive system. I denne undersøgelse blev den terapeutiske effekt af Cis-ekstrakt fra Cistanches Herba på hypoxi-induceret reproduktionsskade undersøgt. Resultaterne viste, at Cis kan beskytte det mandlige reproduktionssystem mod hypoxisk skade ved at reducere hypoxi-induceret ROS-akkumulering og OS ved at øge aktiviteten af ​​endogene antioxidantenzymer.

ROS er oxygen-afledte frie radikaler, der spiller en afgørende rolle i menneskets fysiologi og patologi. Lave doser af ROS er afgørende forspermkapacitet, akrosomreaktionen og spermatozo-oocytfusion [24, 25]. Imidlertid fører overdreven ophobning af ROS ofte til skade på kønsceller og stromaceller, hvilket resulterer i mandlig infertilitet [26]. ROS kan nemt beskadige cellemembraner, nukleinsyrer, proteiner, enzymer og andre biologiske makromolekyler gennem peroxidation. Desuden fører de også til potentiel cellulær og DNA-skade, når de overstiger antioxidant-bæreevnen. Akkumuleret evidens understøtter den centrale rolle af ROS i patogenesen af ​​mandlig fertilitet [27, 28]. Produktionen af ​​ROS reguleres af iltspænding. Under hypoxiske forhold falder den tilgængelige ilt i miljøet, og blodets viskositet stiger, hvilket påvirker mange iltafhængige metaboliske processer i organismen [29, 30]. Men det lavere atmosfæriske tryk i store højder forårsager dårligt venøst ​​tilbagevenden og et fald i mængden af ​​ilt, der transporteres af blodbanen til alle organismens celler, hvilket yderligere øger hypoxien i organer og celler [29, 30]. Eksponering for stor højde giver således anledning til en række hypoxiske fysiologiske reaktioner, herunder produktion og akkumulering af ROS, når iltbehovet overstiger den vaskulære forsyning. Som tidligere nævnt fører akkumuleringen af ​​ROS til en række intracellulære effekter, hvoraf den mest kritiske er at forårsage OS i celler.

OS refererer til en ubalance mellem oxidations- og reduktionsreaktioner, hvilket fører til generering af overskydende oxidanter eller molekyler, der accepterer en elektron fra en anden reaktant, som igen producerer ROS [31, 32]. OS er velkendt for at kunne udløses af en række endogene og eksogene faktorer, herunder eksponering for stor højde. Spermatozoer er celler, der er særligt modtagelige for OS på grund af deres utilstrækkelige cellereparationssystemer og høje plasmamembranindhold af flerumættede fedtsyrer [33]. Testikel- og epididymalvæv er ingen undtagelse, da tilstedeværelsen af ​​alvorlig OS er blevet observeret i runde spermatider hos rotter udsat for hypoxi [4]. OS påvirker stabiliteten af ​​DNA og bringer derved integriteten af ​​gametens genetiske materiale [34-36] i fare. Imidlertid er et højt niveau af DNA-beskadigelse i mandlige kønsceller blevet bekræftet at føre til aktivering af apoptosesignalering, hvilket resulterer i en reduktion af epididymal spermantal og en stigning i procentdelen af ​​defekte celler [28, 37]. I denne undersøgelse reducerede hypoxi signifikant levedygtigheden af ​​GC-1-celler gennem induktion af apoptose og cellecyklusstandsning. Endnu vigtigere, signifikant øgede ROS-niveauer blev vist ved FCM-analyse efter hypoxistimulering, med en øget apoptoserate og højere aktivering af Caspase-3, PARP og Bax/Bcl-2-forhold, hvilket indikerer, at ROS kunne aktiveres apoptose ved at aktivere Caspase-signalvejen under hypoxi-induceret fertilitetsskade. De nuværende resultater viste, at hypoxi førte til overdreven ROS-akkumulering, hvilket forårsagede oxidativ skade på reproduktive celler. Det er således meningsfuldt at identificere nye antioxidanter, der kan tjene som en effektiv tilgang til at lindre hypoxi-induceret fertilitetsskade.

For at beskytte mod OS findes der et komplekst antioxidantsystem i kroppen, hovedsageligt sammensat af enzymatiske faktorer. Under fysiologiske forhold opretholder ROS-indholdet og antioxidantsystemet en vis balance. Imidlertid udtømmer ROS-overproduktion spermantioxidantsystemet, hvilket fører til OS, som forårsager sperm-DNA-skader og resulterer i lavere fertilitets- og graviditetsrater [23]. For at imødegå ROS-overproduktion og relaterede skadelige virkninger på cellulært niveau i det mandlige reproduktionssystem er forskellige antioxidantstrategier blevet testet [23]. I øjeblikket er litteraturen vedrørende brugen af ​​forbindelser med antioxidantaktivitet ogforbedring af sædfunktionener omfattende. Det er vigtigt, at de fleste rapporter beskriver en forbedring af sædparametre efter oral antioxidantindtagelse, bl.a.forbedring af sædkoncentrationenog motilitet eller et fald i DNA-skader [38]. Således ordinerer et stigende antal urologer orale antioxidanter mod infertilitet på grund af OS-relaterede problemer [39]. Disse antioxidanter omfatter hovedsageligt carnitiner, vitaminer, zink, melatonin og naturlige forbindelser [23, 40]. I øjeblikket, med udviklingen af ​​lægemiddelekstraktionsteknologi, overvejes et stigende antal TCM-ekstrakter også for at afbøde mandlig infertilitet, fordi disse antioxidanter kan reducere de destruktive virkninger af OS [41]. Yüce A. et al. rapporterede i 2013, at kanel har gavnlige effekter på den oxidative og antioxidante balance i testikler og sædkvalitet [42]. Zhang L et al. viste, at curcumin signifikant forbedrer sædmotiliteten hos patienter og reducerer H2O2 [43]. Derudover har en række andre planteekstrakter såsom blåbær, crocus sativus, granatæblekerner og grøn te også vist sig at beskytte det reproduktive system via antioxidantmekanismer [27, 44-47]. Cistanches Herba er en vigtig TCM, der besidder en gunstig sikkerhedsprofil og brede medicinske funktioner til behandling af blandt andet infertilitet [13]. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at Cistanches Herba besidder forskellige aktiviteter, såsom antioxidative, anti-inflammatoriske, hepatobeskyttende og anti-neurodegenerative sygdomsaktiviteter [13, 48]. Derfor kan ekstrakter, fraktioner eller forbindelser fra Cistanches Herba have potentielle antioxidantegenskaber til behandling af infertilitet.

