Anastatinderivater lindrer myokardieiskæmi-reperfusionsskade via antioxidative egenskaber

For yderligere information, kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt:(±)-Anastatin A og B er flavonoider isoleret fra Anastatica hierochuntica. I en tidligere undersøgelse blev 24 di- og tri-substituerede nye derivater af anastatiner designet, og deres foreløbige antioxidantaktiviteter blev evalueret. I denne undersøgelse blev den beskyttende effekt af myokardieiskæmi-reperfusion (I/R) og den systematiske antioxidantkapacitet af 24 derivater undersøgt yderligere. Forbindelse 13 var den mest potente blandt alle de undersøgte forbindelser, hvilket øgede overlevelsen af ​​H9c2-celler til 80,82 procent. Antioxidantevnen af ​​forbindelse 13 blev evalueret i ferri-reducerende antioxidantkraft, 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre) radikalopfangning og 2,2-diphenyl{ {20}}picrylhydrazyl-assays. Det blev observeret, at forbindelse 13 signifikant reducerede infarktområder og forbedrede histopatologiske og elektrokardiogramændringer hos rotter med myokardie-I/R-skade. Desuden reducerede forbindelse 13 lækagehastighederne af serumlactatdehydrogenase, kreatinkinase og malonyldialdehyd fra rottemyokardievæv og øgede niveauet af glutathion- og superoxiddismutaseaktiviteter eftermyokardie I/R-skadehos rotter. Tilsammen konkluderede vi, at forbindelse 13 havde potente kardiobeskyttende virkninger mod myokardieI/R-skade både in vitro og in vivo på grund af dens omfattende antioxidantaktiviteter.

Nøgleord: flavonoidderivater; H9c2-celler; hypoxi/reoxygenering; kardiobeskyttende virkninger

Klik her for at få mere produktinformation

1. Introduktion

Iskæmisk hjertesygdom (IHD) er en førende dødsårsag på verdensplan [1]. Rettidig genopretning af blodgennemstrømningen kan effektivt forbedre det kliniske resultat af sygdommen; reperfusion er dog ikke uden risiko på grund af omfanget af cellulær skade forårsaget af selve reperfusionen. Derfor er det ekstremt vigtigt at udvikle effektive terapeutiske strategier mod myokardieiskæmi-reperfusion (I/R) skade [2]. Mekanismen for myokardie I/R-skade er meget kompliceret; det inkluderer apoptose, oxidativt stress [3], calciumoverbelastning [4] og inflammation [5].Oxidativt stresskan føre til apoptose gennem forskellige signaltransduktionsveje, herunder signalreguleret kinase (ERK), c-Jun aminoterminal kinase (JNK), aktivering af p53 (tumorprotein p53) og p66shc-variant. Desuden kan overdreven produktion af reaktive oxygenarter (ROS) forårsage irreversibel skade på cellemembraner og cellulære molekyler, såsom DNA, nukleinsyrer, protein, lipider og starte kædereaktioner, hvilket yderligere beskadiger myokardievæv. Oxidativt stress [6], som er forårsaget af en ubalance mellem dannelse af frie radikaler og ROS-opfangning, spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​I/R-skade I. Derfor er strategier, der beskytter myokardiet mod oxidativt stress, meget overvejet i behandlingen. af myokardie I/R-skade. Derfor, på grund af deres potentielle frie radikaler-fjernende evner, er antioxidantbaserede strategier gavnlige i håndteringen af ​​I/R-skader.

