Cistanche Tubulosa inducerer reaktiv ilt artsmedieret apoptose af primære og metastatiske humane tyktarmskræftceller

INTRODUKTION

Kolorektal cancer er en af ​​de mest almindelige kræftformer på verdensplan (BrennerET AL., 2014), og dens forekomst er konstant stigende med anslået 2,4 millioner tilfælde i 2035 på grund af moderne kost og livsstil, sammen med nedsat fysisk aktivitet. Den nuværende indsats er ikke tilstrækkelig til at bekæmpe den nuværende epidemi af tyktarmskræft, og derfor er der behov for nye tilgange til effektiv forebyggelse og behandling, herunder ændringer i livsstil i kombination med sikrere alternative indgreb som f.eks.Fytoterapeutika (WeidnerET AL., 2015). Fytoterapi, brugen af ​​lægeplanter til at behandle sygdomme, har været en uundgåelig del af den gamle menneskelige historie. Lægeplanter har længe været brugt som alternative behandlingskilder for kræftsygdomme, der repræsenterer mere end tres procent af de anticancermidler, der anvendes i konventionel medicin (Balunas og Kinghorn, 2005; SaibuET AL., 2015). Nogle af de bedst kendte eksempler omfatter uddrag fraCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) og Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg og Newman, 2005; da RochaET AL., 2001). Adskillige urteekstrakter og fytokemikalier har vist sig at have antitumoreffekter i tyktarmskræft, der tilskrives induktion af reaktive oxygenarter (ROS) produktion og associeret apoptose af cancerceller som i tilfælde af ekstrakter fraMelissa officinalis(WeidnerET AL., 2015)

Blandt fytoterapeutiske kandidater,Cistanche tubulosa, en Orobanchaceae parasitisk ørkenplante (Jiang et al., 2009), der er vidt udbredt i tørre og halvtørre områder i Afrika, Asien og Middelhavsområdet, har vist sig at have værdifulde medicinske egenskaber. Cistanche tubulosa er blevet flittigt brugt i traditionel medicin og foreslås at have helbredende virkninger ved nyremangel, sygelig leukorré, metroragi, kvindelig infertilitet og senil obstipation (Jiang et al., 2009). Ud over dets traditionelle medicinske anvendelser er vigtige lægemidler egenskaber af Cistanche Tubulosa er blevet intensivt undersøgt i løbet af det sidste årti, herunder vasorelaxant (Yoshikawa et al., 2006), hepatobeskyttende (Morikawa et al., 2010), anti-hyperglykæmiske og hypolipidæmiske effekter (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa blev også foreslået som en potent forstærker af immunsystemet, en promotor for knogledannelse og et middel mod aldring og træthed (Xu et al., 2014). Endvidere har Cistanche tubulosa-ekstraktet vist sig at blokere amyloidaflejring i Alzheimers sygdomsmodel (Wu et al., 2015). På trods af dens forskellige terapeutiske anvendelser er virkningen af ​​Cistanche Tubulosa som et potentielt anticancermiddel endnu ikke blevet undersøgt.

I dette arbejde har vi undersøgt anticancer-effekten af ​​Cistanche Tubulosa på to primære og to metastatiske tyktarmskræftcellelinjer og de potentielle mekanismer, der ligger til grund for denne effekt.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIALER OG METODER

Indsamling og tilberedning af planteekstrakt

Prøverne af Cistanche tubulosa blev indsamlet fra ørkenområderne i Qatar i 2014, og plantens ægthed blev bekræftet af herbatologen. Kuponprøver arkiveres i Toksikologi- og Multifunktionsafdelingen på ADLQ. De soltørrede planteprøver blev malet med Retsch Knife Mill Grindomix GM300 til fint pulver. Tyve gram pulver blev ekstraheret med 200 ml ultrarent vand natten over ved 37 grader på en roterende ryster ved 200 rpm. Den råCistanche tubulosa ekstrakter (CTE)blev centrifugeret i 3 0 minutter ved 8000 rpm for at pelletere uopløselige forbindelser, supernatanten blev opsamlet og frysetørret under anvendelse af en Labconco Freezone 6 plus frysetørrer. Den tørrede ekstrakt blev rekonstitueret i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, SIGMA, Tyskland) til en koncentration på 20 mg/ml og sterilfiltreret gennem et 0,2- mikron membranfilter.

