Zebrafiskembryoet som en model til at teste beskyttende virkninger af fødevareantioxidantforbindelser

E-mailtina.xiang@wecistanche.comfor mere information.

Abstrakt: Detantioxidantaktivitet af fødevareforbindelser er en af ​​de egenskaber, der genererer størst interesse, på grund af dets sundhedsmæssige fordele og korrelation med forebyggelse af kronisk sygdom. Denne aktivitet måles sædvanligvis ved hjælp af in vitro assays, som ikke kan forudsige in vivo virkninger eller virkningsmekanismer. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere de in vivo beskyttende virkninger af seks phenolforbindelser (naringenin, apigenin, rutin, oleuropein, chlorogensyre og curcumin) og tre carotenoider (lycopen B, -caroten og astaxanthin), der er naturligt til stede i fødevarer vha. en zebrafisk embryomodel. Zebrafiskembryoet blev forbehandlet med hver af de ni antioxidantforbindelser og derefter udsat for tertbutylhydroperoxid (tBOOH), en kendt inducer afoxidativt stressi zebrafisk. Signifikante forskelle blev bestemt ved at sammenligne koncentrations-responsen af ​​den tBOOH-inducerede dødelighed og dysmorfogenese mod de forbehandlede embryoner medantioxidantforbindelser. En beskyttende virkning af hver forbindelse, undtagen -caroten, mod oxidativ-stress-induceret dødelighed blev fundet. Desuden viste apigenin, rutin og curcumin også beskyttende virkninger mod dysmorfogenese. På den anden side udviste -caroten øget dødelighed og dysmorfogenese sammenlignet med tBOOH-behandlingen alene.

Nøgleord: oxidativt stress; zebrafisk embryo; antioxidant virkning; polyphenoler; carotenoider

1. Introduktion

Reaktive oxygenarter (ROS) og reaktive nitrogenarter (RNS) opstår under cellemetabolisme. De er essentielle for en normal fysiologisk tilstand, men de deltager i patologiske processer, når de er i overskud [1]. Aerobe organismer har forsvar for at forhindre ROS-induceret oxidativ skade, der involvererantioxidantenzymer og/eller ikke-enzymatiske mekanismer, herunder endogent fremstillede antioxidantforbindelser eller indtagelse af antioxidanter i kosten [2].
Ubalancen, når koncentrationen af ​​reaktive arter er højere endantioxidantorganismens forsvar, kaldesoxidativt stress(OS) [3]. Konsekvenserne af OS inkluderer makrofagrekruttering; hæmning af den normale funktion af lipider og proteiner; og mitokondrie-, membran- og DNA-skader [4-7]. Disse ændringer er blevet korreleret med adskillige patologier, såsom cancer, aldring, diabetes, leddegigt og kardiovaskulære og neurodegenerative sygdomme, blandt andre [8-11].

Adskillige undersøgelser har fundet ud af, at en organisme kræver indtagelse af antioxidanter gennem kosten for at reducere oxidative skader [12] i fysiopatologiske situationer (på grund af UV-eksponering, rygning, forurenet luft osv.), som producerer overskydende ROS. Forskellige antioxidanter indtages gennem kosten, såsom phenolforbindelser, vitaminer, carotenoider ogflavonoider. Udtrykket "phenoliske forbindelser" henviser til ethvert stof med en phenolgruppe bundet til aromatiske eller alifatiske strukturer. Fenolforbindelser kommer fra planter og er blandt de vigtigste sekundære metabolitter; deres tilstedeværelse i dyreriget skyldes deres forbrug gennem kosten. Blandt disse forbindelser,flavonoiderer de mest undersøgte og rigelige; deres kemiske strukturer indeholder enflavonoidkerne, der består af 15 carbonatomer arrangeret i tre ringe (C6-C3-C6) [13]. Deres antioxidantmekanismer omfatter inhibering af enzymer eller chelering af sporstoffer involveret i produktionen af ​​frie radikaler, optagelsen af ​​ROS og beskyttelsen af ​​endogene antioxidantforsvar [14]. Middelmådenflavonoidindtaget er estimeret til 23 mg/dag [15,16], og de primære kilder er sort te, rødvin, løg, æbler og øl [17,18].

En anden gruppe af forbindelser, der er blevet undersøgt på grund af deres antioxidantaktivitet, er carotenoiderne. De er pigmenter, hvis strukturer omfatter en række konjugerede C=C-bindinger (polyen), som tillader dem at interagere med frie radikaler; derfor kan de fungere som effektive antioxidanter [19]. Carotenoider er bredt fordelt i naturlige systemer, og deres rolle i at forebygge forskellige sygdomme er blevet undersøgt, hovedsageligt for de forbindelser, der er til stede i kosten, såsom -caroten, lutein og lycopen [18,20,21].