I kliniske undersøgelser bruges antioxidanter til at reduceremyokardie I/R-skadeer hovedsageligt opdelt i to typer: enzymer og ikke-enzymer. Enzymer såsom katalase og glutathionperoxidase reducerer koncentrationen af ​​hydrogenperoxid for at forhindre celleskade; ikke-enzymatiske antioxidanter såsom E-vitamin, C-vitamin, -caroten osv. Svækker vævets oxidative stressrespons for at reducere vævsskader og fremme funktionel reparation. Imidlertid har anvendelsen af ​​begge i øjeblikket visse begrænsninger. Den store molekylære masse af enzympræparater er ikke befordrende for absorption [8]. Der er også visse problemer med stabiliteten af ​​ikke-enzymer, hvilket fører til dårlig stabilitet af lægemidler, hvorfor de let oxideres [9].Flavonoider, som en slags ikke-enzymatiske antioxidanter, er blevet rapporteret at have en række potente egenskaber, herunder antioxidant, anti-cancer, antiapoptotisk og kardiovaskulær beskyttelse [10]. De forhindrer dannelsen af ​​stærkt reaktive oxider og hæmmer oxidative reaktioner ved at fjerne ROS, såsom hydrogenradikaler og peroxynitrit. Anastatin A og B [11] er flavonoider med hepatobeskyttende aktivitet. Anastasius A og B er aktive komponenter i Anastatica hierochuntica (undertype Anastatica, familien Brassicaceae). I øjeblikket er der meget få rapporter om den kemiske syntese og strukturelle modifikationer af anastatin A og B. I 2003 blev aktive forbindelser fra Anastatica hierochuntica isoleret og afsløret at have hepatobeskyttende virkninger mod D-galactosamin-induceret cytotoksicitet i primære dyrkede musehepatocytter. Nakashima og Eman har også vist, at forbindelserne udøver in vitro antioxidant- og anticanceraktiviteter. Imidlertid forbliver de farmakologiske virkninger af anastatin A og B og deres derivater, såvel som procedurer for deres syntese, uklare. Derfor sigtede vi på at syntetisere anastatinerne A og B og nogle af deres derivater og evaluere dem for antioxidantaktiviteter i en hypoxi/reoxygenering(H/R) model, som er effektiv til at studere myokardie I/R skade [12].

I en tidligere undersøgelse syntetiserede vi anastatinerne A og B og deres analoger og evaluerede deres antioxidantkapacitet ved hjælp af en cellekulturmodel af H2O2 (hydrogenperoxid)-induceret oxidativ skade13. Vores tidligere resultater viste, at anastatinerne A og B har potente hepatobeskyttende aktiviteter, der synes at være relateret til deres antioxidantevner.

I denne undersøgelse blev anastatinerne A og B og 24 af deres derivater syntetiseret og evalueret for antioxidantegenskaber ved hjælp af reducerende kraft og radikal-fjernende test. Derudover blev en simpel H9c2-cellemodel af H/R og en rottemodel for myokardie I/R-skade brugt til at evaluere forbindelsernes hjertebeskyttende virkninger.

2. Resultater

2.1.H/R Model Etablering

Koncentrationen af ​​Na2S, O4-behandling blev vurderet som vist i figur 1A, og overlevelsesraten for H9c2-celler blev reduceret med stigende Na2S2O4-koncentration. Under 4 mM Na, S, Oa faldt cellelevedygtigheden til mindre end 50 procent (henholdsvis 13,7,25 og 43,4 procent ved reoxygeneringstiden på 2,1 og 0 timer) , og niveauet af reduktion af cellelevedygtighed var lavere. Derfor blev en 4 mM koncentration af Na2S2O4 brugt til at efterligne hypoxisk behandling. Figur 1B viser, at 4 mM Na2S2O4-behandling i 2 timer uden reoxygenering (0 timer) reducerede cellelevedygtigheden signifikant og forblev stabil. Under betingelse af 4 mM koncentration af NazS2O4 i 2 timers efterligning af hypoxi reducerede 2 timers reoxygenering celleoverlevelsesraten til 17,37 procent (Figur 1C). Som det tydeligt er vist i figur 1D, vendte 10 μM resveratrol den reducerede cellelevedygtighed forårsaget af H/R, som var mere potent end den samme koncentration af gallussyre (74,34 vs. 60,44 procent for gallussyre).