Cellelinjer og cellevedligeholdelse

Humane tyktarmscarcinomcellelinjer CaCo2, SW620 og LoVo blev opnået fra Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Tyskland), mens HCT 116-cellelinjen var en venlig gave fra Biological and Environmental Sciences, Department ved Qatar University. CaCo2 og HCT11 blev afledt fra det primære sted for coloncarcinom, mens SW620 og LoVo blev afledt fra det metastatiske sted. SW620-, HCT116- og LoVo-celler blev dyrket og holdt i DME-medium, mens CaCo2-celler blev holdt i Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, SIGMA, Tyskland). Cellerne blev dyrket som monolag dyrket ved 37 grader i respektive medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, SIGMA, Tyskland) og 1% Penicillin/Streptomycin (SIGMA, Tyskland) i en befugtet atmosfære indeholdende 5% kuldioxid.

Cellelevedygtighedsanalyse

{{0}}[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)-assayet blev brugt til at evaluere den cytotoksiske aktivitet af CTE på samme måde som beskrevet tidligere (Jaganjac et al., 2010). Podningstætheden af ​​CaCo2-, HCT116-, SW62-0- og LoVo-celler dyrket i 96-brøndsplader var 104 celler pr. brønd. Celler blev udpladet i respektive medium suppleret med 10 % FBS 24 timer før behandling. Efter 24 timer blev mediet fjernet, og cellerne blev behandlet med 0, 0,25, 0,5, 1 og 2 mg/ml CTE i 24, 48 og 72 timer ved 37 grader i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2. Efter CTE-behandling blev mediet fjernet, og 40 µL MTT-opløsning (0,5 mg/ml) blev tilsat til hver brønd.

Efter 3 timers inkubation blev MTT-opløsningen fjernet, formazanproduktet opløst i dimethylsulfoxid (DMSO, SIGMA, Tyskland), og absorbansen blev målt ved 590 nm med en mikropladelæser (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Schweiz) .

Apoptose assay

Apoptose i CaCo2-, HCT116-, SW62-0- og LoVo-celler blev detekteret ved hjælp af PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I med 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) som et vital farvestof (Becton) Dickinson International, Belgien) i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt blev celler podet i 24-brøndsplader ved en densitet på 5×104 celler/brønd i et respektive medium suppleret med 10 % FBS i 24 timer før tilsætning af CTE (0, 0,5) eller 1 mg/ml). Efter 24 CTE-inkubation blev cellerne høstet, vasket to gange med kold fosfatbufret saltvand og farvet med Phycoerythrin (PE) Annexin V og 7-AAD i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Farvede celler blev analyseret inden for 1 time ved flowcytometri under anvendelse af FACS. Aria III flowcytometer og FACSDiva software (Becton Dickinson) ved en lav flowhastighed med minimum 104 celler. Behandling af celler i 4 timer med 6 µM camptothecin (SIGMA) blev anvendt som en positiv kontrol for assayet.

Intracellulær ROS-produktion

Intracellulær ROS-produktion blev undersøgt under anvendelse af 2,7- dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA, SIGMA, Tyskland). DCFH-DA er en ikke-fluorescerende probe, som er oxideret med intracellulær ROS til den fluorescerende forbindelse 2,7- dichlorfluorescein (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). DCFH DA-assayet blev udført på samme måde som vi har beskrevet før (Cindric et al., 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Kort sagt var podningstætheden af ​​CaCo2-, HCT116-, SW620- og LoVo-celler dyrket i 96-brønds sorte plader 104 celler pr. brønd. Celler blev udpladet i respektive medium suppleret med 10% FBS i 24 timer. Før behandling blev celler inkuberet med 10 µM DCFH-DA ved 37 grader i 30 minutter i 5 % CO2 / 95 % luft. Celler blev derefter vasket og behandlet med 0, 0,5 og 1 mg/ml CTE i mediet uden phenolrødt. Den intracellulære ROS-dannelse blev overvåget kontinuerligt gennem 25 timer ved 37 grader og 5 % CO2 ved hjælp af en mikropladelæser med topfluorescens og gaskontrolmodul (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Schweiz). Fluorescensintensiteten blev målt med en excitationsbølgelængde på 500 nm og emissionsdetektion ved 529 nm. De arbitrære enheder, relative fluorescensenheder (RFU), var baseret direkte på fluorescensintensitet.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF NYREFUNKTIONEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Generering af mitokondriel superoxid

CTEs evne til at inducere superoxiddannelse af mitokondrier blev estimeret ved hjælp af cellegennemtrængelige, mitokondriermålrettede MitoSOX Red-probe (Life Technologies) og Hoechst 33342 til nuklear farvning (Life Technologies). CaCo2-, HCT116-, SW62-0- og LoVo-celler blev podet i 96-brøndsplader med en tæthed på 104 celler pr. brønd i et respektive medium suppleret med 10 % FBS i 24 timer . Celler blev derefter fyldt med 4 µM MitoSOX og 2 µM Hoechst 33342 i 20 minutter, overskydende farvestof vasket og brønde behandlet med 0, 0,5 og 1 mg/ml CTE i 24 timer ved 37 grader og 5 % CO2. Fluorescensintensiteten blev målt med en excitationsbølgelængde på 510 nm og emissionsdetektion ved 580 nm for MitoSOX og en excitationsbølgelængde på 350 nm og emissionsdetektion ved 461 nm for Hoechst 33342 ved hjælp af en mikropladelæser med Te0In fluorescence200-handelsteknologi. AG, Schweiz)