Identificering af rollerantioxidanteri sygdomme og lidelser korreleret med oxidative processer er afgørende for at analysere beskyttende virkninger in vivo. Af denne grund har vores laboratorium udviklet en zebrafisk (ZF) embryomodel til evaluering af de beskyttende virkninger af disseantioxidantforbindelser [22].Oxidativt stressinduceres under anvendelse af tertbutylhydroperoxid (tBOOH). tBOOH genererer butoxyl-radikaler gennem Fentons reaktion [23]. De dannede radikaler favoriserer den intracellulære udtømning af thiolgrupper og glutathionreserver, hvilket producerer en signifikant stigning i dødelighed og dysmorfogenese i udsatte zebrafiskembryoner. Denne model tillader en sammenligning mellem koncentrations-effektkurverne for dødelighed og dysmorfogenese for zebrafiskembryoner udsat for tBOOH og kurverne for embryoner forbehandlet med antioxidanter; statistisk analyse kan udføres for at udforske den beskyttende virkning af den analyserede antioxidantforbindelse.

Formålet med dette arbejde var at evaluere in vivo beskyttende virkninger af fødevareforbindelser med antioxidantaktivitet mod oxidant-induceret udviklingstoksicitet i zebrafiskembryoner.

2. Resultater

2.1. Koncentrationseffektkurver for tBOOH i zebrafiskembryoer

Vores forskergruppe har tidligere udviklet og valideret et ZF-embryooxidativt stressmodel til at evaluere den beskyttende aktivitet afantioxidantstoffer (22).

Zebrafiskembryoner udsættes for tertbutylhydroperoxid (tBOOH) for at opnå dødelighed og dysmorfogenese-kurver. Zebrafiskembryonerne udsættes for tBOOH 24 til 48 timer efter befrugtning (hpf) ved forskellige koncentrationer, der spænder fra 1 til 3,5 mM (figur 1). Den dødelige koncentration 50 (LC50) blev opdaget til at være 2,1 mM, hvorimod den effektive koncentration 50 for dysmorfogenese (EC50) var 1,7 mM. De ovennævnte kurver blev brugt til at sammenligne zebrafiskembryoner, der tidligere var eksponeret eller ej for antioxidantforbindelser, hvorefter de blev udsat for tBOOH.

2.2. Identifikation af de beskyttende virkninger af antioxidantforbindelser i zebrafiskembryoer

Den tidligere beskrevne zebrafiskmodel blev brugt til at evaluere de beskyttende virkninger af seks polyphenoler og tre carotenoider til stede i mad.

Ud af de seks polyfenoler var treflavonoider: naringenin (20 uM), apigenin (10 uM) og rutin (10 uM). De treflavonoiderproduceret en signifikant drift i koncentration-respons-kurverne for dødelighed. Endvidere udviste apigenin og rutin beskyttende virkninger mod dysmorfogenese, hvorimod naringenin ikke udviste nogen beskyttende virkning mod dysmorfogenese (figur 2).

Oleuropein (15 μM), chlorogensyre (20 uM) og curcumin (15 μM) blev også analyseret. Disse polyphenoler resulterede i en signifikant drift i koncentration-respons-kurverne for dødelighed. Kun curcumin udviste en beskyttende virkning mod dysmorfogenese (figur 3).

Derudover blev carotenoiderne lycopen (20 μM), astaxanthin (20 μM) og -caroten (25 μM) evalueret. Lycopen og astaxanthin resulterede i en signifikant drift i koncentration-respons-kurverne for dødelighed. Derimod viste ingen af ​​carotenoiderne en beskyttende virkning mod dysmorfogenese (figur 4). Ydermere resulterede -caroten i en venstredrift i kurverne for dødelighed og dysmorfogenese, hvilket kunne indikere en mulig prooxidant effekt.