Som et resultat blev hypoxi/reoxygeneringsmodellen etableret ved at bruge Na2S, O4 i en slutkoncentration på 4 mM i 2 timers efterlignende hypoxi efterfulgt af dyrkning i normal DMEM (Dulbeccos modifikation af Eagles medium)/høj glukose for at efterligne reoxygeneringsskade . Resveratrol i en slutkoncentration på 10 μM blev brugt som en positiv kontrol.

2.2. Anastatiner og deres derioatioer forbedrer levedygtigheden af ​​H9c2-celler, der er udsat for H/R-behandling

Først undersøgte vi virkningerne af anastatinerne A og B (figur 2A, B) og deres derivater på levedygtigheden af ​​H9c2-celler i en MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1){{ 10}},5-di-phenytetrazoliumromide) assay [13]. Forbindelserne 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 og 11 var ikke signifikant cytotoksiske for H9c2-celler (figur 3A, B, tabel S2). Anastatin A og B, deres derivater og resveratrol (positiv kontrol) reverserede hypoxi-induceret celleskade (figur 4). I modelgruppen blev cellelevedygtigheden reduceret til 20,31 procent, hvilket blev øget til 82,68 procent af resveratrol, og anastatin A og forbindelserne 22b, 22c, 24b, 24c, 13 og 14 øgede celleoverlevelsesraten til mere end 70 procent ( henholdsvis 71.49,71.00,76.50, 73.24,77.57, 80.82 og 77.13 procent). Derfor havde forbindelse 13 (figur 2C) den stærkeste beskyttende virkning blandt anastatinderivaterne fra H/R-skade og blev brugt i de efterfølgende eksperimenter.

2.3. Forbindelse 13 Lindrer H/R-induceret celleskade og oxidativ stress

For at udforske forbindelsens antioxidantkapacitet, treoxidativt stressindikatorer, LDH (lactatdehydrogenase), GSH (L-Glutathion) og SOD (superoxiddismutase), blev udvalgt til at evaluere forbindelsernes antioxidantkapacitet. LDH er det stabile cytoplasmatiske enzym, der er til stede i myokardieceller, som hurtigt frigives fra celle til cellekulturmedium ved myokardiecellemembranskade. Jo mere alvorlig skaden er, jo højere er niveauet af LDH i dyrkningsmediet. Figur 5A viste, at 2 timers hypoxi efterfulgt af 2 timers reoxygenering signifikant øgede LDH-frigivelsen (478,98 U/L vs. 55,84 U/Lin den tomme gruppe, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4. Antioxidantkapacitet af forbindelse 13

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>resveratrol. Derfor kan antioxidantkapaciteten af ​​forbindelse 13 være højere end andre typiske antioxidanters.

2.5. Effekter af anastatinderivat 13 på myokardie I/R-skader hos rotter

2.5.1. Virkninger af forbindelse 13 på oxidativ stress og antioxidant enzymaktiviteter

Niveauet af myokardieskade blev vurderet ved at detektere den oxidative stressmarkør og antioxidant enzymaktiviteter. Virkningerne af forbindelse 13 på MDA (malondialdehyd) aktivitet i myokardievæv, såvel som niveauerne af LDH, CK(kreatinkinase), GSH og SODin serum blev vurderet. Som vist i figur 7 resulterede I/R-skade i en stigning i niveauerne af LDH (Figur 7A) og CK (Figur B) og et signifikant fald i GSH (Figur 7C) og SOD-aktiviteter (Figur 7D) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. Virkninger af forbindelse 13 på elektrokardiogram (EKG) ændringer og hjertefrekvens