Statistisk analyse

Beskrivende statistik blev vist som middelværdien +/− SD. Betydningen af ​​forskelle mellem grupperne blev vurderet ved hjælp af Student t-test og Chi-square test. Når mere end to grupper blev sammenlignet, brugte vi ensidig ANOVA med passende post hoc test. SPSS 11.01 til Mircosoft Windows blev brugt. Forskelle med P mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.

RESULTATER

Virkningen af ​​CTE på proliferationen af ​​humane tyktarmskræftcellelinjer er vist i figur 1. Alle testede CTE-koncentrationer viste en stærk hæmmende effekt på CaCo2-cellelinjen på en koncentrations- og tidsafhængig måde (figur 1A). Tooghalvfjerds timers CTE-behandling hæmmede væksten af ​​CaCo2-celler med mere end 60% sammenlignet med kontrol (p < 0.05 for alle koncentrationer). Signifikant indvirkning af CTE-behandling på HCT116-cellevækst blev også detekteret på alle tidspunkter ved de to højeste koncentrationer (1 mg/ml og 2 mg/mL), og nåede en reduktion på mere end 70 % ved sidstnævnte koncentration (figur 1B, p < 0,05). Selvom de to lavere CTE-koncentrationer (0,25 og 0,5 mg/ml) signifikant reducerede HCT116-vækst af celler efter 24 timer (p.<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). Tids- og koncentrationsafhængig inhibering af proliferation med CTE blev yderligere bekræftet i LoVo-celler med mere end 60% ved højeste koncentration (p < 0.05) (Figur 1C), og alle fire testede CTE-koncentrationer reducerede væksten af ​​SW620-celler efter 48 timer (figur 1D, p < 0.05 for alle). Efter 72 timers behandling blev den samme effekt kun observeret for de to højeste koncentrationer (p < 0,05), mens koncentrationer på 0,25 og 0,5 mg/ml ikke viste nogen signifikant effekt sammenlignet med kontrol (p > 0,05). Virkningen af ​​0,5 og 1 mg/ml CTE-behandling på induktion af apoptose blev yderligere testet i alle fire cellelinjer (figur 2). Et øget antal celler i tidlig apoptose blev påvist i HCT116 og LoVo efter 24-times behandling med 0,5 mg/ml (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Fig. 1:Effekten afCistanche tubulosapå levedygtigheden af ​​tyktarmskræftcellelinjer. Cellelevedygtighed målt ved MTT-assay af (A) CaCo2-, (B) HCT116-, (C) LoVo- og (D) SW620-celler præsenteres som en procentdel af den ubehandlede kontrolcellelinje for tyktarmscancer. Middelværdier (±SD) for 5 replikater af det repræsentative eksperiment er angivet: (*) signifikans p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 2: Cistanche tubulosa-vandekstrakt inducerer apoptose i humane coloncancerceller. Annexin-V-FITC flowcytometri-analyser af (A) CaCo2-, (B) HCT116-, (C) LoVo- og (D) SW620-celler præsenteres som en procentdel af ubehandlet kontrolcellelinje for tyktarmskræft. Middelværdier (±SD) for 3 replikater af det repræsentative eksperiment er angivet: (*) signifikans p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 3: Cistanche tubulosa-vandekstrakt inducerer intracellulær ROS-produktion i en tids- og dosisafhængig. ROS-produktion målt ved DCFH-DA-assay i (A) CaCo2-, (B) HCT116-, (C) LoVo- og (D) SW620-celler præsenteres som gennemsnitlige RFU-værdier (±SD) for de respektive 5-replikater af et repræsentativt eksperiment. (*) Betydning s<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Fig. 4: Cistanche tubulosa-vandekstrakt inducerer mitokondriel superoxidproduktion i humane tyktarmskræftceller. Fluorescensintensiteten af ​​mitokondriemålrettet MitoSOX Red-probe i A) CaCo2-, (B) HCT116-, (C) LoVo- og (D) SW620-celler præsenteres som en procentdel af kontrol ubehandlet tyktarmskræftcellelinje. Middelværdier (±SD) for 5 replikater af det repræsentative eksperiment er angivet: (*) signifikans p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISKUSSION

Selvom tidligere undersøgelser har rapporteret adskillige medicinske egenskaber af Cistanche tubulosa, er dette den første rapport om dets anti-proliferative virkning i maligne celler. Cistanche tubulosa bioaktive forbindelser ekstraheret med vand, et meget polært opløsningsmiddel, viste stærk anticancer bioaktivitet. Vi har tidligere sammenlignet effektiviteten af ​​Cistanche tubulosa solubiliseret i vand med andre opløsningsmidler såsom methanol og ethylacetat, men vandekstrakter udviste de mest lovende anticanceraktiviteter (data ikke vist).