3. Diskussion

Ilt er essentielt for menneskers liv; dog producerer det samtidig giftige stoffer, såsom frie radikaler og reaktive oxygenarter (ROS); disse stoffer er oxiderende, ustabile og reaktive. Desuden kan de reagere med ethvert makromolekyle og forårsage celleskade [24]. For at modvirke disse oxiderende stoffer anvender kroppen antioxidantenzymer, såsom superoxiddismutase og glutathionperoxidase, og antioxidantforbindelser afledt af kosten. Derfor har undersøgelsen af ​​forbindelsers antioxidantkapacitet vakt interesse i de sidste par år. Der er flere in vitro-teknikker til bestemmelse af antioxidantaktivitet, selvom de har begrænsninger fra et ernæringsmæssigt synspunkt, fordi ingen gengiver en fysiologisk situation [25]. Af denne grund ville en metode, der inkluderede in vivo-teknikker, føre til mere virkningsfulde resultater, fordi oxidativ stress indebærer mekanismer, der afhænger af mange systemforhold, især de kinetiske dele af reaktioner. Vores team brugte en ZF embryomodel [22], som kunne være en værdifuld in vivo metode, til at teste de beskyttende virkninger af ni antioxidantforbindelser, der er blevet bredt undersøgt in vitro. Vi vurderede seks phenolforbindelser og tre carotenoider. Fenolforbindelser repræsenterer et vigtigt bidrag til den menneskelige kosts antioxiderende potentiale; af disse forbindelser er flavonoider de mest undersøgte og rigelige. Antioxidantaktiviteten af ​​flavonoiderne apigenin, rutin og naringenin blev undersøgt. Disse flavonoider er bioaktive forbindelser, der hovedsageligt findes i forskellige frugter, planter og grøntsager, nødder og løg. In vitro undersøgelser har vist, at disse flavonoider effektivt neutraliserer hydroxylradikaler, superoxid, hydrogenperoxid, nitrogenoxidradikaler, DPPH og lipidperoxidation [26-29]. Chen et al., i 2012 [30] udførte en QSAR-analyse ved hjælp af en zebrafisklarvemodel for at evaluere de ROS-fjernende kapaciteter af femten flavonoider, inklusive rutin, mod UV-induceret fototoksicitet. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser konkluderede de vigtigheden af ​​de to hydroxylgrupper og deres positioner, med mindst to hydroxylgrupper nødvendige for en stærk biologisk aktivitet [30,31]. Endvidere blev det bestemt, at hydroxylgrupper i positionerne C3, C5 og C7 giver bedre flavonstabilitet og aktivitet [31]. Vores resultater viste en beskyttende effekt mod tBOOH-induceret dødelighed for de tre flavonoider. Apigenin og rutin viste også beskyttende virkninger mod dysmorfogenese; dog viste naringenin ingen virkning mod dysmorfogenese.

Ud over flavonoidernes antioxidantvirkninger af oleuropein, chlorogensyre og curcumin blev også evalueret. In vitro og in vivo undersøgelser har vist, at disse

tre phenoliske forbindelser har vigtige antioxidantvirkninger [32-34]. Oleuropein er en biophenol, der findes i olivenblade, ekstra jomfru olivenolie og nogle arter af Oleaceae-familien [32]. Chlorogene syrer (CGA'er) er estere dannet mellem koffeinsyre og kininsyre og repræsenterer en gruppe polyphenoler, der findes i den menneskelige kost [35]. Adskillige undersøgelser har vist, at drikkevarer indeholdende CGA'er såsom kaffe, te, vin og forskellige frugtjuicer reducerer risikoen for at udvikle forskellige kroniske sygdomme [36-38]. En af årsagerne til denne reduktion er antioxidantkapaciteten af ​​CGA'erne, som donerer hydrogenatomer for at reducere frie radikaler og hæmme oxidationsreaktioner [35]. Curcumin er en polyphenol, der bruges til at farve og krydre i fødevarer. Dens antioxidantaktivitet er blevet undersøgt i løbet af de sidste par år, og en undersøgelse tyder på, at den kan beskytte biomembraner mod peroxidative skader [39]. Ved hjælp af ZF-embryomodellen blev det observeret, at forbehandling med oleuropein, chlorogensyre eller curcumin reducerede den dødelighedsinducerende virkning af tBOOH-induceret oxidativt stress; dog blev der kun observeret en signifikant beskyttende effekt mod dysmorfogenese for curcumin.

En anden gruppe med antioxidantegenskaber er carotenoiderne, en allestedsnærværende gruppe af isoprenoidpigmenter. De er quenchere af singlet oxygen og scavengers af ROS [40]. De molekylære mekanismer, der ligger til grund for carotenoidernes anti- og pro-oxidantaktivitet, er stadig ikke fuldt ud forstået. Blandt de mest undersøgte carotenoider er lycopen og -caroten. Disse kan findes rigeligt i tomater, tomatsauce, forskellige frugter, alger og grøntsager [18,41]. Ved evaluering af de beskyttende virkninger af disse carotener blev det fundet, at lycopen udviste antioxidantaktivitet med en beskyttende virkning mod embryonal dødelighed; der blev dog ikke fundet nogen effekt mod dysmorfogenese. På den anden side øgede -caroten forekomsten af ​​dødelighed og dysmorfogenese i ZF-embryonerne sammenlignet med virkningen af ​​oxidanten alene; dette er i overensstemmelse med undersøgelser, der har vist, at høje doser af -caroten har antioxidantvirkninger, der efterfølges af en prooxidantvirkning ved høj iltspænding, hvilket kan være relateret til dets uønskede virkninger [42]. Desuden viste en undersøgelse, at -carotentilskud ikke havde nogen beskyttende effekt på den totale dødelighed af diabetiske mandlige rygere sammenlignet med placebo [43]. Et andet carotenoid vurderet var astaxanthin; det er et xanthophyll-carotenoid, der findes i alger, gær, laks, ørred, krill, rejer og krebs. Det er et rødt, fedtopløseligt antioxidantpigment, der ikke har nogen pro-vitamin A-aktivitet [44]. I vores undersøgelse udviste astaxanthin en beskyttende effekt mod dødelighed, men der blev ikke fundet nogen effekt mod dysmorfogenese.