Typiske EKG (elektrokardiogram) ændringer induceret af myokardie I/R skade er vist i figur 8. Sammenlignet med normalt EKG (Figur 8A) kan myokardie I/R skade forårsage ORS (en del af den elektrokardiografiske bølge) amplitudeforøgelse (Figur 8B); QRS-bølge- og ST-bølgefusion (figur 8C); ST-segment (intervallet mellem S-bølgen og T-bølgen) højde (figur 8D); og ST-segmentinversion (figur 8E). Efter 15 minutters LAD-ligering blev QRS-amplitude signifikant forøget fra omkring 0,5 mV til 1,2 mV i modelgruppen (figur 9A), mens en lavere QRS-amplitudestigning blev observeret i alle behandlingsgrupperne (fra omkring 0,4 mV til 1,0,8 og 0,6 mV for henholdsvis resveratrol-, lavdosis-13- og højdosis-13-gruppen)(Figur 9B-D ). Derudover blev en lignende tendens observeret ved ligeringen på 30 min. Under reperfusionen begyndte QRS-amplituden at falde; QRS-bølgen i modelgruppen forblev dog den højeste i hele perioden. Efter 20 min reperfusion reduceredes QRS-amplituden i modelgruppen til ca. {{30}},8 mV, værdien i behandlingsgruppen var ca. 0,6, 0,5, 0,5 mV for henholdsvis resveratrol, lav dosis 13 og høj dosis 13 gruppen. Samlet set reducerede behandlingen af ​​resveratrol, lav dosis 13 og høj dosis 13 alle patologisk QRS-amplitudestigning sammenlignet med modelgruppen under både iskæmi og den tidlige reperfusionsproces, hvilket kan tilskrives deres myokardiebeskyttende aktivitet.

Sammen med overvågningen af ​​EKG blev ændringerne i hjertefrekvens detekteret tæt. Som vist i tabel S3 reducerede 30 minutters ligering hjertefrekvensen dramatisk i alle grupper, mens der ikke blev påvist signifikante forskelle mellem nogen af ​​behandlingsgrupperne og modelgrupperne. Efter 2 timers reperfusion steg hjertefrekvenserne, men der blev ikke fundet signifikante ændringer blandt nogen af ​​grupperne.

2.5.3. Virkninger af forbindelse 13 på infarktområde og histopatologiske ændringer

For at evaluere niveauet af myokardieskade blev hjertevæv farvet med TTC (2,35-Triphenyltetrazoliumchlorid), og histopatologiske ændringer blev påvist. Som vist i figur 10 blev der i sham-gruppen ikke observeret nogen ændringer i myokardiet efter TTC-farvning, mens en skala på ca. 30 procent af hvide infarktområder blev observeret i I/R-gruppen. I grupperne med resveratrol og lavdosis 13-grupperne var infarktområderne signifikant reduceret til omkring 10 procent, og infarktområdet i højdosis-13-grupperne blev minimeret til omkring 5 procent. Figur 10 viser resultatet af HE (hematoxylin-eosin) farvningsundersøgelse: forstørrelse af hjerteceller, delvist opløste membraner og kerner, og inflammatorisk celleinfiltration blev observeret i vævssnit fra modelgruppen. Imidlertid lindrede forbehandling med forbindelse 13 signifikant disse histopatologiske ændringer. Resultaterne af TTC-farvning og HE-farvning indikerede, at forbindelse 13 kan reducere I/R-induceret myokardieinfarkt på en dosisafhængig måde.

3. Diskussion

Med henblik på den potentielle antioxidantaktivitet af anastatinerne A og B syntetiserede vores laboratorium 24 derivater af anastatiner og udførte en foreløbig analyse af cytotoksiciteten af ​​forbindelser mod PC-12 og deres cytobeskyttende aktiviteter i HO,-induceret oxidativ skade [13] . I denne undersøgelse gennemførte vi hovedsageligt den dybdegående biologiske evaluering af 13 af de 24 derivater med de stærkeste antioxidantaktiviteter.