Vi har demonstreret evnen af ​​CTE ved 1 mg/ml og 2 mg/ml til at hæmme 60% af væksten af ​​både primære og metastatiske coloncancercellelinjer, hvilket afslører en potentielt vigtig rolle forCistanche tubulosasom tyktarmskræftbehandling. Sammenlignet med normale celler er cancerceller generelt karakteriseret ved en forstyrrelse i redox-homeostase, og en fælles strategi for nuværende anticancerterapier er at øge cellulært oxidativt stress (Yang et al, 2013). Selvom fysiologisk lave niveauer af ROS har en vigtig rolle som signalmolekyler, kan overdreven ROS-produktion bidrage til kræftustabilitet og malignitet (Liou og Storz, 2010). Paradoksalt nok gør denne ubalance i cellulær redox-homeostase kræftceller mere sårbare over for ROS-induceret celledød (Jaganjac et al., 2008; Nogueira og Hay, 2013). Den anti-proliferative effekt af CTE rapporteret i denne undersøgelse kan medieres af forskellige ekstra- og intracellulære mekanismer af kendte og ukendte forbindelser i ekstraktet, målrettet mod flere veje, der spiller væsentlige roller i apoptose. For at skelne mellem forskellige former for celledød undersøgte vi den potentielle mekanisme, der er ansvarlig for den observerede CTE-inducerede cytotoksicitet.

CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT Anti Alzhermer's PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Vores data indikerer, at CTE øger intracellulær ROS-produktion og følgelig ROS-induceret celledød. Redox-tilstanden af ​​cellen spiller også en afgørende rolle i reguleringen af ​​apoptose, og den mitokondrielle elektrontransportkæde er et af de vigtigste steder for cellulær ROS-generering (Trachootham et al., 2008). Ydermere kunne den intracellulære ROS forårsage cellulær apoptose via både mitokondrierafhængige og uafhængige veje (Sinha et al., 2013). Vores data indikerer faktisk også, at CTE-induceret phosphatidylserin-eksternisering er en almindelig effekt i apoptose, i både primære og metastatiske cancercellelinjer, hvilket tyder på, at mekanismen for CTE-induceret død er medieret af apoptose snarere end nekrose. Aktiveringen af ​​apoptose i kræftceller er en korrigerende strategi, og mange kræftlægemidler kan have apoptotisk virkning i kræftceller.

Forbindelser eller ekstrakter med pro-apoptotiske aktiviteter i kræftceller er derfor potentielt nyttige i anticancermedicinforskning (Wong, 2011). For at bestemme, om den CTE-inducerede pro-apoptotiske effekt er medieret af mitokondrier-induceret ROS-mekanisme, målte vi superoxidproduktion ved hjælp af en mitokondrie-målrettet fluorescerende probe i CTE-behandlede celler. Vores data viser tydeligt, at CTE stimulerer mitokondrie-superoxidproduktion, hvilket tyder på, at Cistanche tubulosa anticanceraktivitet i det mindste delvist medieres gennem mitokondrie-induceret ROS-mekanisme.

KONKLUSIONER

Som konklusion tyder vores data på, at vandekstraktet fra ørkenplanten Cistanche tubulosa kan repræsentere en lovende kandidat til en anticancer-tilgang i kombination med andre konventionelle terapier til forebyggelse og behandling af tyktarmskræft. Vi demonstrerer også, at toksiciteten af ​​planteekstraktet mod cancerceller medieres af øget intracellulær ROS-produktion og i det mindste delvist af mitokondrieafhængig apoptose. Yderligere undersøgelser er i gang for at isolere og karakterisere de individuelle biologisk aktive bestanddele, der er ansvarlige for anticanceraktivitet.

Mere forskning er nødvendig for at evaluere den potentielle brug af dette ekstrakt som et effektivt kemoforebyggende middel og for at forstå virkningsmekanismerne på tyktarmskræftceller på molekylært niveau. Yderligere prækliniske og kliniske undersøgelser er også nødvendige for at bekræfte de observerede gavnlige sundhedseffekter afCistanche tubulosa til forebyggelse af kræft.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE COFFE FORBEDRER HUKOMMELSE ANTI-TRÆTTE PHGS75% ECH 30% ACT 12%