Som konklusion viste otte af de ni evaluerede molekyler antioxidantaktivitet med beskyttende virkning mod ZF embryonal dødelighed. Kun apigenin (10 µM), rutin (10 µM) og curcumin (15 µM) udviste yderligere beskyttende virkninger mod dysmorfogenese som følge af tBOOH-induceret oxidativ stress. I modsætning hertil blev det fundet, at -caroten producerede den modsatte effekt, hvilket øgede dødeligheden og dysmorfogenesen, fordi det reducerede LC50- og EC50-værdierne. Balancen og timingen af ​​oxidative og antioxidative kræfter er nøglen til den korrekte regulering og timing af embryonal udvikling [45]. Forskelle i kinetikken eller virkningsmekanismen for disse antioxidanter kan være den førende årsag til de forskellige beskyttende kapaciteter mod dysmorfogenese. Flere undersøgelser er nødvendige for at udforske, hvorfor kun nogle forbindelser viste beskyttende virkninger på morfogenese under embryonal udvikling. Denne undersøgelse forsøgte at skelne mellem embryotoksisk effekt (dødelighed) og dysmorfogenese-effekt (teratogenicitet). I nogle tilfælde vil misdannelser sandsynligvis gå forud og resultere i døden. I andre tilfælde kan dødelighed og misdannelser skyldes forskellige årsager. Uafhængigheden af ​​disse to manifestationer ville være mistænkt, hvis en forbindelse øgede adskillelsen mellem letale og dysmorfogenese koncentration-respons-kurver. Alle antioxidantforbindelserne testet i vores undersøgelse øgede ikke den teratogene effekt i forhold til den dødelige dosis mere end to gange; derfor blev der ikke observeret øget teratogent potentiale for nogen antioxidantforbindelse [46].

Alt i alt indikerer disse resultater, at denne ZF embryomodel er et værdifuldt værktøj til at analysere de beskyttende virkninger af de antioxidantmolekyler, der udgør mad. For at bestemme de kemisk-strukturelle årsager til, at apigenin, rutin og curcumin viste de højeste beskyttende virkninger i vores undersøgelse, er yderligere analyser nødvendige; for eksempel at bestemme kvantitative struktur-aktivitet relationer (QSAR'er).

4. Materialer og metoder

4.1. Etisk erklæring

Procedurerne, der involverer zebrafisklarver og embryoner, blev godkendt af den dyreetiske komité ved universitetet i Barcelona, ​​autorisationsnummer eller protokol 7971 fra Department of Husdyr og Fiskeri i Cataloniens regering (ProcedureDAAM 7971).

4.2. Kemikalier og opløsning

Forberedelse Tert-butylhydroperoxid (tBOOH, CAS-nummer: 75-91-2) og antioxidantforbindelserne blev erhvervet fra TCI Europe. tBOOH blev opløst i 0.3X Danieaus buffer (17.4 mM NaCl; 0.23 mM KCl; 0.12 mM MgSO4·7 H2O; 0.18 mM Ca (NO3)2; 1,5 mM HEPES(N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N0 -(2-ethansulfonsyre); pH 7,4).

Naringenin (20 µM) (CAS-nummer: 67604-48-2), oleuropein (15 µM) (CAS-nummer:32619-42-4), rutin (10 µM) (CAS-nummer : 207671-50-9), chlorogensyre (20 µM) (CAS-nummer: 327-97-9), apigenin (10 µM) (CAS-nummer: 520-36-5), curcumin (15 µM) (CAS-nummer: 458-37-7), lycopen (20 µM) (CAS-nummer: 502-65-8), astaxanthin (20 µM) (CAS-nummer: 472-61-7) og -caroten (25 µM) (CAS-nummer: 7235-40-7) blev erhvervet fra Sigmar-Aldrich®. Antioxidanter blev opløst i 100 procent dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma Aldrich, Madrid, Spanien) og efterfølgende fortyndet i 0,3 x Danieaus buffer til en endelig DMSO-koncentration på 0,05 procent (v/v). Antioxidanter blev brugt i forskellige koncentrationer, afhængigt af den højeste koncentration, hvor der ikke blev observeret nogen effekt på dødelighed eller embryonal udvikling (maksimal tolerabel koncentration, MTC)