I denne undersøgelse blev myokardie I/R-skade etableret i H9c2-celler gennem induktion med H/R-behandling. Resultaterne af undersøgelsen indikerede, at anastatin A og B og deres undersøgte derivater forbedrede levedygtigheden af ​​H9c2-celler efter H/R-behandling. Forbindelse 13 viste sig at være den mest potente blandt de 26 undersøgte forbindelser og blev derfor udvalgt til yderligere evaluering. Aktiviteterne af LDH (en markør for celleskade), SOD og GSH (oxidative stress-markører) blev påvist i supernatanterne af H9c2-celler efter H/R-behandling. Vi fandt, at forbehandling med testforbindelserne signifikant reducerede LDH-niveauer og øgede SOD- og GSH-niveauer i cellerne. Således antog vi, at anastatinderivater havde kardiobeskyttende aktivitet, der kan tilskrives deres evne til at undertrykke oxidativt stress. DPPH- og ABTS-assays bruges til at evaluere stoffets radikalopfangende kraft [14]. Som et resultat havde forbindelse 13 høj antioxidantkraft, og den opfangede ABTS og DPPH ved lave EC50-værdier, hvilket yderligere indikerer undertrykkelse af oxidativt stress. LAD-ligering er en almindelig metode, der bruges til at etablere myokardie I/R-modeller. Ved at vurdere amplituden af ​​QRS-kompleks før iskæmi, efter iskæmi og efter reperfusion fandt vi, at forbehandling med forbindelse 13 kan lindre ventrikulær arytmi signifikant under iskæmi og tidlig reperfusion. Endvidere påvirkede forbindelse 13 også infarktområderne og histopatologiske ændringer af myokardieinfarkt. Disse resultater, sammen med resultaterne af, at forbindelse 13 undertrykte oxidativt stress og øgede niveauerne af antioxidantenzymer i rotteserum på en dosisafhængig måde, viste, at forbindelse 13 havde en potent virkning mod myokardieskade.

Som konklusion havde anastatinderivater potente antioxidantegenskaber, hvor forbindelse 13 viste den højeste antioxidantaktivitet blandt de testede forbindelser. De mekanismer, der er ansvarlige for effekten af ​​anastatinderivater på oxidativ stress-relaterede signalveje skal stadig diskuteres. Astaxanthin (en undertype af carotenoid) kan fjerne ROS og yderligere lindre iskæmi/reperfusionsskade [15]. Lægemidler med potentiale til at forhindre ROS-generering kan være lovende i oxidativ stress-relaterede sygdomme [4]såsom celleterapi og hjerte-kar-sygdomme. Ydermere undertrykker ROS den hypoxiske induktion af hypoxi-inducerbar faktor-1 (HF-1) målgenekspression, som rapporteres at have en kardiobeskyttende effekt på iskæmi-reperfusionsskade [16]. Vi antager, at ROS- og HIF-1 regulatorisk protein kan spille en afgørende rolle i forbindelse 13's kardiobeskyttende effekt. Tournefolinsyre B (TAB), som er afledt af kinesisk urtemedicin, beskytter mod myokardie I/R-skader [17 ]. Undersøgelsen afslørede de vigtige roller af TAB i endoplasmatisk retikulum (ER) stress, apoptose og PI3K(phosphatidylinositol 3 kinase)/AKT(proteinkinase B) veje i håndteringen af ​​myokardie I/R skade. Andre veje, såsom mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK) pathway [18] og AMPK (Adenosin 5'-monophosphat-aktiveret protein kinase) signalvej [19], kan også være involveret i myokardie I/R skade. Derfor er næste trin at starte med ROS og HIF-1 regulatoriske proteiner og bruge TAB-medierede veje til at udforske mekanismerne, hvorved 13 udøver en antioxidanteffekt og beskytter myokardie I/R. Desuden bør eksperimenterne på celleniveau i denne undersøgelse også udføres i humane cellelinjer.

4. Materialer og metoder

4.1.Cellekultur

Rottekardiomyocyt H9c2-cellelinje blev købt fra Nanjing Kebai Biotechnology Company (Nanjing, Kina). Celler blev dyrket i DMEM/High glucose (Hyclone, USA) og suppleret med 10 procent FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, Kina) og 1 procent penicillin/streptomycin (Hyclone, Marlborough, MA, USA) i en fugtet inkubator ved 37 grader med 5 procent CO2.