De aktive stoffer i planter, der forbedrer fertiliteten, omfatter forskellige kemiske grupper såsom PhG'er, saponiner, iltede flygtige forbindelser og alkaloider [41]. Farmakologiske aktivitetsstudier af PhG'er har vist, at PhG'er udviser en bred vifte af bioaktiviteter, såsom antioxidation, antistrålingsneurobeskyttelse og seksuel funktionsforbedring [49, 50]. Blandt disse aktiviteter tiltrækker antioxidation sig gradvist opmærksomhed. Nogle enkelte komponenter eller fraktioner af PhG'er er blevet rapporteret at hæmme kønscelleapoptose induceret af forskellige kemikalier, og deres antioxidationsevne in vitro er også blevet demonstreret in vivo i flere dyremodeller [51, 52]. Disse resultater indikerer, at PhG'er kunne være en attraktiv kandidat tilbehandling af mandlig infertilitet. Cis er en aktiv PhG, der kan isoleres fra Cistanches Herba. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningerne af Cis på hypoxi-behandlede celler eller en rottemodel og undersøgte de underliggende molekylære mekanismer. Cis udviste beskyttende aktiviteter på fald i hypoxi-induceret levedygtighed og stigninger i apoptose i GC-1-celler, og det viste også en beskyttende effekt på hypoxi-induceret skade i det reproduktive system hos rotter in vivo. Et signifikant fald i GR-, GPx- og SOD-aktiviteter under hypoxi sammenlignet med normoksiske grupper blev observeret, mens de specifikke aktiviteter af GR, GPx og SOD steg signifikant i testikler eller GC-1-celler behandlet med Cis. Cis så ud til at beskytte testiklerne og GC-1-cellerne under hypoxiske forhold ved at øge aktiviteten af ​​antioxidantenzymer.

Enzym antioxidanter fungerer hovedsageligt ved at fjerne superoxidanioner og forhindrer dermed lipidperoxidation og DNA-skader for at forhindre infertilitet. Enzymatiske antioxidantmekanismer spiller en afgørende rolle i forebyggelsen af ​​oxidativ skade [23]. Den enzymatiske mekanisme mod OS omfatter frie radikaler og glutathionafhængige enzymer, herunder GR, GPx og SOD [12]. Antioxidantenzymer er velkendt som essentielle for det mandlige reproduktionssystem. I den aktuelle undersøgelse blev effekten af ​​reducerede antioxidantenzymaktiviteter under hypobar hypoxi ledsaget af øget ROS og LPO i modelgruppen, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter [12]. Cis-administration førte imidlertid til en genopretning af antioxidantenzymaktiviteter i GC-1-celler og testiklerne hos rotter, hvilket gjorde det muligt at generere strategier til administration af Cistanches Herba for at forhindre hypobarisk hypoxi-induceret skade, som tidligere foreslået. Selvom de nuværende resultater viste, at behandling med Cis delvist reducerede hypoxi-induceret kimcelleskade hos rotter, er der behov for yderligere undersøgelser for at optrevle det fulde billede af dets reproduktive beskyttende virkninger. For eksempel påvirker den specifikke mekanisme af Cis aktiviteten af ​​antioxidantenzymer. Derudover er der et spørgsmål om, hvorvidt andre mekanismer også kunne være relevante, da Cis kun delvist kom sig over de reproduktive skader forårsaget af hypoxi. Endelig skal det også overvejes om Cis har en direkte vækstfremmende effekt på kønsceller.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL VEDLIGEHOLDELSE AF SÆD-AKTIVITET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Konklusioner

Generelt understreger resultaterne af denne undersøgelse potentialet af Cis som en antioxidant til behandling af hypoxi-induceret mandlig reproduktionsskade. Cis kan beskytte mod hypoxi-induceret mandlig reproduktionsskade ved at genoprette antioxidant enzymaktivitet, reducere ROS-induceret OS, samtidig øge cellelevedygtighed og mindske apoptose. Det er vigtigt, at Cis-undertyperne (Cis-A, Cis-B, Cis-C og Cis-H) undersøgt i denne undersøgelse alle viste en vis beskyttende effekt på det reproduktive system, og Cis-B viste den mest signifikante effekt. Derfor spekulerer vi i, at Cis kan være en god kandidat antioxidant tilbehandling af hypoxi-induceret mandlig reproduktionsskade, selvom den præcise underliggende mekanisme kræver yderligere undersøgelse.