4.3. Zebrafisk vedligeholdelse og ægproduktion

Voksne vildtype zebrafisk blev opstaldet under standardiserede forhold. Embryonerne blev opsamlet, renset og udvalgt i overensstemmelse med deres levedygtighed. De befrugtede embryoner blev behandlet med vand standardiseret i henhold til International Organization for Standardization (ISO) standarder 7346-1 og 7346-2 (ISO, 1998; 2 mM CaCl2·2H2O, 0,5 mM MgSO4 ·7H2O, 0,75 mM NaHC03 og 0,07 mM KCl). Befrugtede æg blev iscenesat ifølge tidligere undersøgelser af Kimmel et al., 1995 [47] og udvalgt til efterfølgende eksponering under et dissekerende stereomikroskop (Motic SMZ168, Motic China Group, LTD., Luwan, Shanghai, Kina). Fiskeembryonerne blev holdt i glashætteglas ved en kontrolleret temperatur på 27 ± 1 ◦C.

4.4. Udsættelse af zebrafiskembryoer for oxidativ stress (tert-butylhydroperoxid)

Til fremstilling af tBOOH-kurven blev metoden for Boix, 2020 fulgt. Denne metode er baseret på opnåelse af en koncentration-dødelighedsrespons (LC50) kurve og dysmorfogenese (EC50) ved at udsætte ZF-embryonerne for en oxidativ stress-inducer, tertbutylhydroperoxid (tBOOH). Når først zebrafiskembryoner er opnået, opbevares de i 0,3X Danieaus medium fra 0 til 24 hpf. Fra 24 til 48 hpf udsættes embryonerne for tBOOH-opløsninger i forskellige koncentrationer på 1, 1,5, 2, 2,5, 3 og 3,5 mM. Embryoer fra 3 forskellige kløer af zebrafisk i tre eksemplarer blev brugt (figur 5A).

4.5. Bestemmelse af de beskyttende virkninger af antioxidantforbindelser

For at fastslå, om en forbindelse havde en beskyttende effekt mod oxidativt stress, blev zebrafiskembryoner først udsat for antioxidantforbindelsen fra 0 til 24 hpf. Koncentrationerne blev beregnet afhængigt af de maksimalt tolerable koncentrationsassays. Derefter, fra 24 til 48 hpf, blev embryonerne udsat for stressinduceren, tBOOH. Efterfølgende blev hver gruppe af embryoner evalueret ved hver af koncentrationerne af tBOOH (figur 5B). For at bestemme, om der var en signifikant forskel, blev kurven for eksponering for tBOOH alene og kurven for præ-eksponering for antioxidantforbindelsen sammenlignet.

Ti befrugtede æg blev udsat for 2,5 ml for hvert stof og hver koncentration. Tre uafhængige replikationer blev udført ved hjælp af æg fra forskellige gydebegivenheder. ZF-embryonerne blev præ-eksponeret for antioxidantforbindelserne i 24 timer, derefter blev antioxidantopløsningen fjernet, vask blev udført med Danieaus medium, og ZF-embryonerne blev udsat for forskellige tBOOH-koncentrationer. Dødeligheden blev evalueret efter 48 timer, og gennemsnittet af døde embryoner blev beregnet efter de passende assays. Til dysmorfogenese-evalueringen fulgte vi scoringssystemet beskrevet af Teixido et al. [48] ​​for at beregne embryonernes dysmorfogenese ved omkring 48 hpf. Vi udvalgte ni morfologiske træk, beskrevet i tabel 2. Hyppigheden af ​​unormale embryoner blev beregnet (defineret som embryoerne med en score på 1 i ethvert morfologisk træk) for hver koncentration og behandlet gruppe.

Et skift af koncentration-respons-kurven til højre på grund af præ-eksponering for antioxidanterne indikerer en beskyttende effekt mod oxidativ stress-inducer, fordi en højere koncentration af inducer er nødvendig for at opnå de samme resultater som dem med eksponering for tBOOH alene. På grund af præ-eksponeringen for antioxidanter indebærer et skift til venstre for koncentration-respons-kurven en stigning i oxidativt stress.

4.6.Statistisk analyse

Koncentration-respons-kurverne for dødelighed og dysmorfogenese blev beregnet og evalueret ved hjælp af GraphPad 7.02 Software Inc. F-testen for ekstra sum af kvadrater blev brugt til at sammenligne tilpasningen af ​​parametrene for hver datagruppe i kurven. Konfidensintervallet blev justeret til 95 procent.