4.2. Cellelevedygtighedsanalyse

Cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af MTT-assayet. H9c2-celler blev podet i en 96-brøndplade ved 1 x 10* celler/brønd i 24 timer. Bagefter blev celler behandlet med anastatiner A og B og deres derivater i 48 timer eller forbehandlet med anastatiner A og B og deres derivater efterfulgt af H/R-behandling. Derefter blev MTT (20 μL/brønd) tilsat og dyrket ved 37 grader i 4 timer. Absorbansen blev målt ved 578 nm ved anvendelse af en mikropladelæser (Tecan, Infinite 50). Cellelevedygtigheden i den tomme gruppe blev betragtet som 100 procent.

4.3. Hypoxi/Reoxygenation(H/R) model og lægemiddeladministration

4.3.1.H/R-model

NazS, O4 blev brugt til at efterligne den hypoxiske tilstand, som reagerer med [20] oxygen og reducerer iltspændingen. En række af syv koncentrationer af 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 mM blev udført for at bestemme de optimale koncentrationer af Na2S, O4. For at vælge optimal hypoxitid blev kulturer på 0,5, 1,2, 3 eller 4 timer udført efter behandling med Na2S2O4-opløsning. Kulturen under normalt DMEM/højt glucosemedium i 0, 1, 2, 3 eller 4 timer blev udført for at efterligne reoxygeneringstiden [21].

4.3.2. Lægemiddeladministration

Til lægemiddeladministration blev anastatinerne A og B og deres derivater (kemiske strukturer i tabel S1) adskilt i to grupper: anastatiner A og dets derivater og anastatiner B og dets derivater. Resveratrol, som blev rapporteret at have en kardiobeskyttende effekt gennem sin antioxidantaktivitet, blev brugt som en positiv kontrol. For at bestemme koncentrationen af ​​den positive kontrol blev resveratrol og en anden antioxidantforbindelse, gallussyre （3-100 μM）, evalueret ved hjælp af en MTT-analyse, hvor cellerne blev behandlet i 48 timer 【22】. Generelt blev H9c2-celler forbehandlet med anastatin A og B og deres derivater (10 uM af slutkoncentration) samt 10 uM resveratrol i 30 minutter før H/R-behandling.

4.4.Evaluering af antioxidantkapacitet

4.4.1. Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) analyse

FRAP-analysen blev udført i henhold til Oivuans metode 【23】. I alt 25 μL 1 procent kaliumferricyanid K3Fe（CN）6 blev pipetteret og 10 μL af forbindelse 13, vitamin c(ascorbinsyre, Vc) og resveratrol(0.{{8} } mM) plus 1 × PBS (pH=6.6) blev tilføjet. Blandingen blev holdt i 50 graders vandbade i 20 minutter efterfulgt af hurtig isafkøling. Derefter blev 25 μL 10 procent trichloreddikesyre (TCA), 0,1 procent ferrichlorid (FeCl) og destilleret vand tilsat i rækkefølge. Blandingen blev overført til en 96-brøndplade, og absorbansen blev analyseret ved 650 nm. Vc-opløsning (20-200 ug/mL) blev brugt til at bygge en standardkurve. Antioxidantegenskaberne blev beregnet ud fra den lineære kalibreringskurve og repræsenteret som Vc-ækvivalenter.