5. Konklusioner

Denne undersøgelse brugte zebrafiskembryoner som en modelorganisme til at teste den beskyttende kapacitet af seks phenolforbindelser og tre carotenoider, der almindeligvis findes i fødevarer. Alle forbindelserne, undtagen -caroten, viste beskyttende virkninger mod oxidativ-stress-induceret dødelighed. Desuden udviste apigenin, rutin og curcumin også beskyttende virkninger mod tBOOH-induceret dysmorfogenese. Vi foreslår, at en zebrafisk embryotest, som præsenteret her, kan anvendes til at evaluere in vivo beskyttende virkninger af nye bioaktive fødevarekomponenter med potentiel antioxidantkapacitet.

Cristina Arteaga 1,20, Nuria Boix13,Elisabet Teixido 13⑤,Fernanda Marizande 2,Santiago Cadena4 og Alberto Bustillos 5,*

1 Toksikologisk enhed, Afdelingen for Farmakologi, Toksikologi og Terapeutisk Kemi, Farmaciskolen,

University of Barcelona, ​​Avda Joan XXIIs/n,08028Barcelona, ​​Spanien;

2 Fakultet for Sundhedsvidenskab, Ernæring og Diætetik, Ambatos tekniske universitet, Ambato 180207, Ecuador;

3 INSA-UB Ernærings- og fødevaresikkerhedsforskningsinstitut, mad og ernæring Torribera Campus,

Universitetet i Barcelona, ​​Prat de la Riba 171, 08921 Santa Coloma de Gramenet, Spanien

4 Det anvendte fakultet, International SEK University, Quito 170134, Ecuador;

5 Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Medicin, Ambatos tekniske universitet, Ambato 180207

Referencer

1. Tan, BL; Norhaizan, ME; Liew, W.-P.-P. Næringsstoffer og oxidativ stress: ven eller fjende? Oxid. Med. Celle. Longev. 2018, 2018, 9719584. [CrossRef] [PubMed]
2. Sies, H. Biochemistry of Oxidative Stress. Angew. Chemie Int. Ed. Engl. 1986, 25, 1058-1071. [CrossRef]
3. Dröge, W. Frie radikaler i den fysiologiske kontrol af cellefunktion. Physiol. Rev. 2002, 82, 47-95. [CrossRef] [PubMed]
4. Rendra, E.; Riabov, V.; Mossel, DM; Sevastyanova, T.; Harmsen, MC; Kzhyshkowska, J. Reaktive oxygenarter (ROS) i makrofagaktivering og funktion ved diabetes. Immunobiologi 2019, 224, 242-253. [CrossRef]
5. Lin, MT; Beal, MF Mitokondriel dysfunktion og oxidativt stress i neurodegenerative sygdomme. Nature 2006, 443, 787–795. [CrossRef] [PubMed]
6. Therond, P. Oxidativ stress og skader på biomolekyler (lipider, proteiner, DNA). Ann. Pharm. Fr. 2006, 64, 383-389. [CrossRef]
7. Ermak, G.; Davies, KJA Calcium og oxidativt stress: Fra cellesignalering til celledød. Mol. Immunol. 2002, 38, 713-721. [CrossRef]
8. Wadhwa, R.; Gupta, R.; Maurya, PK Oxidativ stress og accelereret aldring i neurodegenerativ og neuropsykiatrisk lidelse. Curr. Pharm. Des. 2018, 24, 4711-4725. [CrossRef]
9. Maritim, AC; Sanders, RA; Watkins, JB Diabetes, oxidativt stress og antioxidanter: En anmeldelse. J. Biochem. Mol. Toxicol. 2003, 17, 24-38. [CrossRef]
10. Sinha, N.; Dabla, PK Oxidativt stress og antioxidanter i hypertension - en aktuel anmeldelse. Curr. Hypertens. Rev. 2015, 11, 132-142. [CrossRef]
11. Klaunig, JE Oxidativ stress og kræft. Curr. Pharm. Des. 2018, 24, 4771-4778. [CrossRef] [PubMed]
12. Sies, H. Oxidativ stress: Et koncept i redoxbiologi og medicin. Redox Biol. 2015, 4, 180-183. [CrossRef]
13. Pietta, P.-G. Flavonoider som antioxidanter. J. Nat. Prod. 2000, 63, 1035-1042. [CrossRef]
14. Halliwell, B.; Gutteridge, JMC Frie radikaler i biologi og medicin, 5. udg.; Oxford University Press: Oxford, Storbritannien, 2015; ISBN 9780198717478.
15. Hollman, PC; Katan, MB Kostflavonoider: indtagelse, sundhedseffekter og biotilgængelighed. Food Chem. Toxicol. Int. J. Publ. Br. Ind. Biol. Res. Assoc. 1999, 37, 937-942. [CrossRef]
16. Hertog, MG; Hollman, PC; Katan, MB; Kromhout, D. Indtagelse af potentielt anticarcinogene flavonoider og deres determinanter hos voksne i Holland. Nutr. Kræft 1993, 20, 21-29. [CrossRef]
17. Martínez, S.; González, J.; Culebras, J.; Tuñón, M. Flavonoides: Propiedades og acciones antioxidantes. Nutr. Hosp. 2002, 17, 271-278.
18. Arteaga, C.; Bustillos, A.; Gómez, J. Migración de neutrófifilos en larver de pez cebra expuestos a extractos de sofrito de tomate. Arch. Latinoam. Nutr. 2021, 70, 216-224. [CrossRef]
19. Young, AJ; Lowe, GL Carotenoider - Antioxidantegenskaber. Antioxidanter 2018, 7, 28. [CrossRef] [PubMed]
20. Xavier, AAO; Pérez-Gálvez, A. Carotenoider som en kilde til antioxidanter i kosten. Undercelle. Biochem. 2016, 79, 359-375. [CrossRef] [PubMed]
21. Stahl, W.; Sies, H. Antioxidantaktivitet af carotenoider. Mol. Asp. Med. 2003, 24, 345-351. [CrossRef]
22. Boix, N.; Teixido, E.; Pique, E.; Llobet, JM; Gomez-Catalan, J. Modulations- og beskyttelsesvirkninger af antioxidantforbindelser mod oxidantinduceret udviklingstoksicitet hos zebrafisk. Antioxidanter 2020, 9, 721. [CrossRef]
23. Fenton, HJH Oxidation af vinsyre i nærvær af jern. J. Chem. Soc. Trans. 1894, 65, 899-910. [CrossRef]
24. Phaniendra, A.; Jestadi, DB; Periyasamy, L. Frie radikaler: egenskaber, kilder, mål og deres implikation i forskellige sygdomme. indiske J. Clin. Biochem. 2015, 30, 11-26. [CrossRef] [PubMed]
25. Fernandez-Pachón, MS; Villaño, D.; Troncoso, AM; García-Parrilla, MC Revision af metoder til evaluering af aktiv antioxidant in vitro del vino og valoración af sus virkninger in vivo. Arch. Latinoam. Nutr. 2006, 56, 110-122. [PubMed] 26. Cavia-Saiz, M.; Busto, MD; Pilar-Izquierdo, MC; Ortega, N.; Perez-Mateos, M.; Muñiz, P. Antioxidantegenskaber, radikalopfangende aktivitet og biomolekylebeskyttelseskapacitet af flavonoid naringenin og dets glycosid naringin: En sammenlignende undersøgelse. J. Sci. Food Agric. 2010, 90, 1238-1244. [CrossRef] [PubMed]
27. Patel, K.; Singh, GK; Patel, DK En gennemgang af farmakologiske og analytiske aspekter af naringenin. Hage. J. Integr. Med. 2014, 24, 551-560. [CrossRef]
28. Rashmi, R.; Magesh, SB; Ramkumar, KM; Suryanarayanan, S.; Subbarao, MV Antioxidantpotentiale af naringenin hjælper med at beskytte levervæv mod streptozotocin-induceret skade. Rep. Biochem. Mol. Biol. 2017, 7, 76-84.
29. Shukla, R.; Pandey, V.; Vadnere, GP; Lodhi, S. Kapitel 18 – Flavonoiders rolle i behandling af inflammatoriske lidelser. I bioaktiv mad som diætinterventioner for arthritis og relaterede inflammatoriske sygdomme; Watson, RR, Preedy, VR, red.; Academic Press: London, Storbritannien, 2019; s. 293-322; ISBN 978-0-12-813820-5.
30. Chen, YH; Yang, ZS; Wen, CC; Chang, YS; Wang, BC; Hsiao, CA; Shih, TL Evaluering af struktur-aktivitetsforholdet mellem flavonoider som antioxidanter og giftstoffer for zebrafisklarver. Food Chem. 2012, 134, 717-724. [CrossRef]
31. Cushman, M.; Zhu, H.; Geahlen, RL; Kraker, AJ Syntese og biokemisk evaluering af en serie af aminoflflavoner som potentielle inhibitorer af protein-tyrosinkinaser p56lck, EGFr og p60v-src. J. Med. Chem. 1994, 37, 3353-3362. [CrossRef]
32. Cioffi, G.; Pesca, MS; De Caprariis, P.; Braca, A.; Severino, L.; De Tommasi, N. Fenolforbindelser i olivenolie og olivenpresserester fra Cilento (Campania, Italien) og deres antioxidantaktivitet. Food Chem. 2010, 121, 105-111. [CrossRef]