4.4.2.ABTS-metode

ABTS radikalopfangende aktivitet [24] blev udført ifølge Sugahara et al. og Re et al. ABTS-opløsningen blev fortyndet for at justere absorbansen spektrofotometrisk ved 650 af 0.70±0.02 nm, og ABTS-fjernende aktiviteter blev målt iht. følgende formel, E=((Acontrol-Ablank)-(A2 -A1)/(A control-Ablank))× 10, hvor kontrol er absorbansen af ​​kontrolreaktionen indeholdende 130 μL ABTS · plus arbejdsopløsning og 5,5 μL prøvefortynder （DMSO）, og Ablank er absorbansen af ​​130 μL natriumacetatbuffer og 5,5 μL DMSO. A er absorbansen af ​​130 μL ABTS plus arbejdsopløsning (natriumacetatbuffer) og 5,5 μL af forbindelse 13(0.02-20 mM), og Az er absorbansen af ​​130μL natriumacetatbuffer og 5,5 μL (forbindelse 13) 0,02-20 mM). Alle blandinger blev vortexet i 30 s og inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter efterfulgt af måling af absorbansen ved 650 nm. ECs0 blev beregnet ved hjælp af den lineære sammenhæng mellem forbindelseskoncentrationen og sandsynligheden for procentdelen af ​​ABTS-hæmning.

4.5. Iskæmi-reperfusionsmodel

4.5.1.Dyrepleje

Sprague Dawley (SD) rotter blev opnået fra PLA Military Academy of Medical Sciences Laboratory Animal Center (Beijing, Kina). Halvtreds SD-hanrotter, der vejede fra {{0}} g, blev akklimatiseret i en uge under stuetemperatur på 23± 1 grad med en 12 timers lys/mørke-cyklus, og mad og vand blev tilvejebragt. Rotter blev opdelt i fem grupper: den blanke gruppe (rotter modtog ingen behandling, men falsk operation), modelgruppen (rotter modtog vehikelbehandling og MI/R-operation), resveratrolgruppen (rotter modtog 200 mg/kg resveratrol og MI/R) operation), lavdosis 13-gruppen (rotter modtog 100 mg/kg forbindelse 13 og MI/R-operation) og højdosis 13-gruppen (rotter modtog 200 mg/kg forbindelse 13 og MI/R-operation). Forbindelser blev formuleret i 0,5 procent natriumcarboxymethylcellulose og doseret som en suspension ved 1 ml/kg oralt én gang dagligt i syv dage. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af laboratoriedyr og godkendt af den akademiske komité ved Tianjin University of Science and Technology.

4.5.2. Eksperimentel protokol

Sprague Dawley-rotter blev bedøvet med 20 procent urethan (0,8 ml/100 g), og vi udførte derefter myokardieiskæmi ved venstre anterior descending (LAD) ligering. Hjertet blev eksponeret gennem et venstre thoraxsnit og anbragt på en 4-0 silkesutur for at udføre regional iskæmi i 30 minutters iskæmi efterfulgt af 2 timers reperfusion. Beviset for myokardieiskæmi blev bekræftet af ST-segmentforhøjelse og QRS-amplitudeforøgelse. Under eksperimentet blev rotter holdt på en ventilator DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Beijing, Kina). Hjertefrekvens og EKG'er blev overvåget gennem det biologiske signalopsamlingssystem MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Beijing, Kina). Efter overvågning af iskæmi/reperfusionsprocessen blev rotterne aflivet, og blodprøver og hjertehomogenater blev brugt til at detektere myokardiebeskadigelse ved anvendelse af kommercielle detektivsæt.

4.5.3. TTC-farvning og HE-farvning

Omfanget af det iskæmiske område blev kvantificeret ved triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-farvning. Hjerteprøverne blev frosset straks ved {{0}} grader i 10 minutter, og der blev lavet fem skiver af tynde 1 til 2 mm skiver. Derefter blev skiverne anbragt i 1 procent TTCphosphatbuffer (pH=7.0) og farvet ved 37 grader i 20 minutter og fikseret i formalin. Billeder blev taget ved hjælp af et digitalkamera, og procentdelen af ​​infarktområdet (TTC-negativ) og risikoområdet (TTC-positivt) blev målt ved hjælp af ImageJ-software [25]. Til HE-farvning blev det infarkterede område skåret ud og fikseret i 10 procent formaldehyd og derefter indlejret i paraffin. Derefter blev væv farvet med HE(hematoxylin-eosin) og undersøgt under et lysmikroskop. Dehydrerede indlejrede sektioner og tætningssektioner blev bestilt af Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Tianjin, Kina).