33. Bulotta, S.; Corradino, R.; Celano, M.; D'Agostino, M.; Maiuolo, J.; Oliverio, M.; Procopio, A.; Iannone, M.; Rotiroti, D.; Russo, D. Antiproliferative og antioxidante virkninger på brystkræftceller af oleuropein og dets semisyntetiske hyperacetylerede derivater. Food Chem. 2011, 127, 1609-1614. [CrossRef]
34. Han, J.; Talorete, TPN; Yamada, P.; Isoda, H. Anti-proliferative og apoptotiske virkninger af oleuropein og hydroxytyrosol på humane brystkræft MCF-7 celler. Cytoteknologi 2009, 59, 45-53. [CrossRef] [PubMed]
35. Liang, N.; Kitts, DD Chlorogensyrers rolle i at kontrollere oxidative og inflammatoriske stresstilstande. Næringsstoffer 2015, 8, 16. [CrossRef] [PubMed]
36. Park, S.-Y.; Freedman, ND; Haiman, CA; Le Marchand, L.; Wilkens, LR; Setiawan, VW Association of Coffee Consumption med total og årsagsspecifik dødelighed blandt ikke-hvide befolkninger. Ann. Praktikant. Med. 2017, 167, 228-235. [CrossRef] [PubMed]
37. Tajik, N.; Tajik, M.; Mack, I.; Enck, P. De potentielle virkninger af chlorogensyre, de vigtigste phenoliske komponenter i kaffe, på sundhed: En omfattende gennemgang af litteraturen. Eur. J. Nutr. 2017, 56, 2215-2244. [CrossRef] [PubMed]
38. Poole, R.; Kennedy, OJ; Roderick, P.; Fallowfifield, JA; Hayes, PC; Parkes, J. Kaffeforbrug og sundhed: paraplygennemgang af metaanalyser af flere sundhedsresultater. BMJ 2017, 359, j5024. [CrossRef] [PubMed]
39. Tanvir, EM; Hossen, MS; Hossain, MF; Afroz, R.; Gan, SH; Khalil, MI; Karim, N. Antioxidantegenskaber af populære gurkemeje (Curcuma longa) sorter fra Bangladesh. J. Food Qual. 2017, 2017, 8471785. [CrossRef]
40. Fiedor, J.; Burda, K. Potentielle rolle af carotenoider som antioxidanter i menneskers sundhed og sygdom. Næringsstoffer 2014, 6, 466-488. [CrossRef]
41. Eggersdorfer, M.; Wyss, A. Carotenoider i menneskelig ernæring og sundhed. Arch. Biochem. Biofys. 2018, 652, 18-26. [CrossRef]
42. Padmanabhan, P.; Cheema, A.; Paliyath, G. Solanaceous frugter, herunder tomat, aubergine og peberfrugt, 1. udg.; Elsevier Ltd: London, Storbritannien, 2015.
43. Kataja-Tuomola, MK; Kontto, JP; Männistö, S.; Albanes, D.; Virtamo, JR Effekt af alfa-tocopherol og beta-carotentilskud på makrovaskulære komplikationer og total dødelighed fra diabetes: Resultater af ATBC-undersøgelsen. Ann. Med. 2010, 42, 178-186. [CrossRef]
44. Ambati, RR; Moi, PS; Ravi, S.; Aswathanarayana, RG Astaxanthin: Kilder, udvinding, stabilitet, biologiske aktiviteter og dets kommercielle anvendelser - En gennemgang. Mar. Drugs 2014, 12, 128-152. [CrossRef] [PubMed]
45. Dennery, PA Effekter af oxidativ stress på embryonal udvikling. Fødselsdefekter Res. C Embryo Today 2007, 81, 155-162. [CrossRef] [PubMed]
46. ​​Selderslaghs, IWT; Blust, R.; Witters, HE Feasibility-undersøgelse af zebrafiskassayet som en alternativ metode til screening for udviklingstoksicitet og embryotoksicitet ved hjælp af et træningssæt med 27 forbindelser. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 142-154. [CrossRef]
47. Kimmel, CB; Ballard, WW; Kimmel, SR; Ullmann, B.; Schilling, TF Stadier af embryonal udvikling af zebrafisk. Dev. Dyn. 1995, 203, 253-310. [CrossRef] [PubMed]
48. Teixidó, E.; Piqué, E.; Gómez-Catalán, J.; Llobet, JM Vurdering af udviklingsforsinkelse i zebrafisk embryo teratogenicitet assay. Toxicol. In Vitro 2013, 27, 469-478. [CrossRef] [PubMed]