4.6. Spektrofotometriske kommercielle sæt

Kommercielle sæt brugt i denne forskning blev købt fra Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Beijing, Kina) og Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Nanjing, Kina). ), kreatinkinase (CK), glutathion (GSH) og superoxiddismutase (SOD) aktiviteter blev evalueret. Malondialdehyd (MDA) aktiviteter blev målt under anvendelse af rottehjertehomogenat. Alle kommercielle kits blev udført efter producentens instruktioner.

4.7.Statistikproces

Alle forsøgene blev gentaget mindst tre gange. De eksperimentelle data blev behandlet ved hjælp af GraphPad Prism7-software, og det eksperimentelle resultat for hver gruppe blev udtrykt som middel ± standardafvigelse (x± s). T-testen blev brugt til at sammenligne den statistiske signifikans mellem grupperne. P<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

Referencer

1. Uzdensky, AB; Demyanenko, S. Histonacetylering og deacetylering ved iskæmisk slagtilfælde. Neural Regen. Res. 2021, 16, 1529-1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Li, H.; Yin, A.; Cheng, Z.; Feng, M.; Zhang, H.; Xu, J.; Wang, F.; Qian, L. Svækkelse af Na/K-ATPase/Src/ROS-amplifikationssignalvej med pNaktide forbedrer myokardieiskæmi-reperfusionsskade. Int. J. Biol. Macromol. 2018, 118, 1142-1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Levin, RM; Xia, L.; Wei, W.; Schuler, C.; Leggett, RE; Lin, ADY Effekter af Ganoderma Lucidum skal-brudt spore på oxidativ stress af kanin urinblæren ved hjælp af en in vivo model for iskæmi/reperfusion. Mol. Celle. Biochem. 2017, 435, 25-35. [CrossRef] [PubMed]

4. Tan, Z.; Liu, H.; Sang, X.; Ling, Y.; Han er.; Yan, Y.; Yan, J.; Wang, S.; Wang, X.; Chen, A. Honokiol efterbehandling forbedrer myokardieiskæmi/reperfusionsskade ved at øge autofagisk efflux og reducere intracellulær ROS-produktion. Chem. Biol. Interagere. 2019, 307, 82-90. [CrossRef] [PubMed]

5. Hausenloy, DJ; Yellon, DM Myokardieiskæmi-reperfusionsskade: Et forsømt terapeutisk mål. J. Clin. Undersøg. 2013, 123, 92-100. [CrossRef]

6. Yu, C.; Li, D.; Li, Z.; Yu, D.; Zhai, G. Effekt af sacubitril/valsartan på inflammation og oxidativ stress i doxorubicin-induceret hjertesvigtsmodel hos kaniner. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 473-484. [CrossRef]

7. Wang, Y.; Che, J.; Zhao, H.; Tang, J.; Shi, G. Platycodin D hæmmer oxidativ stress og apoptose i H9c2-kardiomyocytter efter hypoxi/reoxygenationsskade. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2018, 503, 3219-3224. [CrossRef]

8. Pavlovic, M.; BNáfrádi Rouster, P. Meget stabil enzym-efterlignende nanokomposit af antioxidantaktivitet. J. Colloid Interface Sci. 2019, 543, 174-182. [CrossRef]

9. Qi, HZ; Wangi, WZ; He, JY Antioxidativt system af Deinococcus radiodurans. Res. Microbiol. 2019, 171, 822-831. [CrossRef]

10. Shao, L.; Shao, Y.; Yuan, Y. Pinocembrin-flavanon hæmmer cellelevedygtighed i PC-3 human prostatacancer ved at inducere cellulær apoptose, ROS-produktion og cellecyklusstandsning. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 669-678. [CrossRef]